全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(5)：521—526
Journal of Wuhan Botanical Research
Pb2+胁迫对绿球藻(Chlorococcum sp．)的影响研究
邱昌恩 r，胡征宇h
(1．中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室，武汉 430072；
2．湖北师范学院生化分析技术湖北省重点实验室，湖北黄石 435002)
摘 要：研究了不同 Pb“浓度(0．1、1、10、50、100、200、400 mg／L)处理对绿球藻(Chlorococcum sp．)生长、形态结构
及生理特性的影响。与对照BG11培养的绿球藻比较，Pb“浓度≤5O mg／L条件下培养的绿球藻细胞壁无明显增
厚 ，色素变化不大；而暴露到 Pb“浓度 >50 mg／L条件下培养，绿球藻细胞壁明显增厚，蛋白核消失。低浓度 Pb“
(0．1—10 mg／L)对绿球藻生长基本没有影响；浓度在50 mg／L时，绿球藻仍能维持一定的生长速率 ；但当Pb“浓度
≥100 mg／L时，绿球藻的生长受到显著抑制。绿球藻的Chl a+Chl b以及 Chl a含量均随培养基中Pb“浓度的升
高而逐渐减少。绿球藻净光合作用强度随培养基中Pb“浓度的增大而逐渐降低，Pb“浓度≥100 mg／L时净光合
作用强度检测不到；当pb2 浓度<50 mg／L时，绿球藻呼吸作用强度逐渐升高，之后呼吸作用强度逐渐降低。在实
验的浓度下，绿球藻的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性都随培养基中Pb“浓
度的升高而逐渐增强；过氧化氢酶(CAT)则随Pb“浓度的增大酶活性先升高后降低。当Pb“浓度≤100 mg／L时，
绿球藻对 Pb“的去除率都在95％以上；之后逐渐降低，浓度到400 mg／L时仍然达56．7％。结果显示，绿球藻是一
种耐受 Pb 胁迫的藻类，对铅的去除率也高，可以应用于含铅污水的处理。
关键词 ：绿球藻；Pb“ ；生长；生理特性；细胞结构
中图分类号：X173 文献标识码：A 文章编号：1000-470X(2007)05·0521·06
The Efects of Pb Stress on Chlorococcum sp．
QIu Chang．En ．HU Zheng—Yu ’
(1．The State Key Laboratory ofFreshwater Ecology and Biotechnology ，Institute ofHydrobiology，The Chinese Academy ofSc／encez，Wuhan
430072，China；2．Hubei Key Laboratory ofBioanalytical Technique，Hubei Normal University，Huangshi，Hubei 435002，China)
Abstract：The efects of diferent concentration Pb“(0．1，1，10，50，100，200，400 mg／L)in BG1 1 on
the growth，morphostructure and physiological characteristics of Chlorococcum sp．were studied．Compared
with the cel cultured in BGl1．the cel cuhured in low concentrations(≤5O mg／L)showed few changes
in pigment and thickness of cell wal：the cel wal of the cell cuhured in high concentrations of Pb“
(>50 mg／L)became thicker，and the pigment decreased and the pyrenoid disappeared．When the
concentrations of Pbn were 0．1—10 mr
_／L．the growth of Chlorococcum sp．showed no obvious diference
compared with the control：when the concentration of Pb“ was 50 mg／L，Chlorococcum sp．could maintain
