全 文 ：武汉植物学研究 2001, 19 (6) : 509～ 512
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
红豆杉细胞周期时相与紫杉醇诱导合成的关系初探Ξ
余龙江ΞΞ　蔡永君　兰文智
(华中科技大学生命科学与技术学院, 武汉　430074)
In troductive Study on Rela tion sh ip Between Taxus ch inens is
Cell D ifferen t Cycle Phases and Taxol El ic ited B iosyn thes is
YU L ong2J iang3 3 , CA I Yong2Jun, LAN W en2Zh i
(Colleg e of L if e S cience and T echnology , H uaz hong U n iversity of S cience
and T echnology , W uhan　430074, Ch ina)
关键词: 细胞周期时相; 同步化处理; 诱导作用; 紫杉醇; 苯丙氨酸解氨酶
Key words: Cell cycle phase; Synch ron ized treatm ent; E licita t ion; T axo l; Phenylalan ine am 2
monia2lyase (PAL )
　　中图分类号: Q 944. 6　文献标识码: A 　文章编号: 10002470X (2001) 0620509204
利用植物细胞培养生产药用次生代谢产物, 普遍存在着次生代谢物产量不稳定的问
题。次生代谢物是一大类无明显生理功能或者非生长发育所必需的小分子有机化合物, 其
生物合成与积累一般发生在植物某些器官和组织发育的某个时期。因此, 植物细胞的生长
发育状态与次生代谢物产量有密切的关系。细胞周期时相在很大程度上反映细胞本身所
处的状态, 对细胞周期时相进行调控可能对次生代谢物产量具有重要影响[1 ]。诱导作用是
提高植物次生代谢物产量的有效方法之一[2, 3 ]。我们以 2 种经典同步化方法, 建立红豆杉
悬浮细胞初始周期时相模型, 对不同初始周期时相的红豆杉细胞进行诱导, 研究不同细胞
周期时相与紫杉醇生物诱导合成的关系, 为细胞培养稳定合成紫杉醇提供理论和实验依
据。
1　材料与方法
1. 1　细胞株及培养条件
取本实验室继代培养、分散性良好、同一来源的红豆杉 (T ax us ch inensis) 悬浮培养细ΞΞΞ 作者简介: 余龙江 (1966- ) , 男, 教授, 博士, 现主要从事生物技术领域的科研和教学工作。通讯作者。收稿日期: 2001203205, 修回日期: 2001205230。基金项目: 2000 年国家骨干教师基金资助项目。
胞, 培养基为本实验室研制的改良B 5 培养基[2 ] , 其中含水解乳蛋白 012 göL、蔗糖30 göL、
2, 42D 011 m göL、62BA 015 m göL、NAA 015 m göL , pH 为 518; 培养过程中, 摇床转速为
120～ 130 röm in, 培养温度为 24℃±1℃, 暗培养。
1. 2　不同细胞周期时相模型的建立
采用 2 种为前人证明有效的同步化方法[4, 5 ]。
1. 2. 1　营养饥饿法 (nu trit ion starvat ion trea tm en t, 简称N S) 　细胞在完全改良B 5 培养
基中生长 26 d, 再继续培养 1 周, 细胞周期滞留于M 期结束到 S 期开始前的 G1 期。然后
转入新鲜的完全培养基中。
1. 2. 2　低温处理法 ( low temperatu re t rea tm en t, 简称L T ) 　将对数期细胞培养物在 4℃
低温处理 72 h, 然后于 25℃ 摇床培养 24 h, 重复低温处理 72 h, 细胞周期阻断在有丝分
裂中期。然后转入新鲜的完全培养基中。
1. 3　红豆杉细胞诱导培养实验
红豆杉细胞采用悬浮培养, 基本培养基为改良B 5 培养基[2 ]附加NNA 015 m göL , 62
BA 015 m göL , 谷氨酰胺 50 m göL , 蔗糖 40 göL , pH 518。分别将营养饥饿处理后处于 G1
期的细胞, 低温处理后处于中期的细胞以及无同步化处理的对照组细胞, 按接种量为
100 göL 的鲜细胞, 接入摇瓶进行培养, 摇床转速为 120 röm in。在细胞培养的第 8 d, 分别
加入 50 m göL 的真菌诱导子 (其来源和制备方法参考文献[ 6 ]) 和 100 Λmo löL 茉莉酸甲
