全 文 ：武汉植物学研究 2005，23(1)：77~80
Journal of Wuhan Botanlcal Research
AFLP用于构建罗汉果DNA指纹图谱及其幼苗雌雄鉴别
陶 莉，王跃进，尤 敏，王有为
(中国科学院武汉植物园，武汉 430074)
摘 要 ：对罗汉果 (Siraitia grosvenorii(Swingle)C．Jefrey ex Lu et Z．Y．Zhang)的几个品种进行 AFLP标记分
析，从中筛选出2个引物组合，其中一个能够用于构建不同品种的指纹图谱，另一个可以结合数量性状分析成功地
鉴别罗汉果幼苗的雌雄。建立了一种可用于罗汉果幼苗雌雄鉴别的方法 ，并可为品种的鉴别提供依据。
关键词 ：罗汉果；DNA指纹图谱 ；雌雄鉴别
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000．470X(2005)01—0077—04
Construction of AFLP Fingerprints and Seedling Sex Discrimination
of Siraitia grosvenori(Swingle)
TAO Li，WANG Yue—Jin，Y0U Min，W ANG You—Wei’
(Wuhan Botanical Garden，The Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430074，China)
Abstract：AFLP technique was firstly used to analyse three varieties of Siraitia grosvenori
(Swingle)C．Jeffrey ex Lu et Z．Y．Zhang．In the experiment，two primer combinations were se—
lected；one of the primer pairs was screened for generating fingerprints，and the other were
screened for seedling sex discrimination combine with quantitative characters．A gist for variety
was offered and a method for discriminating the seedling sex was set up．
Key words：Siraitia grosvenori(Swingle)C．Jeffrey ex Lu et Z．Y．Zhang；DNA fingerprint；Sex
discrimination
随着分子生物学的迅速发展，DNA分子标记的
研究与应用 已经逐渐渗透到生物学的各个领域。
RFLP、RAPD、AFLP这些分子标记新方法 目前应
用十分广泛。诸如遗传连锁图谱构建、DNA指纹分
析、基因定位以及作物育种等方面研究都大量运用
了这些方法[1]。另外，应用分子标记技术进行中药
材指纹图谱的研究也有报道[4]。
自 1980年 Bostein首次提出用于建立遗传连
锁图谱设想以来，Donis—Keler等建立了第一张人
的 RFLP图谱 。随后又建立了水稻、木棉、马铃薯等
植物的 RFLP图谱。由于 RFLP只适于单拷贝，而
AFLP适于整个基因组，故虽然产生时间并不长，却
得到了广泛的应用。AFLP较其它的 DNA指纹技
术，具有检测的多态性多，对模板浓度不敏感 ，扩增
结果稳定，不需要了解序列信息的优点[5 ]。目前该
技术 已广泛用于拟南芥 、水稻嘲、大麦 、马铃
薯L1叼等植物的高密度遗传图谱的构建，是 目前应用
比较广泛的一种DNA指纹技术。
罗汉果是我国特有著名中药材。由于长期使用
压蔓繁殖技术，造成种质退化、品种混杂、产量降低，
不仅严重阻碍了罗汉果种质资源的合理利用，也影
响罗汉果的品种改良与育种。目前采用组培苗已经
成为罗汉果品种提纯复壮、改善品质的重要途径。而