certain growth rate yet；however，when the concentration of Pb“was higher than 100 mg／L，the growth of
Chlorococcum sp．was inhibited markedly．The conten~ of Chl a+Chl b or Chl a decreased gradualy with
the increase of the concenrations of Pb“ in the medium．The photosynthesis of Chlorococcum sp．
decreased gradually with the increase of Pb concentrations．when the concentration of Pb was higher
than 100 ms,／L．the photosynthesis of Chlorococcum sp．could not be detected；when the concentration
of Pb¨ was less than 50 m L
，
the respiration of Chlorococcum sp．increased gradualy with the increase
of Pb concentrations．and when the concentration of Pb¨ was higher than 50 mg／L，they decreased
gradualv with the increase of Pbn concentrations．Th e content of malondiadehyde and activities of
superoxide dismutase and peroxidase increased gradualy with the increase of Pb concentrations．
and the activity of catalase increased at beginning and then decreased with the increase of Pb
concentrations．When the concentration of Pb was≤ 100 mg／L．the removal rate of Chlorococcum sp．
on Pb was >95％ ．and it was up 56．7％ yet when the concentration of Pb“ was 400 mg／L．The
收稿日期：2007．03．12，修回日期：2007·05·22。
基金项目：863计划(2002AA601021)；湖北省教育厅重点项目(D200522005)；黄石市科技攻关重点项目资助。
作者简介：邱昌恩(1966一)，男，汉族，湖北鄂州市人，博士，湖北师范学院副教授 ，主要从事植物生理生化及环境生物学研究。
通讯作者(E．mail：huzy@ihb．ae．an)。
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522 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
results demonstrated that the Chlorococcum sp．could be apphed to the treatment of wastewater containing
Pb¨
． because the Chlorococcum sp．could endure the stress of Pb and was of high removal rate on
Pb¨
．
Key words：Chlorococcum sp．；Pb“ ；Growth ；Physiological characteristic；Cell structure
重金属对水环境造成的污染已经引起人们的日
益关注，研究表明，包括铅(Pb)在内的重金属对水
生生物有不利影响 ．2 J。藻类是水体中的初级生产
者，在水生态系统中起着十分重要的作用。重金属
通过各种途径进人水体后，首当其冲的受害者是藻
类生物，并将通过食物链进而危害人类。反过来，利
