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Chemometric Analysis of the Stem and Leaf of Gentiana rigescens in Agroforestry Systems

农林复合系统滇龙胆茎叶化学计量特征研究



全 文 :植物科学学报  2015ꎬ 33(4): 472~481
Plant Science Journal
    DOI:10􀆰 11913 / PSJ􀆰 2095-0837􀆰 2015􀆰 40472
农林复合系统滇龙胆茎叶化学计量特征研究
沈 涛1ꎬ 张 霁2ꎬ 赵艳丽2ꎬ 左智天2ꎬ 王元忠2∗
(1􀆰 玉溪师范学院资源环境学院ꎬ 云南玉溪 653100ꎻ 2􀆰 云南省农业科学院药用植物研究所ꎬ 昆明 650200)
摘  要: 以农林复合系统种植的滇龙胆(Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl.)为材料ꎬ 采用高效液相色谱法建
立不同栽培系统滇龙胆茎、 叶的色谱指纹图谱ꎬ 并测定其主要活性成分马钱苷酸、 獐牙菜苦苷、 龙胆苦苷和当
药苷含量ꎬ 研究不同栽培系统滇龙胆茎、 叶化学计量特征ꎮ 采用相关性分析、 指纹图谱相似度分析、 偏最小二
乘判别分析(PLS ̄DA)、 变量投影重要性准则(VIP)等方法进行化学数据分析ꎮ 结果显示ꎬ 滇龙胆主要活性成分
马钱苷酸含量为(1􀆰 85 ± 0􀆰 92) mg / g ~ (7􀆰 43 ± 7􀆰 64) mg / gꎬ 獐牙菜苦苷含量为(1􀆰 03 ± 0􀆰 17) mg / g ~
(1􀆰 58 ± 0􀆰 50) mg / gꎬ 龙胆苦苷含量为(15􀆰 28 ± 11􀆰 34) mg / g ~ (24􀆰 59 ± 7􀆰 84) mg / gꎬ 当药苷含量为
(4􀆰 10 ± 1􀆰 64) mg / g ~ (31􀆰 67 ± 22􀆰 70) mg / gꎬ 且叶片中 4种活性成分的总含量高于茎ꎻ 不同栽培系统中ꎬ
与尼泊尔桤木间作的滇龙胆茎、 叶活性成分总含量最高ꎬ 而与核桃间作的滇龙胆茎、 叶活性成分总含量最低ꎮ
相关性分析显示ꎬ 植株相同部位和不同部位间的环烯醚萜和裂环烯醚萜含量呈显著(P < 0􀆰 05)或极显著(P <
0􀆰 01)正相关ꎮ 指纹图谱相似度分析表明ꎬ 不同栽培系统滇龙胆茎指纹图谱相似度介于 0􀆰 989~0􀆰 992 之间、 叶
指纹图谱相似度为 0􀆰 988~0􀆰 996ꎬ 相同部位样品化学成分种类相似ꎮ PLS ̄DA 分析结果表明ꎬ 茎和叶片整体化
学计量特征具有明显差异ꎻ 单作及林药间作的样品被区分为不同类群ꎬ 不同间作模式下滇龙胆茎、 叶化学成分
具显著差异ꎬ 叶片高效液相色谱指纹图谱可用于区分不同栽培系统滇龙胆样品ꎮ 本研究结果可为农林复合系统
滇龙胆有效成分含量研究及滇龙胆资源的合理开发利用提供科学依据ꎮ
关键词: 滇龙胆ꎻ 农林复合系统ꎻ 茎叶ꎻ 色谱指纹图谱ꎻ 化学计量特征
中图分类号: R284          文献标识码: A          文章编号: 2095 ̄0837(2015)04 ̄0472 ̄10
      收稿日期: 2015 ̄01 ̄16ꎬ 退修日期: 2015 ̄02 ̄10ꎮ
  基金项目: 国家自然科学基金项目(81260608)ꎻ 云南省自然科学基金项目(2013FD050ꎬ 2013FZ150ꎬ 2013FD066ꎬ 2014FD068)ꎮ
  作者简介: 沈涛(1984-)ꎬ 男ꎬ 讲师ꎬ 研究方向为药用植物资源评价(E ̄mail: st_ yxnu@126.com)ꎮ
  ∗通讯作者(Author for correspondence􀆰 E ̄mail: boletus@126.com)ꎮ
Chemometric Analysis of the Stem and Leaf of Gentiana
rigescens in Agroforestry Systems
SHEN Tao1ꎬ ZHANG Ji2ꎬ ZHAO Yan ̄Li2ꎬ ZUO Zhi ̄Tian2ꎬ WANG Yuan ̄Zhong2∗
(1􀆰 College of Resources and Environmentꎬ Yuxi Normal Universityꎬ Yuxiꎬ Yunnan 653100ꎬ Chinaꎻ 2􀆰 Institute of Medicinal
Plantsꎬ Yunnan Academy of Agricultural Sciencesꎬ Kunming 650200ꎬ China)
Abstract: A method for HPLC fingerprinting of the aerial parts of Gentiana rigescens Franch.
