全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2001) 01-0034-05
盐胁迫对星星草幼苗保护酶系统的影响
孙国荣1 , 关 1, 阎秀峰2
( 1.哈尔滨师范大学生物系, 哈尔滨 150080; 2.东北林业大学森林植物生态学开放研究实验室,哈尔滨 150040)
摘要: 在盐胁迫下, 星星草幼苗过氧化氢酶活性随着胁迫时间的延长而增强, 并与盐浓度呈显著正相关。超氧化物
歧化酶活性随着胁迫浓度的增强而增强, 当超过一定浓度( 3. 0% Na2CO 3)时则趋减弱, 尔后随着胁迫时间的延长
而增强。过氧化物酶活性的变化规律与超氧化物歧化酶活性相似,但变化幅度较小。丙二醛含量随着胁迫时间的延
长和胁迫强度的增强而增加。
关键词: 星星草幼苗; 过氧化氢酶活性; 过氧化物酶活性; 超氧化物歧化酶活性 ; 丙二醛含量; 盐胁迫
中图分类号: S 541 文献标识码: A
Effect of Na2CO3 Stress on Defensive Enzyme System of
Puccinellia tenuif lora Seedlings
SU N Guo-rong 1, GUAN Yang1 , YAN Xiu-feng 2
( 1. Depart ment of Biolog y , Harbin No rmal Univ ersit y, Harbin 150080, China;
2. Open Research Labor ator y o f Fo rest P lant Eco lo gy , No rtheast For estry Univ ersity , Harbin 150040, China)
Abstract: Under st ress of Na2CO 3, catalase ( CAT) act ivities of Puccinellia tenuif lora seedlings increase as
the str ess t ime goes on, that has signif icant posit iv e r elat ionship w ith the str ess intensity . Superox ide
dismutase ( SOD) act ivit ies of P. t enuif lora seedl ings increase as the str ess t ime increase and along with the
st ress intensity st reng then to a certain intensity ( 3. 0% Na2CO3 ) w hich decreased. Changes of perox idase
( POD) act iv ities of P . tenuif lora seedling s is same as that of SOD act ivity, How ever the change r ange of
w hich is low er than SOD. MDA contents of P . tenuif lora seedl ings increased along w ith the increase of
st ress t ime and the st ress intensity st reng then.
Key words : Puccinellia tenuif lor a seedlings; Catalase; Per oxidase ; Superox ide dismutase; MDA content ;
Na2CO 3 st ress
在正常情况下, 植物细胞中存在着自由基的产
生和消除过程,只有超氧化物歧化酶( SOD)、过氧化
氢酶( CA T)和过氧化物酶( POD)三者协调一致,才
能使生物自由基维持在一个低水平,从而防止自由
基毒害[ 1]。SOD已经被确认为 O 2-的净化剂,通过消
除 O 2-, 以及降低 O2 -所产生的其它活性氧对细胞起
保护作用。细胞中 H2O 2的积累能降低 CO 2的固定
效率, 尤其是 H2O2 和 O 2-通过 Haber-Weiss 反应会
产生更多的活性氧, 所以及时清除 H2O 2对防止活
性氧十分重要。CAT 主要分布于过氧化酶体中, 可
将高浓度的H 2O 2清除。POD可清除线粒体或胞浆