用从污染严重的水体或污水中筛选出耐受重金属并
可去除重金属的藻类，并利用藻类生物技术来治理
含重金属污水、净化被重金属污染的水域成为一种
值得探索的方法。目前，国内外文献主要报道利用
藻类吸附法处理去除铅等重金属 ，而且主要研
究 pH、温度、离子强度等外界条件对藻吸附重金属
的影响；也有铅等重金属或重金属污染对藻生长、生
理、吸收、积累的基础研究 H J。笔者从美国亚里
桑那州一家污水处理厂的污水中分离纯化了一种绿
球藻，从绿球藻对铅胁迫的响应及耐胁迫的生理机
制等方面的研究 ，看其是否能作为一种耐污和去污
的微藻，使人们能进一步运用氧化塘法、生物膜法、
生物反应器，特别是运用固定化技术等藻类生物技
术来处理含铅等重金属污水，以及治理被铅等重金
属污染的水域。
1 材料与方法
1．1 试验藻种
绿球藻(Chlorococcum sp．)采 自美国亚里桑那
州一家污水处理厂，应用微型藻类分离纯化的方法，
用 BG1 1琼脂培养基分离纯化后保种培养。在无菌
条件下，将琼脂培养基上的单个藻落转接到 BGll
液体培养基中，置 LRH-250一G光照培养箱中培养，
培养温度(25±1)℃，光照强度 35—40 i~mol·m～·
s～
，在获得足够生物量后用于试验。
1．2 试验仪器
Perkin Elmer Analyst 800原子吸收仪(Perkin
Elmer，USA)、Leica DM5000B研究显微镜 (Leiea，
Germany)、氧电极(Rank Brothers，England)、紫外可
见分光光度计(UV一1601，Shimadzu，Germany)等。
1．3 Pb 浓度设置与培养条件
以 BG11为基本培养基，灭菌的 100 mg／L和
2000 mg／L Pb [用分析纯 Pb(NO，) 配制]为母
液，配制成 0．1、1、1O、50、100、200、400 mg／L 7个
Pb 处理浓度，以 BG11作为对照。每个浓度组 3
个重复，均用250 mL锥形瓶盛装培养液，配后体积
为 150 mL。
取适量液体藻种 4000 r／min离心 10 min，用
15 mg／L NaHCO，悬浮洗涤 2次(洗去藻体上附着
的培养基)，然后对每个实验组进行等量接种后，置
于上述光照培养箱中培养。培养温度(25±1)℃，
光照强度35—40 I~mol·m一·s～，光暗时间比为 14：
1O，光照期间每天定时摇动藻液4次。
1．4 生长测定和比增长率(IL)计算
10 d内，每隔48 h，用 Shimadzu UV一1601分光
光度计，在 660 nln波长处测一次藻液 的吸光值
(OD)。用细胞个数与光密度之间的线性回归方程
计算 细胞 密度。回归 方程为 C=0．02776+
16．76748X(R =0．998)，式中 C代表细胞密度，
代表 OD值。以公式 =(1ogⅣ一lo o)／￡计算比生
长率，式中Ⅳn，Ⅳ表示培养物生长计时起始和结束
时的藻类生物量即光密度，t为结束 与起始时间
差(d)。
1．5 叶绿素含量测定
培养第6 d，每个处理取藻液5 mL，4000 r／min
离心 10 min，上清液用作 Pb 含量测定用，藻体用
80％丙酮提取2次，每次24 h。采用文献[15]的方
法测叶绿素含量。每组 3个重复。
1．6 Pb 含量测定
培养第 6 d，每个处 理组取 5 mL藻 液，在
4000 r／min离心 10 min，取上清液进行 Pb 含量测
定，3个重复。用起始 Pb 含量减去培养后的 Pb
含量，计算每个处理绿球藻对 Pb 的去除率。
1．7 光合作用强度和呼吸作用强度测定
培养第 8 d，每个处理取 2 mL藻液，用氧电极
法I1 测量各处理的光合作用和呼吸作用强度，每组
处理做3个重复样。
1．8 丙二醛 (MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)、
过氧化物酶 (POD)、过氧化氢酶 (CAT)的提取和
测定
培养 10 d后 ，将培养液用 0．45 m微孔滤膜进
行抽滤，得藻体，用分析 天平 称取鲜重，采用 文
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第 5期 邱昌恩等：Pb 胁迫对绿球藻(Chlorococcum sp．)的影响研究 523
献[12]中的SOD酶提取方法配制提取液，用液氮法
研磨提取，在 12000 r／min离心 15 min后 ，用酶提取
液将每个处理粗酶提取液定容至 25 mL，此为 SOD、
