全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 22(1)：85— 88 2002年 1月
红豆杉细胞培养生产紫杉醇产量稳定性的探讨
余 龙江，蔡永君 ，兰 文智
(华中科技大学生命科学与技术学院．湖北武汉 430074)
摘 要：通过磷酸盐双饥饿和秋水仙碱这两种经典的同步化方法处理悬浮培养的红豆杉细胞， 实现培养
物的均一性，并比较了同步化与非同步化细胞及不同同步化方法处理的细胞紫杉醇产量。结果表明．不同同
步化方法处理的细胞紫杉醇产量有差异 ：秋水仙碱 同步处理处于中期的细胞紫杉醇产量高于非同步化细胞 ．
而磷酸盐双饥饿同步处理处于间期的细胞紫杉醇产量则相反。这表明紫杉醇产量与培养物的均一性有关，且
与细胞同步的周期时相有关 ，采用同步化方法来选择合适的细胞周期时相有利于紫杉醇产量的稳定，通过 比
较不同同步化方法处理对细胞生物量和 POD活性的影响进一步探讨紫杉醇产量产生差异的原因。
关键词 红豆杉细胞 ；紫杉醇 ；同步化处理 ；诱导子
中图分类号 ：Q942．6 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2∞2)01—0085—04
Research Oil the stabil ity of taxol yiel d of
Taxus chinensis suspension cul tures
YU Long—jiang，CAI Yong—jan，LAN Wen—zhi
(School oJ“ Sde r㈣ rld Technology，H~zhor g University oJ Science and了’ecMolog ．Wuban 430074
， Chin^)
Abstract：Two classical synchronization methods，douhle phosphate starvation and colchidnes，were adopted t0
realize homogeneity of Ta：cus chinensis suspension cultures，and the taxol yields of ceils treated with these differ
—
ent methods were compared．The results showed that differeat synchronization mech0ds resu【tcd in d (erent
taxo[yields-After being treated with eolchicine，ceils at metaphase had higher taxol yield than that of asvn
chronous ceils，however，after being treated with double phosphate starvation，cells at GI phase had the con—
trary result-That indicated that taxo[yield had relativity with the homogeneity。f culture cetls，and also had
close relativity with ceil cycle phase．Therefore，to select suitable celt cycle phase by usc 0f svnchronizaci。n
methods】s important for stable taxo[production．In addition the effects of different synchronizatiDn meth0ds 0n
the biomass and PO D activity were investigated tO analyze“1e rea50ns fDr difference Df taxDI vield
Key words：Taxus chinensis cel；taxo[；synchronization treatmeNt；elicitDr
红豆杉细胞培养生产紫杉醇是近几年研究的
热点，但 目前研究中普遍存在紫杉醇产量不稳定性
问题 。诱导作用虽然可以大幅度提高紫杉醇产
量 ’，但我们实验室在长期研究中发现该种方法所
得到紫杉醇高产量也是不稳定的。我们报道过在红
豆杉细胞继代过程中染色体变异，细胞发生多核现
象，但仍具有很好的紫杉醇台成能力 。可见，紫杉
醇产量的不稳定性，不是紫杉醇合成基因的丢失，
收稿 日期：2001 03—22