ex Hemsl. in agroforestry and monoculture systems was established. Contents of the main
bioactive compoundsꎬ such as loganic acidꎬ swertiamarinꎬ gentiopicroside and swerosideꎬ
were determined. Variations in the chemometric characteristics of the stems and leaves under
different cultivation systems were investigatedꎬ with correlation analysisꎬ similarity analysisꎬ
partial least squares discriminant analysis (PLS ̄DA) and variable importance in the projection
( VIP ) analysis used to investigate these variations. Quantitative analysis showed that
gentiopicrosideꎬ swertiamarinꎬ loganic acid and sweroside contents ranged from (15􀆰 28 ±
11􀆰 34) mg / g to (24􀆰 59 ± 7􀆰 84) mg / gꎬ (4􀆰10 ± 1􀆰 64) mg / g to (31􀆰 67 ± 22􀆰 70) mg / gꎬ
(1􀆰 85 ± 0􀆰 92) mg / g to (7􀆰 43 ± 7􀆰 64) mg / gꎬ and (1􀆰 03 ± 0􀆰 17) mg / g to (1􀆰 58 ± 0􀆰 50) mg /
gꎬ respectively. Total contents of the four bioactive compounds in leaves were higher than
those in stems. Total content of the four bioactive compounds in the aerial part was the highest
in the plant intercropped with Alnus nepalensis D. Don and was the lowest in the plant
intercropped with Juglans regia L.. Correlation analysis showed that the variation in iridoid and
secoiridoid content had significant ( P < 0􀆰 05) or very significant ( P < 0􀆰 01) positive
correlation in the same part and in different partsꎬ respectively. Similarities of the stem samples
ranged from 0􀆰989 to 0􀆰992. Similarities of the leaf samples ranged from 0􀆰988 to 0􀆰996. The
chemical constituents in stems and leaves were similar. Howeverꎬ the contents of those
compounds were different. PLS ̄DA analysis showed that the chemometric characteristics of
the stems and leaves were very different. Samples collected from different cultivation systems
were classified as different groups. Chemical compounds in the leaves were more affected by
the cultivation system than those in the stems. These results provide useful information for the
study of agroforestry systems of G. rigescens Franch. ex Hemsl. and sustainable use of
medicinal materials.
Key words: Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl.ꎻ Agroforestry systemꎻ Stem and leafꎻ
HPLC fingerprintꎻ Chemometric characteristics
    农林复合系统可有效缓解粮、 药、 林的争地矛
盾ꎬ 保护物种多样性[1-3]ꎮ 药用植物与林木、 作物
间作是农林复合系统的重要组成部分ꎬ 受到国内外
学者的广泛关注[4ꎬ 5]ꎮ Cao 等[6] 研究发现银杏
(Ginkgo biloba L.)与小麦、 蚕豆等农作物间作可
显著提高各作物的产量ꎮ Bari 和 Rahim[7]研究认
