全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21 (3) : 262～ 266
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
不同提取剂对麦醇溶蛋白提取效果的电泳比较
邵锦震1, 2, 邱昌恩2, 丁 毅1Ξ
(1. 武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉　430072; 2. 湖北师范学院生物系, 黄石　435002)
摘　要: 以大麦、小麦品种为材料, 分别采用醇溶蛋白提取剂乙醇、乙二醇、22氯乙醇、22巯基乙醇、尿素等配成不同
浓度的单一组分提取剂和复合提取剂, 在同一条件下提取大麦和小麦去胚种子的醇溶蛋白, 通过 A 2PA GE 分离样
品液发现, 单一组分提取剂中 25% 的 22氯乙醇效果较好, 5% 的 22巯基乙醇效果较差; 复合提取剂中由 22氯乙醇和
22巯基乙醇组成的提取剂效果最好。这种复合提取剂制备的样品液经电泳后, 在图谱中条带丰富, 带型清晰, 无论
对大麦还是小麦种子, 都是最佳的醇溶蛋白提取剂。
关键词: 大麦醇溶蛋白; 小麦醇溶蛋白; 提取剂; 电泳图谱
　　中图分类号: Q 946. 1　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2003) 0320262205
Com par ison of the Effect of D ifferen t Extractan ts
on Horde in and Gl iad in Extraction by A -PAGE
SHAO J in2Zhen1, 2, Q IU Chang2En1, D IN G Y i1Ξ
(1. K ey L abora tory of M O E f or P lan t D evelopm en ta l B iology , W uhan U niversity , W uhan　430072, Ch ina;
2. D ep artm en t of B iology , H ubei N orm a l Colleg e, H uangsh i　435002, Ch ina)
Abstract: T he alcoho l2so lub le p ro tein s (ho rdein s from barley, g liad in s from w heat) w ere ex tract2
ed from the em b ryo2removed seeds of fou r barley cu lt ivars (H ord eum vu lg a re L. ) and th ree
w heat cu lt ivars (T riticum aestivum L. ) w ith differen t ex tract ing so lven ts. T he resu lts revealed
that the ex tract ion of ho rdein s and gliad in s w as mo st eff icien t w ith ex tract ion so lu t ion compo sed
of the 22ch lo roethano l (25% ) and 22m ercap to thano l (1% ). U sing th is ex tractan t, mo re ho rdein
o r g liad in p ro tein bands cou ld be reso lved by po lyacrylam ide gel electropho resis under acid pH
condit ion.
Key words: Ho rdein; Gliad in; Ex tract ion so lu t ion; E lectropho regram s
　　醇溶蛋白是麦类作物种子胚乳中一类不具酶功
能、能溶解于醇类的蛋白质。近年来的研究表明, 麦
醇溶蛋白具有丰富的遗传多样性, 在品种间存在明
显差异, 其电泳图谱上的条带数和组合方式受基因
组成的控制, 一般不受环境影响, 因此麦醇溶蛋白电
泳图谱被称为品种的生化“指纹”[1, 2 ]。
在农业生产和种子贸易领域, 建立良种繁殖与
生产的标准体系和种子质量监控体系, 对于我国农
业生产有重要意义。过去主要依靠形态性状对不同
品种进行鉴别和分类, 因形态性状易受环境条件和
地域差异等因素影响, 作为标记可靠性不强, 而且作
物品种形态性状不能用于种子贸易中的品种鉴
定[3 ]。因此, 以种子醇溶蛋白酸性聚丙烯酰胺凝胶电
泳 (A 2PA GE)图谱作为鉴定麦类作物品种的真伪和
纯度的方法, 已受到人们的重视。使用该方法的前提