作者简介：余龙江 (1 966。)，男，湖北黄冈人 ，博士，教授，从事生物拄术领域的科研和教学工作
．
基金项目：：九 ” 家重点科技攻关项目(96。co2。03—01)- A#,- 国家重点项目(102 12—06—01)}200年教育部骨干青年教师基金 资助项目
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胁 广 西 植 物 2g卷
而是与细胞本身所处的生理生化状 态有关，特别与
培养物 的均一性有关 ，因为培养过程中各个植物细
胞参与细胞周期 的进程是不一致 的，本文通过两 种
经典的同步化方法对细胞进行处理，使培养物尽可
能处于同一生理生化状态 ，以探讨 培养物的均一性
与紫杉醇生物合成稳定性 的关系，为红豆杉细胞培
养生产紫杉醇产量稳定性提供新的依据 。
1 材料与方法
1．1供试材料与培养条件
以本实验室继代培养，分散性 良好，同一来源
的红豆杉(?azus ch&ens6)细胞为实验材料。生长培
养基为本实验室配制的 62 培养基，含水解乳蛋白
0．2 g／I ，蔗糖 30 g／I⋯2 4-D 0．1 mg／I 、6-BA 0．5
mg／I 、NAA 0．5 mg／I ，pH 为 5．8；生 产培养基为本
实验室配置 的 YPC培养基 ，含蔗糖 40 g／I 、NAA
0．5 mg／I 、6-BA 0．5 mg／I 。所有 实验均采用 250
mI 三角瓶 ，装液量 1∞ mI ，接种 量 100 g／I ，摇床
转速为 1Z0～1 30 rpm，培养温度为 24±1。c，暗培
养。
1．2真菌诱导子的制备
真菌诱导子的制备参照文献[2]。
1．3悬浮培养红豆杉细胞的同步化处理方法
1．3．1磷酸盐双饥饿 处理 (double phosphate~arva
tion treatment，简祢 Ps) 参照文献1：4J略有改动，
将在YPC培养基中培养至第 8天的细胞转人 YPC
缺磷培养基对细胞进行磷酸盐双饥饿处理，处理完
毕再转人新鲜的 YPC完全培养基
1-3-2秋 水 仙 碱 处 理 (colchicine treatment，简 称
CC) 参照文献E5J略有改动，将在 YPC培养基中
培养至第 8天的细胞转人含秋水仙碱 0．02 的
YPC新鲜培养基中，处理5 h后用不含秋水仙碱的
YPC新鲜培养基将残留的秋水仙碱洗掉(洗 3次)，
再转人新鲜的YPC正常培养基中。秋水仙碱过滤灭
菌后使用。
1．4诱导作用实验
以同步化处理后继续恢复培养 24 h的细胞做
实验组，以在 YPC培养基中培养至第 8天无同步化
处理的细胞作为对照组，将制备好的真菌诱导子按
100 mg／I 与茉莉酸 甲酯 1O0 taM 作为诱导子进行
联合诱导作用实验。
1．5细胞内紫杉醇含量的测定
诱导作用实验后第 8天分别取样，细胞内紫杉
醇含量的测定参照文献[6]。
1．6过氧化物酶(POD)酶液的提取及活性测定
同步化处理后及诱导作用实验后第 24 h分别
取样测酶活，细胞经抽滤后用磷酸缓冲液(o．05 M，
pH5．5)按 1：2(w／v，细胞鲜重／缓冲液体积)提取
POD；冰浴匀浆，8 000 r／min离心 10 min，取上清液
作为粗酶液；酶活测定参照殷俊” 等的方法，以愈创
术酚和 H。O 为底物，以每分钟 △A 变化 0．01为一
个酶活单位(U)。
1．7细胞重量的测定
接种时，细胞鲜重(g／FW)是用布氏漏斗减压
抽滤细胞培养物 ，在无菌条件下称取；将接种时及
诱导作用实验后第 8天收获的鲜细胞分别放置在
60 C烘箱中烘至恒重，为细胞的干重(g)。生物量
(g)一收获细胞的干重 (g)一接种时细胞的干重 ( )
图 1 悬浮培养红豆杉细胞紫杉醇产量的变化
Fig l Changes of taxo1 yield of Ta
chinensl：~suspension cultures
st_为同步化处理{se为同步化后加诱导子1PSC表示磷酸盐
双饥饿同步处理的细胞；ccc表示秋水仙碱同步处理
的细胞 }∞ntr 表示无同步化处理的细胞
s【synchronization treatmentsI：se，elicitor added abet synchro—
nizatlon treatments；PSC，cels treated with double phosphate
．~tarvadon}CCC，cells treated with cNchmine：control，
cells without synchronization t㈣ tme t
．
2 实验结果与讨论
2．1悬浮培养红豆杉细胞紫杉酵产量的变化
由图 1可看出；同步化与非同步化细胞的紫杉
醇产量明显不同，而且不同同步化方法处理得到的
紫杉醇产量亦不同。与非同步化细胞相比，磷酸盐