为ꎬ 药用植物与林木间作较单作模式可获得更高经
济效益ꎮ 除影响产量和经济效益外ꎬ 不同栽培系统
中植物体内化学成分的含量也可能发生变化[8]ꎮ
化学成分作为药用植物药效形成的物质基础[9]ꎬ
研究其在农林复合系统中的变化对保证药材品质具
有重要意义[10]ꎮ Chamoli 等[8]研究单作与林药间
作下穿心莲(Andrographis paniculata (Burm. f.)
Nees)中二萜内酯有效成分的含量变化ꎬ 发现与桑
树间作的穿心莲有效成分含量比单作高ꎮ 对粗毛淫
羊藿(Epimedium acuminatum Franch.)在林缘旷
地、 乔灌木林等生境中化学成分变化的研究显示ꎬ
淫羊藿苷含量受生境影响较大ꎬ 黄酮类成分含量受
生境影响较小[11]ꎮ
化学指纹图谱可反映药用植物中化学成分的整
体变化[12]ꎮ 偏最小二乘判别分析(PLS ̄DA)、 主
成分分析(PCA)、 相似度分析(SA)等多变量分析
方法可进一步解释指纹图谱数据ꎬ 分析数据间隐含
的关系[13ꎬ 14]ꎮ Zhu等[15]建立了三七(Panax pseu ̄
doginseng Wall. var. notoginseng (Burkill) Hoo
et Tseng)主根和根茎的色谱指纹图谱与光谱指纹
图谱ꎬ 通过 PCA分析发现主根和根茎部位化学成
分具有差异ꎬ 色谱指纹图谱数据对不同部位的区分
效果最佳ꎮ Kwon 等[16]建立了栽培人参 ( Panax
ginseng C. A. Mey.)的红外光谱指纹图谱ꎬ 并采
用 PLS ̄DA分析光谱数据ꎬ 结果显示不同栽培年限
样品的光谱特征具有差异ꎬ 不同样品化学成分的变
化受栽培年限的影响ꎮ 以上研究表明ꎬ 指纹图谱和
多变量分析相结合的方法ꎬ 适用于药用植物化学计
量特征的整体变化研究[17]ꎮ
龙胆科 ( Gentianaceae ) 药用植物滇龙胆
(Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl.)为传统
保肝中药龙胆的基源植物[18ꎬ 19]ꎮ 环烯醚萜类( iri ̄
doids)成分马钱苷酸( loganic acid)ꎬ 以及裂环烯
醚萜类(secoiridoids)成分獐牙菜苦苷(swertiama ̄
rin )、 龙 胆 苦 苷 ( gentiopicroside ) 和 当 药 苷
(sweroside)是滇龙胆主要活性成分[20]ꎮ 滇龙胆
为根茎类药材ꎬ 其茎和叶在采收时常被废弃ꎮ 滇龙
胆药材质量评价主要关注地下部位[21]ꎬ 对植株茎、
叶部位的研究较少[22]ꎮ 近年来对当归(Angelica
sinensis (Oliv.) Diels) [23]、 西洋参(Panax quin ̄
quefolius L.) [24]的研究显示ꎬ 根茎类药材地上部
分药用价值应受到关注ꎮ 本研究以林药间作系统和
374  第 4期                        沈 涛等: 农林复合系统滇龙胆茎叶化学计量特征研究
单作系统中的滇龙胆为材料ꎬ 通过建立茎、 叶高效
液相色谱指纹图谱(HPLC fingerprint)ꎬ 并结合多
变量分析ꎬ 探讨不同栽培系统对滇龙胆茎、 叶化学
计量特征的影响ꎬ 以期为滇龙胆农林复合系统的深
入研究和资源的合理利用提供科学依据ꎮ
1  材料与方法
1􀆰 1  植物材料
试验地设置在云南省临沧地区云县ꎮ 云县属亚
热带低纬度山地季风气候区ꎬ 年均气温 19􀆰 6℃ꎬ
年均降雨量 912 mmꎬ 日照时数 1829~2603 h(数
据来源: 中国宏观数据挖掘分析系统 http: / / num ̄
ber.cnki.net / cyfd / )ꎮ
2013年 10月于滇龙胆药材传统采收期ꎬ 以栽
培 3年的滇龙胆(Gentiana rigescens)单作(Ⅰ)、
滇龙胆与茶(Camellia sinensis var. sinensis)间作
(Ⅱ)、 滇龙胆与核桃( Juglans regia)间作(Ⅲ)、
滇龙胆与尼泊尔桤木(Alnus nepalensis)间作(Ⅳ)
4种常见栽培系统中的滇龙胆为材料ꎬ 样品由云南
省农业科学院药用植物研究所金航研究员鉴定ꎮ 每
种栽培系统依照 5 点取样法随机选取 10 株个体ꎬ
分别取茎、 叶放入 50℃烘箱中烘干至恒重ꎬ 粉碎
过 60目筛ꎬ 避光保存备用ꎮ
1􀆰 2  仪器和试剂
仪器: 安捷伦 1260 高效液相色谱仪、 Chem ̄
station 色谱数据工作站 (美国安捷伦公司 )ꎬ
SY3200 ̄T型超声波清洗仪(上海声源超声波仪器
设备有限公司)ꎻ 万分之一电子分析天平(美国奥
豪斯公司)ꎻ FW ̄100型高速万能粉碎机(天津泰斯
特仪器有限公司)ꎻ Millipore 纯水系统(美国 Milli ̄
pore公司)ꎮ
试剂: 马钱苷酸和龙胆苦苷对照品购自中国食
品药品检定研究院 (批号: 111865 ̄201403 和
110770 ̄201314)ꎬ 獐牙菜苦苷和当药苷对照品购
自上海士锋科技有限公司 (批号: B11118 和
B17388)ꎻ 乙腈和甲酸均为色谱纯ꎬ 购自美国赛默
飞世尔科技公司ꎻ 实验用水为 Millipore 纯水系统
制备的去离子水ꎻ 其余试剂均为分析纯ꎮ
1􀆰 3  实验方法
1􀆰 3􀆰 1  色谱条件
安捷伦 ZORBAX SB ̄C18液相色谱柱(150 mm ×
4􀆰 6 mmꎬ 5 μm)ꎮ 流动相: 0􀆰 1%甲酸水溶液(A)