中产生的低浓度的H 2O 2。保护酶系统对自由基的清
除有着十分重要的意义。许多学者对逆境胁迫下植
物保护酶系统与植物抗逆性的关系进行研究, 但有
关盐胁迫方面的工作较少。龚明等 [ 2]研究结果表明,
盐胁迫强度加大时, 小麦( Wheat )叶片 SOD活性下
降, 膜脂过氧化作用加强, 膜透性加大, 并导致细胞
器甚至整个细胞结构崩溃。星星草 ( Puccinell ia
收稿日期: 2000-03-23; 修回日期: 2000-09-20
作者简介:孙国荣,男, 1964年生, 1989年武汉大学生物系硕士,现为哈尔滨师范大学生物系教授,从事草地植物生理生态学研究工作十余
年,出版专著 2部(松嫩盐碱草地植物生理生态学研究,星星草生理生态学研究) ,发表学术论文 60余篇
第 9 卷 第 1 期
Vo l. 9 No . 1
草 地 学 报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
2001 年 3月
March 2001
tenuif lora)是一种耐盐碱性较强的禾本科牧草, 近
年来经人工种植用于改良碱化草地效果良好,在黑
龙江等地有一定面积的应用[ 3]。本文通过研究
Na2CO 3胁迫对星星草幼苗过氧化氢酶活性、过氧化
物酶活性、超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的影
响,藉以探讨保护酶系统在星星草抗盐碱过程中所
起的生理作用。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
供试星星草种子由黑龙江省肇州县草原实验场
提供。
1. 2 幼苗培养
幼苗培养以建筑用珍珠岩做培养基[ 4]。使用前
将珍珠岩用自来水浸泡冲洗数次后, 用蒸馏水浸泡
冲洗 2次, 烘干后, 置于直径 20cm 的塑料盆, 加注
Hoagland培养液至珍珠岩表面湿润, 将星星草种子
均匀播撒其上, 于人工气候箱培养, 昼/夜温度为
25℃/ 20℃, 光照 65k lux , 相对湿度 75%。待幼苗
长到二叶期以上时进行盐胁迫处理。处理时用漏斗
将所需 Na2CO 3 母液加至珍珠岩底层, 并补充相应
数量的 Hoagland培养液至原湿润程度, 使 Na2CO 3
浓度分别为 0%、0. 5%、1. 0%、2. 0%、3. 0%、
4. 0%。
1. 3 过氧化物酶活性测定
参照陈光仪[ 5]的方法。取 0. 5g 叶片,加入 3mL
62. 5mmol/ L ( pH7. 8)磷酸缓冲液于冰浴上研磨,经
13000r/ min 4℃离心 30m in。上清液即为酶液, 在
4℃冰箱保存备用。在试管中分别加入缓冲液
1. 5mL, 0. 1%愈创木酚 1. 5mL 及 50l酶液,摇匀,
置于 30℃恒温水浴中 5min 达平衡后, 立即加入
0. 08% H2O 2 1mL 摇匀, 同时记下时间, 倒入比色
杯,测定反应时间 1min 后的 O. D. 470值。同步制作
标准曲线,从标准曲线上求出相应的 4-邻甲氧苯酚
的含量( 1mg 4-邻甲氧基苯酚相当于 1单位的愈创
木酚)。酶的活性以 1h 内每 g 鲜重生成的愈创木酚
单位数表示, 即愈创木酚单位数/ g FW min。以
1. 0mL蒸馏水代替 0. 08% H2O 2作对照。
1. 4 过氧化氢酶活性测定
参照Woodstock [ 6]的方法。酶液的提取同上。取
0. 1mL 酶液置于三角瓶中, 加入 5mL 0. 2mol/ L
H 2O 2溶液, 置于 37℃恒温 30min,取出后加入 3mL
10% H2SO 4终止反应。以 0. 01mo l/ L KM nO 4标准
液进行滴定, 至玫瑰红色出现 0. 5m in 不退色为终
点。对照瓶则先加 H2SO 4后加 H2O 2。酶活性用鲜重
材料分解的H 2O 2的 mg 数表示。
X= 0. 17×( A-B)×10/ hW ( mg / h×g. FW)
式中, A 为对照瓶所消耗 KMNO 4毫升数的平
均值; B 为酶作用瓶所消耗 KMNO 4毫升数的平均
值; h 为酶作用时间即保温的时间; W 为所用样品材
料的克数; 10为总的材料与滴定用量之间所相差的
倍数。
1. 5 超氧化物歧化酶活性测定
参照 Giannoplit is[ 7]的方法。取0. 5g 叶片,加入
3mL 62. 5mmol/ L ( pH7. 8)磷酸缓冲液(内含 1%