酯进行联合诱导。加入后定时取样, 测定苯丙氨酸解氨酶 (Phenyla lan ine ammon ia2lyase,
PAL )的活性。加入诱导子继续培养后的第 7 d, 收获细胞培养物并测定紫杉醇产量。所有
样品均为 2 组重复样平行测定, 取平均值。
1. 4　PAL 酶液的提取及酶活
酶液的提取及酶活测定参照薛应龙等[7 ]的方法。
1. 5　培养细胞中紫杉醇含量的测定
紫杉醇提取与测定方法按文献[ 2 ]。
2　结果与分析
2. 1　不同初始周期时相与诱导作用对 PAL 活性的影响
以 G1 期作为初始周期时相与以分裂中期作为初始周期时相的细胞的PAL 活性变化
明显不同。图 1 显示前者的 PAL 活性在 1～ 3 d 期间内不断下降并出现波谷。而后者在这
段时间内 PAL 活性出现波峰, 而且在整个培养过程中, PAL 活性基本上比前者高。加入
诱导子以后, 与各自未加诱导子的细胞的 PAL 相比, 初始周期时相为 G1 期的细胞 PAL
活性下降程度得以缓解, 而初始周期时相为中期的细胞PAL 活性上升程度增强。因此, 诱
导作用均使各种不同初始周期时期细胞的 PAL 活性得到提高。
2. 2　不同初始周期时相与诱导作用对紫杉醇合成的影响
由图 2 可见, 就同步化处理而言, 以低温同步化处理后的中期细胞作为初始周期时相
的细胞, 其紫杉醇的含量达到 3315 m göL , 分别为以营养饥饿处理的 G1 期作为初始周期
时相的细胞和无同步化处理的细胞的 415 倍和 2 倍; 以营养饥饿同步化处理后的G1 期细
胞作为初始周期时相的细胞, 所合成紫杉醇含量比没有经过同步化处理的细胞中的含量
还要低。说明选择以初始周期时相为中期的细胞合成紫杉醇的能力比以初始周期时相为
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G1 期的细胞要高。加入诱导子以后, 发现以G1 期或中期为初始周期时相细胞和没有经同
步化处理的细胞一样, 紫杉醇产量都大幅度提高。且其中以选择初始周期时相为中期的细
胞进行诱导, 紫杉醇产量最高, 达到 46 m göL。
3　讨论
L ogem ann 等利用寡肽诱导学研究表明了防御基因的激活与细胞周期相关基因的表
达具有相同的信号传导途径[8 ]。苯丙氨酸解氨酶 (PAL )催化L 2苯丙氨酸直接脱氨产生反
应肉桂酸, 是苯丙烷代谢途径的关键酶和限速酶, 在植物抗病反应中具有重要的作用[7 ]。
我们的结果显示: 以中期为初始周期时相的细胞PAL 活性提高, 而以G1 相为初始周期时
相的细胞 PAL 活性下降, 说明红豆杉悬浮细胞 PAL 基因的激活与细胞所处的周期时相
相关。图 1 还显示, 加入诱导子后, PAL 活性都相应提高, 这表明诱导子对 PAL 基因有激
活作用。紫杉醇产量也随着 PAL 活性上升而相应提高: 以中期为初始周期时相的细胞, 相
对于 G1 期为初始周期时相的细胞而言, PAL 活性较高, 紫杉醇产量也较高。表明紫杉醇
的合成与细胞的周期时相有关。将诱导后 PAL 活性变化与图 2 的紫杉醇产量对比分析,
还发现诱导后 PAL 活性迅速升高, 紫杉醇产量也相应地提高。其中以中期为初始周期时
相的细胞诱导后 PAL 活性最高, 其紫杉醇产量也最高, 暗示 PAL 活性迅速升高, 可作为
与紫杉醇是否被诱导大量合成的生理指标。
经高产细胞株的筛选和培养条件的优化, 红豆杉培养细胞中紫杉醇产量已显著提高,
但遗憾的是紫杉醇产量不稳定, 该问题至今还没有解决[9 ]。同步化可提供细胞周期某一特
定时相的多数细胞, 一般可通过物理或化学方法使细胞群体实现同步化。我们采用营养饥
115　第 6 期　　　　　　　　余龙江等: 红豆杉细胞周期时相与紫杉醇诱导合成的关系初探
饿和低温处理 2 种同步化方法, 分别使细胞处于G1 期或中期。图 2 表明: 以初始周期时相
分别为 G1 期、中期以及未经同步化处理而含有各时相的红豆杉细胞, 其紫杉醇产量相差
明显, 分别为 715、3315 和 17 m g·L - 1。分别加入诱导子进行诱导, 所得到的紫杉醇产量
都大大地提高, 产量差别也很大, 分别为 15、46 和 29 m g·L - 1。说明紫杉醇的合成不仅
与诱导作用有关, 而且与细胞周期时相密切相关。因此, 在植物细胞培养过程中, 进行同步
化处理, 并选择合适的时相加入诱导子对控制紫杉醇产量的稳定性是十分有利的。
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