双饥饿处理的细胞紫杉醇产量较低，而秋水仙碱处
理的细胞紫杉醇产量较高 ；诱导后 ，3种细胞紫杉醇
产量均有增加，但增加幅度不同。磷酸盐双饥饿处
理的细胞紫杉醇产量为 13 mg／I ，是原来 的 1．8倍 {
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1期 余龙江等：红豆杉细胞培养生产紫杉醇产量稳定性的探讨 87
非同步化细胞紫杉醇产量为 1 9 mg／I ，是原来的
2．0倍；而秋水仙碱处理的细胞紫杉醇产量达 28
mg／I ．是原来的 2．2倍。
图 2 悬浮培养红豆杉细胞生物量的变化
Fig．2 Changes of biomass of Taxus
chinensis suspension cultures
st为同步化处理 为同步化后加诱导子 IPSC表示磷酸盐
双饥饿同步处理的细胞；CCC表示戟水仙碱同步处理
的细胞 ；control表示无 同步化处理的细胞 。
st⋯ nch⋯ L atio『1 treatmeats；se，elicitor added after synchro—
n[zation tr@atment~{PSC．cells treated with double phosphate
starvotion{CCC，cells tleRted with colchidne}control，
cells without synchTooization[TeRtment．
图 3 悬浮培养红豆杉细胞 POD活性的变化．
Fig． 3 Changes of POD activity of Ta~US
chinensis suspension cultures．
s L为同步化处理；se为同步化后加诱导子；pSC表示磷酸盐
取饥饿同步处理的细胞；CCC表示秋水仙碱同步处理
的细胞{control痕示无同步化处理的细胞．
s：，synchronlzation trearillerats elicitor added after synchro—
nizat[on[TeN~ments；PSC，cells treated with double phosphate
s L r tion；CCC，cells tre~ted with colch[cine；contro1．
cells without synchroniza~tion t~atment．
这首先表明细胞紫杉醇产量与培养物均一性
有关，且与同步处理后细胞同步的周期时相密切相
关。磷酸盐饥饿处理使细胞处于静止期，转入新鲜
的完全培养基后细胞可同步化地进入 G1期“ ，而
秋水仙碱为纺锤体阻抑物，可将细胞阻止在有丝分
裂中期 所以这两种同步化方法处理的细胞转入
新鲜培养基后，培养细胞所处的周期时相不同，即
细胞所处的均一性状态不同。而无同步化处理的细
胞培养物中处于各时相的细胞是随机变化的， 紫
杉醇产量亦随之发生变化，从而可能导致紫杉醇产
量的不稳定性。其次，诱导作用后紫杉醇产量都明
显升高 ，表明同步化处理与诱导子协同作用能进一
步提高紫杉醇含量。因此，采用同步化方法处理细
胞 选择合适的细胞周期时相对诱导紫杉醇稳定
合成具有重要意义。
2．2悬浮培养红豆杉细胞生物量的变化
图 2显示同步化处理后，在诱导前，细胞生物量
均低于对照，磷酸盐饥饿处理的细胞生物量最低，
分别为秋水仙碱处理的细胞和对照组生物量的 3／4
和 l／2；而诱导后，包括对照组，其细胞生物量进一
步降低，但与诱导前大小趋势相同。说明同步化处
理及诱导作用都对细胞具有损害作用，且磷酸盐双
饥饿处理对细胞的损害程度大于秋水仙碱处理。
2．3是浮培养红豆杉细胞 POD活性的变化
图 3显示了不同同步化处理的细胞其 POD活
性是不 同的 其 中磷酸盐双饥饿处理的细胞 P0D活
性大于秋水仙碱处理的细胞；加人诱导子后 POD活
性都有所上升，而且 POD活性大小趋势与诱导前相
同
植物中PO D参与多种生理生化过程，是植物抗
氧化系统中一种重要的酶，参与对病原的防御及对
胁迫的反应等 ，因此可作为植物细胞响应外界不
良环境的一个指标。I ogemann 等研究发现防御基
因的激活与细胞周期相关基因的表达具有相同的
信号传导途径。由图 3可看出不同同步化方法处理
处于不同细胞周期时相的细胞，其 POD活性亦不
同，这表明POD基因的激活可能与细胞所处的周期
时相相关。而且由图 2、3可看出，POD活性高则细
胞生物量低。POD活性升高与细胞质膜过氧化有
关，而质膜过氧化对细胞有损害，从而导致细胞生
物量下降。磷酸盐饥饿处理引起 POD活性升高过
度，导致生物量明显下降，从而影响紫杉醇产量。
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