PVP) 于 冰浴 上研 磨, 经 13000r/ min 4℃离 心
30min。上清液即为酶液,在4℃冰箱保存备用。参照
刘祖棋[ 7]的方法。在试管中依次加入 62. 5mmol/ L
( pH7. 8)磷酸缓冲液 2. 4mL, 0. 06mmol/ L 核黄素
0. 2mL, 30mmol / L 蛋氨酸 0. 2mL, 0. 003mmol/ L
乙二胺四乙酸 0. 1mL, 1. 125mmo l/ L。氮蓝四唑
( NBT) 0. 2mL 和 50l酶液。以不加酶液用磷酸缓
冲液代替的试管为最大光化还原管, 以缓冲液代替
NBT 作空白管。然后将各管置于 4000Lux 下光照
25min进行光化还原。测定反应液的 O. D. 560值。以
抑制 NBT 光化还原 50%作为一个酶活性单位( u) ,
酶活性以 u mg - 1蛋白表示。
U= ( O. D. max- O. D. 5 60) / ( O. D. max / 2)
1. 6 丙二醛( MDA )含量测定
参照林植芳等 [ 8] 的方法。取 0. 25g 鲜叶, 加
pH7. 5的 50mmol/ L 磷酸缓冲液 3mL,于冰浴中研
磨提取。匀浆在冰箱中提取 4h后,于 13000r/ min 冷
冻离心 30m in, 取上清液 1mL 加 3mL 10%三氯乙
酸 ( T CA )含 0. 5%硫代巴比妥( TBA)于 95℃水浴
中保温 30m in 后, 立即置于冰浴中冷却, 经 3000r/
m in离心 10min。上清液于 532nm 测定光密度值。
35第 1期 孙国荣等:盐胁迫对星星草幼苗保护酶系统的影响
2 结果与分析
2. 1 过氧化氢酶( CAT)活性变化
在盐胁迫的第 1d,星星草幼苗 CA T(图 1)随着
Na2CO 3浓度的增加而升高, 浓度在 0%～2. 0%范
围内,二者呈显著正相关( y= 0. 8834x+ 5. 802, r =
0. 9463)。当浓度为 4. 0%时, CAT 活性比对照增加
23. 41%, 当浓度为 3. 0%时,比对照增加 68. 91%。
可见在高盐浓度下 CAT 活性大幅度降低。在胁迫
的第 7d, CAT 活性比第 1d 时升高, 并且随着盐浓
度的增加而升高,二者呈显著正相关( y= 1. 9331x
+ 6. 6305, r= 0. 9433)。在盐胁迫第 1～7d 内, CAT
活性随着时间的延长而升高, 并与盐浓度呈显著正
相关关系。
图 1 盐胁迫对星星草幼苗
过氧化氢酶活性的影响
Fig. 1 Effect o f Na 2CO 3 str ess on CAT
activ ities o f P . tenuif lora seedling s
2. 2 超氧化物歧化酶( SOD)活性及丙二醛(MDA)
含量变化
2. 2. 1 在星星草幼苗 2～3叶期时,在 Na2CO 3胁
迫 1d 后, SOD活性随着盐浓度的增加而明显升高,
浓度在0%～3. 0%范围内, SOD活性与盐浓度呈显
著正相关( y= 58. 49x+ 78. 86, r = 0. 970559) ,当浓
度为 4. 0%时, SOD 活性比对照增加 62. 74%, 比浓
度为 3. 0%时减少了 34. 26%。在胁迫的第 7d, 比第
1d 时有所增加, 但增加幅度不大, SOD活性基本上
仍保持很高水平。浓度在 0～3. 0%范围内, SOD活
性与 Na2CO 3 浓度呈显著正相关 ( y = 88. 47x +
89. 64, r = 0. 995291) ,当浓度为 4. 0%时, SOD 活性
比对照增加 137. 33% , 比浓度 3. 0%时减少了
34. 80%(图 2)。
图 2 盐胁迫对星星草幼苗
超氧化物歧化酶活性的影响
Fig . 2 Effect o f Na 2CO 3 str ess on SOD
act ivities of P . tenuif lora seedlings
2. 2. 2 从图 3可以看出,胁迫 1d后, M DA 含量随
着盐浓度的增加而增加, 并与浓度呈显著正相关( y
= 6. 9328x+ 14. 48, r= 0. 9398)。与SOD活性相比,
M DA 含量在胁迫第 1d 时变化不大,浓度为 4. 0%
时, M DA 含量仅比对照增加 8. 92%, 胁迫第 7d, 比
第 1d时增加幅度较大, 并与盐浓度呈显著正相关( y
= 6. 9328x+ 14. 42, r = 0. 9679)。当浓度为 4. 0%