POD和 CAT的粗酶液，用来测定 MDA含量及 SOD、
POD、CAT活性。MDA含量以及 SOD活性参照文
献[15]中的方法测定。POD、CAT活性参 照文
献[16]中的方法测定。以 NBT的光化还原刚好被
SOD抑制 50％时加人的酶量为 1个 SOD酶单位。
POD酶活性以每分钟内A盯。变化 0．01为 1个酶活
力单位(U)，CAT酶活性用每分钟内分解 H O 1 mg
为 1个酶活力单位(u)。每个浓度处理 3个重复。
1．9 显微结构观察
培养 10 d后，每个处理制成玻片，用 DM5000B
显微镜在 40×物镜下观察拍照。
1．10 统计分析方法
用生物统计的单因子方差分析(ANOVA)，以及
平均数 LSD多重比较检验本研究指标间的差异。
2 结果
2．1 Pb“对绿球藻生长的影响
当 Pb“浓度 ≤10 mg／L时，绿球藻生长与对照
BG11培养基相近，最大比生长速率均出现在第6 d，
其中10 mg／L时最大比生长率在第2 d(见图1)，说
明低浓度 Pb¨ 对绿球藻生长基本没多大影响；在
50 mg／L浓度时与对照 BG11相比尽管 Pbn对绿球
藻的生长有一定的抑制作用，但绿球藻仍能维持一
定的生长，最大比生长速率在第 8 d，说明绿球藻能
耐受此浓度；100、200、400 mg／L Pb¨ 浓度下培养，
开始4 d有一定生长，之后出现负生长，Pb¨ 对绿球
Culture tm c 1．d J
图 1 Pb 对绿球藻生长的影响
Fig．1 The efect of Pb on the growth of
Ch／orococcum sp．
藻生长具明显抑制作用(ANOVA，P<0．05)(见
图 1)。
2．2 Pb 对绿球藻叶绿素含量的影响
随培养基 中 Pb¨ 浓度增加，绿球藻 Chl a+
Chl b含量以及 Chl a含量逐渐降低(见表 1)，说明
Pb 可能抑制了绿球藻叶绿素合成，且可能导致叶
绿素分解破坏。各浓度组 Chl a+Chl b含量以及
Chl a含量与对照有显著性差异(P<0．05)。
2．3 Pb 对绿球藻光合作用和呼吸作用的影响
绿球藻净光合作用强度随培养基中Pb 浓度
的增大而逐渐降低，但在低浓度(0．1 mg／L)时有微
弱增高，当Pb 浓度≥100 mg／L时净光合作用强度
检测不到；当 Pb¨ 浓度小于 50 mg／L时，绿球藻呼
吸作用强度逐渐升高，之后呼吸作用强度逐渐降低。
处理组净光和强度和呼吸强度与对照有显著差异和
极显著差异(P<0．05，P<0．01)，结果见表 2。
表 1 Pb 对绿球藻叶绿素含量的影响(培养6天)
Table 1 The efects of Pb¨ on the chlorophyll contents in Chlorococctort sp
． (Cultivating period 6 days)
表 2 Pb ’对绿球藻光合作用和呼吸作用的影响(培养 8天)
Table 2 The efects of Pb¨ on photosynthesis and respiration in Ch／orococcum sp．(Cultivating period 8 days)
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524 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
2．4 Pb“对绿球藻丙二醛(MDA)含量的影响
绿球藻体内丙二醛含量随培养基中 Pb 含量
的增大而逐渐增大，低浓度时增大不是很显著(见
图2)，各浓度组丙二醛含量与对照有极显著性差异
(P<0．01)。丙二醛产生是细胞发生过氧化的一个
指标，结果表明低浓度的 Pb 对绿球藻伤害不明
显，这与前面结果相吻合，即低浓度 Pb (0．1、1、
10 mg／L)培养下绿球藻生长与对照 BG1 1培养基相
近，但随 Pb“浓度的增大，Pb¨ 胁迫造成的氧化伤
害也越来越大。
《
亳篆
．-
薹呈
Pb”concentration(mg／L)
图 2 Pb 对绿球藻丙二醛含量的影响
Fig．2 Efects of Pb on malondiadehyde content
in Chlorococcum p．
2．5 Pb 对绿球藻超氧化物歧化酶(SOD)活性的
影响
绿球藻超氧化物歧化酶(SOD)活性随培养基中
Pb 含量的增大而逐渐增大，说明Pb 胁迫导致绿
球藻体内抗氧化保护酶 SOD活性的提高。各处理