和乙腈(B)ꎬ 梯度洗脱: 0~5 minꎬ B 为 5%ꎻ 5~
10 minꎬ B为 5%~10%ꎻ 10~26 minꎬ B为 10%~
26%ꎻ 26~30 minꎬ B为 30%ꎮ 流速 1􀆰 00 mL / minꎬ
柱温 30℃ꎬ 检测波长 241 nmꎬ 进样量 10 μLꎮ
1􀆰 3􀆰 2  对照品溶液的制备
精密称取对照品马钱苷酸 10􀆰 0 mg、 獐牙菜苦
苷 25􀆰 0 mg、 龙胆苦苷 36􀆰 0 mg、 当药苷 10􀆰 0 mgꎬ
溶解ꎬ 置于 10 mL 容量瓶中ꎬ 加入色谱纯甲醇定
容ꎬ 摇匀ꎬ 即得到马钱苷酸、 獐牙菜苦苷、 龙胆苦
苷和当药苷对照品溶液ꎬ 避光 4℃保存ꎬ 备用ꎮ
1􀆰 3􀆰 3  供试品溶液的制备
分别精密称取滇龙胆样品粉末 0􀆰 1 g放入具塞
试管中ꎬ 加入 7􀆰 0 mL 80 %甲醇溶液ꎬ 称重ꎬ 超声
45 minꎬ 冷却至室温ꎬ 再称重ꎬ 用甲醇补足损失重
量ꎬ 摇匀过 0􀆰 22 μm 微孔滤膜ꎬ 取滤液为供试样
品溶液ꎮ
1􀆰 3􀆰 4  线性关系
以峰面积为纵坐标 Yꎬ 对照品溶液浓度为横坐
标 X (μg / mL)绘制标准工作曲线ꎬ 计算回归方程
(表 1)ꎮ
1􀆰 3􀆰 5  精密度、 重复性、 稳定性试验
精密吸取马钱苷酸、 獐牙菜苦苷、 龙胆苦苷、
当药苷对照品溶液各 10 μLꎬ 在 1􀆰 3􀆰 1色谱条件下
连续进样 6次ꎬ 计算峰面积的 RSD分别为: 马钱
表 1  回归方程与线性范围
Table 1  Linear relationships and linear ranges
化合物
Compounds
回归方程
Linear relationship
相关系数

线性范围( μg / mL)
Linear ranges
马钱苷酸 Loganic acid Y = 8237.1924 X + 30.4321 0.9997 2500~1
獐牙菜苦苷 Swertiamarin Y = 12766.65731 X - 110.68501 0.9993 3600~9
龙胆苦苷 Gentiopicroside Y = 8198.37753 X + 12.76151 0.9996 1000~50
当药苷 Sweroside Y = 2744.83082 X + 13.07978 0.9997 1000~10
474 植 物 科 学 学 报 第 33卷 
苷酸 0􀆰 93%、 獐牙菜苦苷 1􀆰 07%、 龙胆苦苷
0􀆰 81%、 当药苷 1􀆰 27%ꎬ 表明仪器精密度良好ꎮ
精密称取 0􀆰 1 g单作滇龙胆叶片样品 6份ꎬ 依
照 1􀆰 3􀆰 3的方法制备供试品溶液ꎬ 在 1􀆰 3􀆰 1 色谱
条件下进行测定ꎬ 记录马钱苷酸、 獐牙菜苦苷、 龙
胆苦苷、 当药苷峰面积ꎬ 计算 RSD 分别为
1􀆰 09%、 2􀆰 12%、 1􀆰 97%和 2􀆰 21%ꎬ 表明供试品
溶液重复性良好ꎮ
精密称取 0􀆰 1 g 单作滇龙胆叶片样品ꎬ 依照
1􀆰 3􀆰 3 的方法制备供试品溶液ꎬ 在 0、 2、 4、 6、
8、 12 h内测定ꎬ 记录马钱苷酸、 獐牙菜苦苷、 龙
胆苦苷、 当药苷峰面积ꎬ 计算 RSD 分别为
2􀆰 18%、 2􀆰 03%、 1􀆰 97%和 2􀆰 07%ꎬ 表明供试品
溶液在 12 h内稳定ꎮ
1􀆰 3􀆰 6  回收率试验
精密称取已知含量的样品粉末 0􀆰 1 g(平行 9
份)ꎬ 分别按 80%、 100%和 120%加入马钱苷酸、
獐牙菜苦苷、 龙胆苦苷、 当药苷对照品ꎬ 依照
1􀆰 3􀆰 3的方法制备供试品溶液ꎬ 在 1􀆰 3􀆰 1 色谱条
件下测定ꎬ 记录色谱图ꎬ 计算回收率ꎮ 结果显示ꎬ
4种化学成分回收率分别为 101􀆰 87%、 99􀆰 10%、
99􀆰 21%和 98􀆰 64ꎬ 表明此方法准确度较高ꎮ
1􀆰 3􀆰 7  数据分析
采用«中药色谱指纹图谱相似度评价系统»
(2004版 A)分析 4种栽培系统滇龙胆茎、 叶 HPLC
指纹图谱数据ꎬ 确定共有峰ꎬ 形成对照指纹图谱并
进行相似度分析ꎮ 茎、 叶中化学成分含量变化的相
关性分析采用皮尔森相关系数(Pearson correlation
coefficient)ꎬ 数据分析用 SPSS 18􀆰 0完成ꎮ 用偏最
小二乘判别分析(PLS ̄DA)和变量投影重要性准则
(VIP)确定引起茎、 叶样品化学成分差异的化学信
息ꎬ 数据分析用 SIMCA ̄P+ 11􀆰 5软件完成ꎮ
2  结果与分析
2􀆰 1  茎、 叶中主要活性成分的含量
滇龙胆茎、 叶主要活性成分含量测定结果显示
(表 2)ꎬ 龙胆苦苷含量为(15􀆰 28 ±11􀆰 34) mg / g ~
(24􀆰 59 ± 7􀆰 84) mg / gꎻ 当药苷含量为 (4􀆰 10 ±
1􀆰 64) mg / g ~ (31􀆰 67 ±22􀆰 70) mg / gꎬ 马钱苷酸
含量为(1􀆰 85 ± 0􀆰 92) mg / g ~ (7􀆰 43 ± 7􀆰 64) mg /
gꎬ 獐牙菜苦苷含量为 (1􀆰 03 ± 0􀆰17) mg / g ~
(1􀆰 58 ± 0􀆰 50) mg / gꎮ 4种化学成分在茎中含量依
次为: 龙胆苦苷 >当药苷 >马钱苷酸 >獐牙菜苦
苷ꎻ 叶中含量依次为: 当药苷 > 龙胆苦苷 > 马钱
苷酸 > 獐牙菜苦苷ꎮ 叶片中 4 种化学成分总含量
高于茎ꎮ 滇龙胆与尼泊尔桤木间作模式下ꎬ 其茎叶
部位有效成分总含量在 4 种栽培系统中最高
[(105􀆰 83 ± 52􀆰 92) mg / g]ꎻ 单作次之[(98􀆰 51 ±