罗汉果为雌雄异株植物，组培苗幼苗时期雌雄难辨
收稿日期 ：2004—03—25。修回日期；2004—06—30。
基金项目：中国科学院武汉植物园“知识创新工程”所长基金(02005113)资助。
作者简介：陶莉(1980一)，女，硕士研究生，主要从事药用植物研究。
· 通讯作者(E—mail：wyw@rose．whiob．ae．cn)。
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78 武 汉 植 物 学 研 究 第 23卷
给育种带来了一定的困难。本研究采用 AFLP标记
技术对几个罗汉果品种进行 DNA指纹分析，从分
子水平上对罗汉果品种进行鉴定，并结合数量性状
分析对罗汉果幼苗进行雌雄鉴别，建立一种新的用
于罗汉果幼苗雌雄鉴别的方法。
1 研究方法
1．1 材料
供试罗汉果(Siraitia grosvenori(Swingle)C．
Jeffrey ex Lu et Z．Y．Zhang)品种为青皮果 (雌、
雄)、长滩果(雌、雄)、冬瓜果(雌、雄)3个品种的组
培苗。青皮果、长滩果、冬瓜果均为罗汉果原有栽培
品种。该材料为在桂林原产地挑选形态和结果具典
型特征的栽培品种进行组织培养所得幼苗。
1．2 基因组 DNA制备
取0．2～o．5 g新鲜叶片，加液氮研磨成粉，加
1 mL 65℃预热的 2 XCTAB[-CTAB 2 ，Tris—HCI
(pH8．0) 1 mol／L，EDTA 20 mmol／L。NaCl
1．4 mol／L，1 PVP，使用前加5‰的2一巯基乙醇]
提取液，然后将其转移到1．5 mL离心管中，混匀，
65℃保温0．5～1 h，每隔 10 min振摇 1次。离 心
10 min，10 000 r／min，转移上清至另一离心管中，加
入苯酚。氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提，轻轻颠倒混
匀，离 5-5 min，12 000 r／min，吸取上清加入等体积
的氯 仿 ：异戊 醇 (24：1)抽提，混 匀，离 心5 min，
12 000 r／min。取 上 清，加 入 RNase酶 37℃消 化
1．5 h。再加氯仿 ：异戊醇 (24：1)抽提 1次，离心
10 min，12 000 r／min。取上清，加一20"C预冷无水乙
醇，在 -20℃ 下 放 置 0．5 h。 离 心 5 min，
12 000 r／min。弃去上清，加 75 乙醇洗1 h，离心
5 min，12 000 r／min，小心去上清，最后加TE溶液溶
解 ，放置在一2O℃待用。
1．3 DNA琼脂糖凝胶电泳及 DNA浓度和纯度的
测定
取样品DNA 4 L与上样缓冲液 3 L混匀，上
样于 0．8 琼脂糖凝胶上，用 1×TBE电泳缓冲液 ，
100 V 电泳 35 min。EB(溴化锭)染色后，在紫外灯
下观察结果；取样品 DNA 2 L，用 TE稀释 5O倍，
在紫外分光光度计下测定 A。 。／A。。以判断 DNA的
纯度，取少量 DNA稀释至 50 ng／~L备用。
1．4 基因组 DNA的 EcoR I／Trull双酶切
反应体系 2O L中含有 5 L(反应缓冲液)模
板 DNA，EcoR I／Trul 3 L，37℃反应 2 h后 ，65℃
反应 3 h，置于 4℃待用。
1．5 EcoR I／Trull基因组 DNA片段与人工接头的
连接
在上述 EcoR I／Trull酶切后产物中，加入人工
接头溶液(E∞R I／Tru儿人工接头，1O×bufer)，T
DNA连接酶 2 L。室温轻轻混匀，于 20"C反应 2 h，
并取连接反应产物 1O L用 TE稀释 1O倍，混匀，
作为 AFLP预扩增反应的模板，余下的连接产物于
一 2O℃保存。
1．6 AFLP预扩增反应
反应体系2o L含上述稀释模板 5 L，预扩增
引物混合物(含 dNTPs)17．9 L，1O×buffer，Taq
DNA聚合酶 0．5 L。离心混匀。94℃ 2 min；26个