组 SOD活性与对照有极显著性差异(P<0．01)，结
果见图 3。
≥
一
芑
日
0
0
Pb concen~afion(mg／L)
图 3 Pb 对绿球藻超氧化物歧化酶活性的影响
Fig．3 Efects of Pb on superoxide dismutase activity
in Chlorococcum sp．
2．6 Pb 对绿球藻过氧化物酶(POD)活性的影响
绿球藻过氧化物酶(POD)活性随培养基中
Pb 含量的增大而逐渐增大，说明 Pbn胁迫导致了
绿球藻体 内抗氧化保护酶 POD活性 的提高 (见
图4)。各处理组 POD活性与对照有极显著性差异
(P<0．O1)。
三25
E
；20
15
10
：兰
暮 5
0
金0 0 100 200 300 400 500
Pb concentration(mg／L)
图 4 Pb 对绿球藻过氧化物酶活性的影响
Fig．4 Ef ects ofPb on peroxidase activity
in Chlorococcum sp．
2．7 Pb“对绿球藻过氧化氢酶(CAT)活性的影响
绿球藻过氧化氢酶(CAT)活性在 10 mg／L以下
随培养基中Pb¨ 浓度的增高而逐渐增大，浓度大于
10 mg／L时随 Pb“浓度的增高 CAT活性逐渐降低。
各处理组 CAT活性 与对照有显 著性差异 (P<
0．05)，结果见图5。
16
— 14
12
鲁10
龟：
皇 4
u 2
0
Pb“concentration fmg／L)
图 5 Pb 对绿球藻过氧化氢酶活性的影响
F；g．5 Ef ects of Pb on catalase activity
in Chlorococcum sp．
2．8 Pb 对绿球藻显微结构的影响
在正常 BG11培养基培养条件下，绿球藻的显
微结构具明显细胞壁，壁较厚，色素深，具一个蛋白
核(见图6：A)。在0．1、1、10、50 mg／L Pb“浓度下，
与对照相比细胞壁不见明显增厚，色素没多大变化，
但蛋白核 由一个变为多个 (图 6：B—E)；100—
400 mg／L Pb 浓度条件下，细胞壁明显增厚，色素
含量减少，蛋白核消失(图6：F—H)。
2．9 绿球藻对 Pb“的去除
不同 Pb 浓度条件下培养 6 d后，测定绿球藻
对 Pb 的去除情况，结果见图7。绿球藻对 Pbn的
去除率非常高，当Pb 浓度≤100 mg／L时，去除率
都在95％以上；之后逐渐降低，到400 mg／L时仍然
达56．7％。各处理组去除率与对照有极显著性差
异(P
因可能是由于在培养过程中 Pb 易于从溶液中沉
淀所致，对实验结果产生影响。
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526 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
致发生过氧化作用而得到保护。因此，Pb ’胁迫诱
导绿球藻体内SOD、CAT、POD抗氧化酶活性升高是
绿球藻耐受 Pb 的一个重要生理原因。绿球藻 Chl
a+Chl b以及Chl a含量降低，说明 Pb ’可能使叶
绿素分解破坏或抑制叶绿素合成，这是导致绿球藻
光合作用降低的一个原因。呼吸作用先增后降，说
明Pb¨ 在低浓度胁迫时使呼吸加强，随着胁迫加大
导致的伤害加大，因而高浓度 Pb 逆境时呼吸强度
降低。这些是 Pb“胁迫造成绿球藻产生的一些生
理性适应。绿球藻形成非常厚的细胞壁是对 Pb“
胁迫产生的结构上的适应。由于壁上的多糖和蛋白
质分子中的一NH2，一OH，一COOH，一NH，一SH等基团与
Pb 结合，结果 Pb ’过多的被吸附在细胞壁上 圳，
而转运到藻体内的量相对减少，从而提高了绿球藻
对高浓度Pb“胁迫的适应。同时绿球藻形成多个
蛋白核以储存能量，能提供因呼吸作用增强而导致
的能量消耗。这两点是绿球藻能耐受 Pb“胁迫的
另两个结构上的原因。Pb¨ 胁迫可诱导一些藻产生
硫醇肽来增强对胁迫的抗性，从而降低 Pb 的毒
性 -27]。因而Pb 胁迫也有可能诱导绿球藻产生
这种硫醇肽或产生其它抗性胁迫蛋白如金属硫蛋
白 。 或产生胞内胞外金属配体 来增强对 Pb 的
抗性，这还有待进一步研究。因此，Pbn胁迫下绿球
藻在结构上和生理上会产生一些相应的适应，细胞
壁的增厚和蛋白核的形成以及抗氧化酶活性的提高
都可以增强绿球藻抵抗 Pb¨ 胁迫的能力。
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