时, M DA 含量是对照的 3倍,是第 1d 时的 2. 6倍。
MDA 是膜脂过氧化水平的标志,由此可见,盐胁迫
时间短及低盐浓度对膜并未造成伤害, 而随着盐胁
迫时间的延长和盐浓度的升高,星星草幼苗在表面
上虽并未显出伤害, 而实际上已经对膜造成伤害。
图 3 盐胁迫对星星草幼苗丙二醛含量的影响
F ig . 3 Eff ect o f Na2CO3 str ess on MDA
content o f P . tenuif lora seedlings
2. 3 过氧化物酶( POD)活性变化
在 Na2CO 3胁迫下, 星星草幼苗 POD 活性有所
增加(图 4)。在胁迫第 1d, Na2CO3浓度在 0～2. 0%
范围内, POD 活性随着浓度的增加而升高, 二者呈
36 草 地 学 报 第 9卷
显著正相关( y= 28. 64x+ 152. 1, r = 0. 967102)。当
浓度为 2. 0%时, POD活性比对照增加 23. 77% ,而
当浓度为3. 0%和4. 0%时, 分别比对照增加14. 41%
和 18. 58%。在胁迫第 7d, POD活性比第 1d时有所
升高, 但升高幅度不大, 浓度在 0～3. 0%范围内,
POD活性随着浓度增加而升高,呈显著正相关( y=
30. 12x+ 170. 99, r= 0. 967102) ,当浓度为3. 0%时,
POD 活性比对照增加 55. 35% , 而当浓度为 4. 0%
时,比对照增加 33. 24%, 可见在高盐浓度下, POD
活性增加幅度不大。与 Na2CO 3胁迫对星星草幼苗
CAT 和 SOD活性的影响相比, POD 活性的增加不
显著。
图 4 盐胁迫对星星草幼苗过氧化物酶活性的影响
F ig . 4 Effect of Na2CO3 st ress on POD
activ ities o f P . tenuif lora seedling s
3 讨论
近年来, 随着生物膜理论和研究技术的进展,植
物逆境与膜脂过氧化的关系受到广泛重视。膜质过
氧化是指在生物膜的不饱和脂肪酸中,发生一系列
自由基反应, 是由自由基对脂肪中的不饱和脂肪酸
引发而产生的,并由此产生对细胞有毒害的膜质过
氧化作用。很多研究结果表明,膜是产生原初胁迫和
次级胁迫反应的主要部位,盐胁迫影响膜的许多方
面如: 膜离子选择特性、无机及有机物质的运输、膜
的分泌功能、膜脂的成分及膜的超微结构等 [ 9]。在正
常情况下,植物细胞内自由基的产生与消除处于平
衡状态,不易导致膜质过氧化。当植物处于各种逆境
下,自由基的产生与消除就会遭到破坏,而有利于自
由基的产生, 这种积累的自由基将会引发膜脂的过
氧化作用,造成细胞膜系统的伤害。丙二醛( MDA)
是膜脂过氧化的主要产物之一, MDA 又可与细胞
膜上的蛋白质、酶等结合,引起蛋白质分子内和分子
间的交联,从而使之失活,破坏了生物膜的结构与功
能。在有关盐胁迫下, MDA 水平增加的报道很多。
在本文中,星星草幼苗在盐胁迫下虽然 POD、CAT、
SOD等酶活性都有所增加, 但是仍产生一部分过剩
的自由基,从而引发了膜脂过氧化作用,致使膜脂过
氧化的最终产物 MDA 积累。在表面上, 在盐胁迫
下,星星草幼苗仍能正常生长,但株高明显矮于对照
组,而且在 4. 0% Na2CO 3胁迫下的幼苗已稍有萎蔫
现象,结果表明,事实上盐碱胁迫已经对星星草幼苗
产生伤害。阎秀峰[ 10]研究盐胁迫下星星草幼苗膜透
性的变化, 认为膜透性与盐胁迫浓度的变化呈正相
关。这一点与本文的论点相一致。由此可见, 尽管在
盐胁迫下星星草幼苗在外表上未曾出现明显的伤害
症状,但膜对盐胁迫是很敏感的,其受害远远早于形
态上的反应,同时也表明,在盐胁迫下虽然保护酶系
统功能加强, 但其调节能力也是有限的。本实验中
SOD 酶活性在盐胁迫 1d 时, 活性升高迅速, 而
MDA 含量增加幅度较小, 7d 时 MDA 含量增加幅
度较大,而 SOD酶活性只是保持在很高水平, 可见
二者是互相影响的。星星草幼苗超氧化物歧化酶、过
氧化氢酶、过氧化物酶这三种酶的活性,在盐胁迫下
均有不同程度的提高,对清除盐胁迫过程中产生的
自由基,降低盐碱对星星草幼苗的伤害,提高其抗盐
碱能力有着十分重要的意义。因此这可能是星星草
耐盐碱的生理机制之一。
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38 草 地 学 报 第 9卷