循 环：94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min；72℃
5 min，4℃待用。取 出反应产物稀释 25倍，置于
- 20℃储存待用。
1．7 选择性 AFLP扩增反应
反应体系 1O L中含有模板 DNA 2．5 L，1O
×buffer 1 L，dNTPs 0．225 mmol／L，Taq DNA聚
合酶 0．625 L，EAOO引物 0．2 ng／~L，MCO0引物
0．2ng／~L，MgC12 1．5 mmol／L。反应条件为：第 1个
循 环，94℃ 4 min，94℃ 30 S，65℃ 1 min，72℃
1 min；第 2～ 13个循 环，94℃ 30 s，65℃ 1 min，
72℃ 1 min(退火降低 0．7℃)；第 14～36个循环，
94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min；72℃ 5 min，4℃
保存备用。
1．8 聚丙烯酰胺凝胶电泳及 AgNO，染色
选择性扩增产物分别加入 3／4体积甲酰胺染料
(甲酰胺 98 ，EDTA 0．5 mol／L，溴酚蓝，二 甲苯
氰)，离心混匀，95℃加热变性 5 min，立即置于冰
上。取上样缓冲液 3 L于 6 聚丙烯酰胺凝胶(丙
烯酰胺一甲叉双丙烯酰胺 19：1，尿素 27 g，1×TBE
电泳缓冲液)65 W 恒功率预电泳 30 min后，再取
PCR产物 4 L上样于凝胶孔中，65 W 恒功率预电
泳，直到二甲苯氰迁移至与凝胶分离，凝胶牢固附着
于粘合硅烷处理的玻板上，并将其浸入固定溶液
(1O 乙酸溶液)中孵育 30 min，接着用重蒸水漂洗
3次，每次 5 min；然后在含有 0．1 oA AgNO。的染液
中染色 30 min，用重蒸水漂洗不超过 5 s，在 2 L冷
却的显影液中轻轻摇动，直至带纹出现。再加入等体
积的固定液固定 2 min，用重蒸水冲洗 2次，每次
2 min，最后将胶放在室温下自然干燥。
1．9 数据处理与结果分析
选取扩增结果较好的谱带，用PopGene软件进
行分析。
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第 1期 陶 莉等：AFLP用于构建罗汉果 DNA指纹图谱及其幼苗雌雄鉴别 79
2 结果与分析
2．1 DNA质量分析
在本研究中，从 3个不同品种罗汉果组培苗的
幼叶中提取到高质量的 DNA，使其被 EcoRI／Trul
完全酶切，这是成功构建 DNA指纹图谱的关键。实
验结果表明：采用 CTAB法从组培苗的幼嫩叶片中
提取的DNA纯度很高，都接近理论最纯值 1．8O(结
果 见表 1)。
表 1 DNA纯度与浓度
Table 1 Purity of genomic DNA
样品名 Sample A2,o／28o
青皮果Qingpiguo旱
青皮果Qingpiguo舍
长滩果 Changtanguo旱
长滩果 Changtanguo舍
冬瓜果 Dongguaguo旱
冬瓜果 Dongguaguo客
1．82
1．86
1．79
1．80
1．92
1．82
2．2 指纹图谱分析
本研究通过对基因组进行 EcoRI／Trul双酶
切，分别将酶切片断与人工接头作进一步连接，并从
9对 引物 中(ATC／CAG，AGC／CAA，ACC／CGT，
AGT／CAG，ATG／CAG，AGC／CAG，ACC／CAA，
ATC／CCA，ATG／CAT)筛选出 AGC／CAG引物对
进行扩增所得到的谱带符合指纹图谱的标准(结果
见表 2)，首次成功构建了 3个不同罗汉果品种特定
基因组 DNA指纹图谱。
用此引物得到 16条谱带，3个品种之间有 8条
共有带，分别为 分子量 400 bp、360 bp、200 bp、
195 bp、180 bp、140 bp、135 bp、100 bp处扩增带；8
条非共有带，其中500 bp、300 bp处只有青皮果扩增
出谱带，120 bp处只有青皮果未扩增出谱带；310 bp