58􀆰 93) mg / g]ꎻ 滇龙胆与核桃间作模式最低
[(66􀆰 54 ± 35􀆰 33) mg / g)]ꎮ
表 2  滇龙胆茎、 叶主要活性成分含量(Mean ±SD)
Table 2  Contents of main bioactive compounds in stems and leaves of Gentiana rigescens
器官
Organ
栽培系统
Cultivation system
(mg / g)
马钱苷酸
Loganic acid
(mg / g)
獐牙菜苦苷
Swertiamarin
(mg / g)
龙胆苦苷
Gentiopicroside
(mg / g)
当药苷
Sweroside
(mg / g)
总含量
Total content
(mg / g)

Stem
Ⅰ 3.71 ±2.83 1.33 ±0.27 23.94 ±14.06 6.77 ±4.93 35.32 ±21.13
Ⅱ 1.85 ±0.92 1.03 ±0.17 24.59 ±7.84 4.10 ±1.64 31.57 ±10.00
Ⅲ 3.39 ±2.81 1.30 ±0.34 20.89 ±17.81 5.35 ±2.52 30.94 ±21.15
Ⅳ 4.00 ±3.50 1.20 ±0.29 21.89 ±8.93 15.61 ±11.43 42.70 ±21.62
平均含量 Average content 4.23 ±3.71 1.22 ±0.29 22.95 ±12.41 8.44 ±7.80 36.84 ±19.86

Leaf
Ⅰ 7.43 ±7.64 1.54 ±0.31 22.55 ±12.71 31.67 ±22.70 63.19 ±40.93
Ⅱ 3.51 ±2.11 1.17 ±0.17 23.15 ±13.33 16.01 ±9.15 43.83 ±19.70
Ⅲ 1.96 ±1.29 1.50 ±0.40 15.28 ±11.34 16.86 ±14.25 35.60 ±23.15
Ⅳ 6.34 ±5.03 1.58 ±0.50 25.77 ±11.08 29.44 ±20.19 63.13 ±33.14
平均含量 Average content 4.81 ±5.06 1.45 ±0.39 21.69 ±12.32 23.49 ±18.19 51.44 ±31.67
    注: Ⅰꎬ 滇龙胆单作ꎻ Ⅱꎬ 滇龙胆与茶树间作ꎻ Ⅲꎬ 滇龙胆与核桃间作ꎻ Ⅳꎬ 滇龙胆与尼泊尔桤木间作ꎮ
Notes: Ⅰꎬ Monocultureꎻ Ⅱꎬ Gentiana rigescens -Camellia sinensis var. sinensis systemꎻ Ⅲꎬ G. rigescens - Juglans regia systemꎻ
IVꎬ G. rigescens - Alnus nepalensis system.
574  第 4期                        沈 涛等: 农林复合系统滇龙胆茎叶化学计量特征研究
2􀆰 2  茎、 叶中主要活性成分的相关性分析
对滇龙胆茎、 叶化学成分的相关性分析结果显
示(表 3)ꎬ 茎中的当药苷含量与茎中的马钱苷酸、
獐牙菜苦苷含量呈极显著正相关(R = 0􀆰 520ꎻ R =
0􀆰 431ꎻ P < 0􀆰 01)ꎻ 叶中的龙胆苦苷含量与叶中
的獐牙菜苦苷、 马钱苷酸和当药苷含量呈显著
(P < 0􀆰 05)或极显著 (P < 0􀆰 01)正相关 (R =
0􀆰 349ꎻ R = 0􀆰 611ꎻ R = 0􀆰 548)ꎮ
表 3结果还显示ꎬ 叶中的马钱苷酸含量与茎中
的当药苷和马钱苷酸含量之间呈极显著正相关
(R = 0􀆰 419ꎻ R = 0􀆰 760ꎻ P < 0􀆰 01)ꎻ 叶中的獐
牙菜苦苷与茎中的獐牙菜苦苷含量也呈极显著正相
关(R = 0􀆰 579ꎻ P < 0􀆰 01)ꎻ 叶中的龙胆苦苷含量
与茎中的当药苷、 马钱苷酸和龙胆苦苷含量呈显著
(P < 0􀆰 05)或极显著 (P < 0􀆰 01)正相关 (R =
0􀆰 331ꎻ R = 0􀆰 462ꎻ R = 0􀆰 641)ꎻ 叶中的当药苷
含量与茎中的当药苷和马钱苷酸含量呈显著(P <
0􀆰 05)或极显著(P < 0􀆰 01)正相关(R = 0􀆰 409ꎻ
R = 0􀆰 645)ꎮ
2􀆰 3  指纹图谱相似度分析
取 4种栽培系统下的滇龙胆茎、 叶供试品溶液
进行 HPLC 测定并记录色谱图ꎬ 再用«中药色谱指
纹图谱相似度评价系统»对数据进行处理ꎬ 生成对
照指纹图谱ꎮ 从图 1可见ꎬ 共标定出 26个共有峰ꎬ
其中 4号峰为马钱苷酸ꎬ 9号峰为獐牙菜苦苷ꎬ 11
号峰为龙胆苦苷ꎬ 12 号峰为当药苷ꎮ 相似度计算
结果显示ꎬ 相同栽培系统中ꎬ 滇龙胆单作样品茎、
叶 HPLC 指纹图谱相似度平均值分别为 0􀆰950 和
0􀆰947ꎻ 与茶树间作样品茎、 叶 HPLC 指纹图谱相
似度平均值分别为 0􀆰986和 0􀆰930ꎻ 与核桃间作样
品茎、 叶 HPLC 指纹图谱相似度平均值分别为
0􀆰959 和 0􀆰925ꎻ 与尼泊尔桤木间作样品茎、 叶
HPLC指纹图谱相似度平均值均为 0􀆰 970ꎮ 所有样
品茎指纹图谱相似度介于 0􀆰989 ~0􀆰992 之间ꎻ 叶
指纹图谱相似度为 0􀆰988 ~0􀆰996ꎮ 相似度分析并
结合指纹图谱ꎬ 可见相同器官样品在不同栽培模式
之间和同一栽培模式内化学成分种类差别较小ꎮ
2􀆰 4  偏最小二乘判别分析(PLS ̄DA)
采用 PLS ̄DA对茎、 叶进行分类识别ꎬ 以马钱
苷酸、 獐牙菜苦苷、 龙胆苦苷和当药苷 4种有效成
分含量为变量(X)建立的茎、 叶判别模型为: R 2Y
(cum) = 0􀆰 355ꎬ Q 2(cum) = 0􀆰 297ꎬ 但茎、 叶样
品区分并不明显(图 2: A)ꎮ 以 HPLC 指纹图谱色
谱峰(保留时间: 3􀆰 00~27􀆰 42 min)峰面积为变量
(X)建立的判别模型为: R 2 Y ( cum) = 0􀆰 973ꎬ
Q 2(cum) = 0􀆰 778ꎬ 茎和叶片样品明显可聚为两
类(图 2: B)ꎮ 变量投影重要性准则(VIP)分析结
果显示ꎬ 共有 55个化学成分的色谱峰峰面积对茎
和叶片样品的区分具有显著贡献(VIP 值 > 1)ꎮ 已
知成分当药苷的 VIP 值为 2􀆰045ꎮ 55 个色谱峰中ꎬ
出峰时间在 11􀆰 00~27􀆰 42 min的占 73􀆰 21%ꎮ
以 4种有效成分含量为变量(X)建立 PLS ̄DA
判别模型ꎬ 茎的 PLS ̄DA 模型为: R 2Y(cum) =
0􀆰 156ꎬ Q 2(cum) = -0􀆰04ꎻ 叶的 PLS ̄DA 模型
为: R 2Y(cum) = 0􀆰179ꎬ Q 2(cum) = -0􀆰03ꎬ 经
比较发现ꎬ 不同栽培系统下的滇龙胆茎、 叶样品均
无明显分离趋势(图 3: Aꎬ B)ꎬ 4 种活性成分含
量建立的模型不能对栽培系统进行有效区分ꎮ
以 HPLC指纹图谱色谱峰(保留时间: 3􀆰 00~
27􀆰 42 min)峰面积为变量(X)建立判别模型ꎬ 茎
表 3  滇龙胆茎、叶化学成分相关性分析
Table 3  Correlation analysis of compounds in stems and leaves of Gentiana rigescens
化学成分
Compounds
茎当药苷
Sweroside
in stem
茎马钱苷酸
Loganic
acid in stem
茎獐牙菜苦苷
Swertiamarin
in stem
茎龙胆苦苷
Gentiopicroside
in stem
叶马钱苷酸
Loganic
acid in leaf
叶獐牙菜苦苷
Swertiamarin
in leaf
叶龙胆苦苷
Gentiopicroside
in leaf
茎马钱苷酸 Loganic acid in stem 0.520∗∗ 1     
茎獐牙菜苦苷 Swertiamarin in stem 0.431∗∗ 0.492∗∗ 1     
茎龙胆苦苷 Gentiopicroside in stem 0.248 0.397∗ 0.123 1     
叶马钱苷酸 Loganic acid in leaf 0.419∗∗ 0.760∗∗ 0.212 0.515∗∗ 1     
叶獐牙菜苦苷 Swertiamarin in leaf 0.199 0.202 0.579∗∗ 0.115 0.208 1     
叶龙胆苦苷 Gentiopicroside in leaf 0.331∗ 0.462∗∗ 0.127 0.641∗∗ 0.611∗∗ 0.349∗ 1     
叶当药苷 Sweroside in leaf 0.409∗ 0.645∗∗ 0.218 0.283 0.705∗∗ 0.230 0.548∗∗
    注: ∗∗ 表示在 P < 0. 01水平(双侧)上显著相关ꎻ ∗表示在 P < 0. 05水平(双侧)上显著相关ꎮ
Notes: ∗∗ significant correlation at the P < 0. 01 levelꎻ ∗ significant correlation at the P < 0. 05 level.
674 植 物 科 学 学 报 第 33卷 
mAU
237 50.
197 08.
120 66.
4 24.
0 00.
0.00 3.92 7.83 11.75 15.67 19.58 23.50 27.42
!"#$ Retention time (min)
R
S8
S7
S6
S5
S4
S3
S2
S1
22
2324 25
2613
14
15
16
12
1 2 3
4
5
6
7
8
9
10
11
17
18
19
20 21
化合物: 4号峰为马钱苷酸ꎻ 9号峰为獐牙菜苦苷ꎻ 11 号峰为龙胆苦苷ꎻ 12 号峰为当药苷ꎮ R: 对照指纹图谱ꎻ S1~
S4: 叶指纹图谱ꎻ S5~S8: 茎指纹图谱ꎮ S1和 S5: 滇龙胆单作ꎻ S2和 S6: 滇龙胆与茶树间作ꎻ S3 和 S7: 滇龙胆与
核桃间作ꎻ S4和 S8: 滇龙胆与尼泊尔桤木间作ꎮ
Compounds: Peak 4 was loganic acidꎻ Peak 9 was swertiamarinꎻ Peak 11 was gentiopicrosideꎻ Peak 12 was swero ̄
side. R: Reference fingerprintꎻ S1-S4: Fingerprint of leavesꎻ S5-S8: Fingerprint of stems. S1 and S5: Monocultureꎻ
S2 and S6: Gentiana rigescens - Camellia sinensis var. sinensis systemꎻ S3 and S7: G. rigescens - Juglans regia
systemꎻ S4 and S8: G. rigescens - Alnus nepalensis system.