处青皮果与冬瓜果均扩增出谱带，而长滩果无谱带；
450 bp处青皮果与长滩果均扩增出谱带，冬瓜果无
谱带。
表 2 3个品种的罗汉果被 AGC／cAG引物扩增所得 DNA指纹图谱
Table 2 AFLP fingerprints on three varieties of Siraitia grosvenori(Swingle)by AGC／CAG
分子量 青皮果旱 青皮果舍 长滩果旱 长滩果舍 冬瓜果旱 冬瓜果舍
Molecular weight Qingpiguo Qingpiguo舍 Changtanguo Changtanguo舍 Dongguaguo旱 Dongguaguo舍
500 bp
450 bp
400 bp
390 bp
360 bp
310 bp
300 bp
200 bp
195 bp
180 bp
140 bp
135 bp
120 bp
115 bp
110 bp
100 bp
2．3 雌雄鉴别
罗汉果为雌雄异株植物，雌株和雄株的形态特
征肉眼无法识别，只能等到开花结果才能分辨，给罗
汉果组培苗的生产和新品种的选育带来了一定的困
难。
本研究从 9对引物中筛选出 ATG／CAG引物
对进行扩增所得到的谱带可以将罗汉果幼苗的雌雄
鉴别出来。在分子量为 280 bp和 190 bp处，所有的
雄株都扩增出谱带，而雌株没有，故认为 280 bp和
190 bp处谱带为雄株特有谱带，以用于雌雄鉴别
(结果见表 3)。
另外，在此之前，作者曾对 5O株罗汉果青皮果
组培苗幼苗(雌雄各 25株)的株高、叶柄长、叶片长、
叶片宽、节间长、节间直径、叶柄直径、叶基凹度、叶
柄长方差、叶片长方差等 15个性状进行调查统计
分析，并用二类判别法判别，得到判别方程。用方程
去判别罗汉果幼苗的雌雄[11,12]，回代法检验准确率
达到 9O％，重新随机取组培苗幼苗 1O株，量取各种
性状，代入方程，检验准确率为 7O％ (具体数据另文
发表)。此法亦可为罗汉果品种选育中幼苗的雌雄
鉴别提供一定的依据。由此可见，我们在进行罗汉果
的雌雄鉴别时可以考虑将分子标记鉴别法及数量性
状判别分析法结合起来进行鉴别，先通过数量性状
进行判别分析，以较低的成本获得 7O 的准确率，
再通过分子标记进行准确鉴定，以达到快速经济鉴
别罗汉果种苗雌雄的目的。
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表 3 3个品种的罗汉果被 ATG／CAG引物扩增所得 DNA图谱
Table 3 DNA map on three varieties of Siraitia grosvenori Swingle by ATG／CAG
分子量
Molecular weight
青皮果旱
Qingpiguo旱
青皮果舍
Qingpiguo舍
长滩果旱
Changtanguo
长滩果舍
Changtanguo舍
冬瓜果旱
Dongguaguo旱
冬瓜果 舍
Dongguaguo舍
400 bp
280 bp
250 bp
240 bp
200 bp
190 bp
160 bp
90 bp
3 讨论
在当前的中药材生产中，品种混杂及种质退化
现象非常严重。而利用传统的形态学性状进行品种
鉴定 ，不仅周期长，而且费用高。但利用分子标记技
行品种鉴定，可以不受环境影响，从 DNA水平
反映品种间差异，为品种纯度鉴定提供了快速
可行、高效准确的方法。前人对植物分子标记做了许
多工作．但主要着眼于多态性的研究，真正实用于鉴
别中药材品种并不多见。本研究首次利用 AFLP技
术对几个罗汉果栽培品种进行研究，鉴定 AFLP指
纹分析技术在中药材生产上的实用效果，进而建立
几个罗汉果主要栽培品种的 DNA指纹图谱，为罗
汉果的品种鉴别提供依据。
另外，本研究首次将 AFLP技术与数量性状结
合起来对罗汉果幼苗进行雌雄鉴别，建立了一种在
雌雄异株植物幼苗时期进行雌雄鉴别的新方法，在
科研和生产中具有很强的实际意义。
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