图 1  滇龙胆茎、 叶高效液相色谱指纹图谱
Fig􀆰 1  HPLC fingerprint of stem and leaf of cultivated Gentiana rigescens
B2
1
0
-1
-2
-3 -2 -1 0 1 2 3
t[1] t[1]
t[2
]
t[2
]
4
2
0
-2
-4
-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10
A
A: 以 4种活性成分含量为变量建立的 PLS ̄DA模型ꎻ B: 以指纹图谱色谱峰为变量建立的 PLS ̄DA模型ꎮ 1: 滇龙胆茎样品ꎻ
2: 滇龙胆叶片样品ꎮ 横坐标 t[1]和纵坐标 t[2]分别表示第一主成分与第二主成分得分ꎮ
A: Variables of PLS ̄DA were contents of four bioactive compoundsꎻ B: Variables of PLS ̄DA were peak areas of HPLC fin ̄
gerprint. 1: Stem samples of Gentiana rigescensꎻ 2: Leaf samples of G. rigescens. t[1] and t[2] of coordinate axis
mean scores of the first principal component and second principal componentꎬ respectively.
图 2  滇龙胆茎、 叶样品 PLS ̄DA判别分析得分散点图
Fig. 2  Scatter plot of PLS ̄DA for stem and leaf samples of Gentiana rigescens
774  第 4期                        沈 涛等: 农林复合系统滇龙胆茎叶化学计量特征研究
C D
B2 2
1 1
0 0
-1 -1
-2 -2
-3 -3-2 -2-1 -10 01 12 23 3
t[1]
t[1]
t[1]
t[1]
t[2
]
t[2
]
t[2
]
t[2
]
5
0
-5
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
10
5
0
-5
-10
-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10
A
A和 C: 茎 PLS ̄DA模型得分图ꎻ B和 D: 叶 PLS ̄DA模型得分图ꎮ A和 B: 以 4种活性成分含量为变量的 PLS ̄DA模型ꎻ C和 D: 以
指纹图谱色谱峰为变量的 PLS ̄DA模型ꎮ 1: 滇龙胆单作ꎻ 2: 滇龙胆与茶树间作ꎻ 3: 滇龙胆与核桃间作ꎻ 4: 滇龙胆与尼泊尔桤木间
作ꎮ 横坐标 t[1]和纵坐标 t[2]分别代表第一主成分与第二主成分得分ꎮ
A and C: Scatter plot of PLS ̄DA of stemꎻ B and D: Scatter plot of PLS ̄DA of leaf. A and B: Variables of PLS ̄DA were contents of
four bioactive compoundsꎻ C and D: Variables of PLS ̄DA were peak areas of HPLC fingerprint. 1: Monocultureꎻ 2: Gentiana riges ̄
cens - Camellia sinensis var. sinensis systemꎻ 3: G. rigescens - Juglans regia systemꎻ 4: G. rigescens - Alnus nepalensis system.
t[1] and t[2] of coordinate axis mean scores of the first principal component and second principal componentꎬ respectively.
图 3  不同栽培系统滇龙胆样品 PLS ̄DA判别分析得分散点图
Fig􀆰 3  Scatter plot of PLS ̄DA for Gentiana rigescens under different cultivation systems
的判别模型为: R 2Y(cum) = 0􀆰916ꎬ Q 2(cum) =
0􀆰 675ꎻ 叶的判别模型为: R 2 Y(cum) = 0􀆰 924ꎬ
Q 2(cum) = 0􀆰 719ꎮ 并且不同栽培系统下茎样品
被区分为 3类(第 1类为滇龙胆单作ꎬ 第 2 类为滇
龙胆与茶树间作ꎬ 第 3类为滇龙胆与核桃、 尼泊尔
桤木间作ꎬ 图 3: C)ꎻ 叶片样品被区分为 4 类(图
3: D)ꎮ 可见叶片样品建立的判别模型能有效区分
不同栽培系统ꎮ VIP分析结果显示ꎬ 茎、 叶中共有
80个化学成分的色谱峰面积对栽培系统的区分具
有显著贡献(VIP 值 > 1)ꎮ 出峰时间在 11 min 后
的色谱峰占 82􀆰 50%ꎮ
3  讨论
3􀆰 1  主要活性成分在茎、 叶中的积累与分布
次生代谢产物常在特定组织中合成、 积累ꎬ 在
植物体内的分布具有空间特征[25]ꎮ 环烯醚萜和裂
环烯醚萜均为萜类物质ꎬ 其合成途径主要包括甲羟
基戊酸途径 (MAV) 和甲基赤藓醇 ̄4 ̄磷酸途径
(MEP) [26ꎬ 27]ꎮ 以上合成途径具有独特的酶促反应
机制ꎬ 相关萜类合酶常在特定组织、 器官中进行表
达[28]ꎮ Beninger 等[29]研究环烯醚萜类成分 an ̄
tirrhinoside在金鱼草(Antirrhinum majus L.)不同
器官中的积累分布ꎬ 发现 antirrhinoside 主要在植
株茎、 侧枝、 花和花蕾中积累ꎮ 对龙胆属植物秦艽
(Gentiana macrophylla Pall.)的分子生物学研究表
明ꎬ 地上器官是植株萜类合成的关键部位ꎬ 与萜类
物质合成有关的基因在根、 茎、 叶和花中表达水平
不同[30]ꎮ 本研究对滇龙胆中环烯醚萜与裂环烯醚
萜成分测定结果显示ꎬ 马钱苷酸、 獐牙菜苦苷、 龙
胆苦苷和当药苷在茎、 叶中均有分布ꎬ 当药苷在叶
片中含量约为茎的 2􀆰 8 倍ꎬ 叶片是当药苷的主要
积累部位ꎮ 相关性分析显示ꎬ 茎、 叶中的环烯醚萜
874 植 物 科 学 学 报 第 33卷 
与裂环烯醚萜成分含量变化呈显著正相关ꎮ 生物合
成途径中马钱苷酸、 当药苷、 獐牙菜苦苷依次是后
者的前体ꎬ 均为龙胆苦苷合成的中间体[31]ꎮ 这 4
种成分含量间的相关性可能与以上代谢途径有关ꎮ
3􀆰 2  农林复合系统对茎、 叶主要活性成分积累的
影响
光是影响植物次生代谢产物形成的重要环境因
素[32]ꎬ 对咖啡(Coffea arabica L.) [33]、 欧洲女贞
(Ligustrum vulgare L.) [34]的研究表明ꎬ 光照影响
植物体内化学成分的积累ꎮ Takahashi 等[35]对不
同光照条件下的三花龙胆(Gentiana triflora Pall.)
的研究发现ꎬ 不同波长范围和颜色的光照可影响植
株中龙胆苦苷和獐牙菜苦苷的含量变化ꎮ 本试验不
同栽培系统中ꎬ 尼泊尔桤木为高大乔木ꎬ 株高均大
于 3 mꎬ 且林冠稀疏ꎬ 因此单作及与尼泊尔桤木间
作下的滇龙胆生境光照条件充足ꎻ 茶树低矮ꎬ 株高
低于 1􀆰 5 mꎬ 核桃树株高虽有 2~3 mꎬ 但枝叶稠
密ꎬ 这 2种间作模式林下光照条件较差ꎮ 对这 4种
栽培系统滇龙胆活性成分测定结果显示ꎬ 滇龙胆单
作及与尼泊尔桤木间作植株茎、 叶有效成分总含量
较高ꎬ 与核桃、 茶树间作的植株茎、 叶有效成分总
含量较低ꎮ 对植物萜类生物合成调控的研究显示ꎬ
萜类合酶的表达与相关化学成分的积累受光照条件
影响[27]ꎮ 本研究不同栽培系统滇龙胆植株龙胆苦
苷和当药苷含量变化也同样与生境、 光照条件不同
有关ꎮ 有研究表明ꎬ 温度和土壤水分也可影响植物
代谢产物的合成[36]ꎻ 不同温度条件可引起马铃薯
(Solanum tuberosum L.)叶片和块茎中化学成分
含量发生变化[37]ꎻ 长期、 持续干旱胁迫可抑制葡
萄(Vitis vinifera L.)叶片和根系中酚类成分的合
成[38]ꎻ 温度和水分是导致不同生长期滇龙胆中萜
类成分含量发生变动的重要因素ꎬ 且不同部位对温
度、 水分变化的响应程度不同[22]ꎻ 单作和林木间
作等不同模式ꎬ 其林下温度和土壤水分可发生变
化[39]ꎮ 这此因素也可能导致滇龙胆茎、 叶化学成
分的含量差异ꎮ
3􀆰 3  农林复合系统滇龙胆茎叶整体化学计量特征
研究
化学指纹图谱具有特征性强、 模糊性等特
点[40]ꎬ 可对植物中已知和未知成分进行评价ꎬ 综
合反映植物中化学成分的整体变化[41]ꎮ Khairudin
等[42]对小蓼(Polygonum minus Huds.)红外光谱
指纹图谱研究发现ꎬ 生长于丘陵和低地的小蓼种群
光谱指纹图谱具有差异ꎬ 结合 PCA 分析可对不同
种群植株进行区分ꎮ Song 等[41]建立当归(Angeli ̄
ca sinensis (Oliv.) Diels)栽培植株色谱指纹图谱ꎬ
结合多变量分析发现ꎬ 色谱峰峰面积在温度、 海
拔、 光照、 水分等条件影响下发生变化ꎻ 不同栽培
环境下当归整体化学计量特征具有差异ꎮ 本研究对
滇龙胆指纹图谱数据处理并结合多变量分析显示ꎬ
植株相同部位样品化学成分种类相似ꎬ 峰面积不
同ꎬ 但仅以马钱苷酸、 獐牙菜苦苷、 龙胆苦苷和当
药苷含量难以对不同栽培系统进行正确区分ꎮ 以不
同部位 HPLC 指纹图谱色谱峰峰面积为变量ꎬ 建
立 PLS ̄DA判别模型ꎬ 发现茎、 叶整体化学计量特
征具有明显差异ꎮ 单作及林药间作系统的样品被区
分为不同类群ꎬ 表明间作模式对滇龙胆茎、 叶化学
成分含量有影响ꎬ 且间作培模式对叶片化学成分的
影响大于茎ꎮ 叶片样品化学计量特征按不同栽培系
统被区分为 4类ꎮ 结合 VIP分析结果ꎬ 推测不同栽
培系统主要对滇龙胆茎、 叶样品 11 min 后出峰的
大量未知成分有影响ꎮ
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(责任编辑: 张 平)
184  第 4期                        沈 涛等: 农林复合系统滇龙胆茎叶化学计量特征研究