条件是选用适宜的醇溶蛋白提取剂, 作为品种真实Ξ 收稿日期: 2002210215, 修回日期: 2003205211。基金项目: 国家自然科学基金项目 (39670051) ; 教育部骨干教师计划项目。作者简介: 邵锦震 (1963- ) , 男, 副教授, 系主任, 现从事植物细胞与分子遗传学研究。通讯作者 (A utho r fo r co rrespondence)。
性标志的性状, 醇溶蛋白只有被充分地提取, 才能更
真实地反映品种的特征。但在提取剂的选取上不同
研究者采用的方法各不相同[4 7 ] , 这既不利于研究
结果的横向比较, 更不利于种子鉴定技术的标准化。
因此, 探索和筛选高效的醇溶蛋白提取剂就成为利
用电泳方法准确鉴定品种的一个重要因素。
我们以 4 个栽培大麦、3 个栽培小麦品种为材
料, 通过A 2PA GE 来分离比较不同提取剂制备的样
品液所获得的电泳图谱, 以期筛选和确立高效适宜
的醇溶蛋白提取剂, 为作物品种鉴定等相关工作积
累一些资料。
1　材料和方法
1. 1　试验材料
试验材料为 4 个栽培大麦 (H ord eum vu lg a re
L. ) 品 种: 浙 皮 1 号、鄂 皮 1 号、昌 都 青 稞
(ZDM 4675) 和Betzes 大麦; 3 个栽培小麦 (T riticum
aestivum L. )品种: 鄂恩 1 号、鄂麦 6 号和藏冬 4 号。
1. 2　试验方法
1. 2. 1　醇溶蛋白提取剂　各种提取剂均含 0105 g
甲基紫, 其它组分用量见表 1, 最后用蒸馏水定容至
100 mL。
表 1　不同提取剂各组分用量
T able 1　Componen ts of differen t ex tract ing so lven ts
单一组分提取剂
Extractan ts of single componen t
复合组分提取剂
Extractan ts of compound componen t
A. 12 g 尿素
　U rea (12% )
D. 25 mL 22氯乙醇和 6 g 尿素
　22ch lo roethano l (25% ) + urea (6% )
B. 5 mL 22巯基乙醇
　22m ercap toethano l (5% ) E. 1 mL 22巯基乙醇和 6 g 尿素　U rea (6% ) + 22m ercap toethano l (1% )
C. 25 mL 22氯乙醇
　22ch lo roethano l (25% ) F. 25 mL 22氯乙醇和 1 mL 22巯基乙醇　22ch lo roethano l (25% ) + 22m ercap toethano l (1% )
H. 70 mL 乙醇
　E thyl alcoho l (70% )
G. 25 mL 22氯乙醇、1 mL 22巯基乙醇和 6 g 尿素
　22ch lo roethano l (25% ) + 22m ercap toethano l (1% ) + urea (6% )
I. 100 mL 乙二醇原液
　E thylene glyco l (100% )
J. 35 mL 乙醇和 50 mL 乙二醇
　E thyl alcoho l (35% ) + ethylene glyco l (50% )
1. 2. 2　其它溶液的配制　参照D raper S R (1987)
的方法[2 ]。
1. 2. 3　醇溶蛋白的提取　取单粒种子, 去胚, 锤碎
至粉末状, 转移到 115 mL Eppendo rf 管中, 加入提
取液 0. 3 mL , 于 4℃提取 24 h, 在 8 000 röm in 下离
心 10 m in, 取上清液备用。
1. 2. 4　制胶、加样和电泳　 方法同文献[ 2 ]。
1. 2. 5　染色和照相　方法同文献[ 2 ]。
2　结果与分析
2. 1　不同提取剂对大麦种子醇溶蛋白提取效果的
电泳比较
在同一提取条件下, 用不同提取剂A、B、C、D、
E、F、G、H、I、J (提取剂组分及浓度见 11211, 制备的
样品液在电泳图谱中对应泳道为A ′、B′、C′、D′、E′、
F′、G′、H′、I′、J′, 下同)对浙皮 1 号种子进行提取, 制
备的样品液经电泳分离后获得的醇溶蛋白图谱 (图
1) 显示, F′和 G′泳道醇溶蛋白条带数最多, 为 12
条; 其次是C′和D′泳道, 条带数为 9 条。泳道B′未
呈现任何蛋白谱带, 说明单一组分提取剂中 5%
22巯基乙醇提取效果较差。按照颜启传等对大麦醇 溶蛋白图谱条带的分区方法[1 ] , 可观察到 E′泳道的É 区和Ê 区各呈现 1 和 2 条很浅的条带, Ë 区无谱图 1　不同提取剂对浙皮 1 号种子提取的醇溶蛋白样品液的电泳图谱F ig11　Ho rdein electropho regram of Zhe P i21in differen t ex tract ion so lu tion
362　第 3 期　　　　　　　　　　　　邵锦震等: 不同提取剂对麦醇溶蛋白提取效果的电泳比较
带出现, 说明复合提剂中尿素和 22巯基乙醇组成的
提取剂效果较差。从H′、I′、J′泳道可见, 带纹集中在
高分子量的醇溶蛋白É 区, Ê 区和Ë 区无条带, 且带
型较差, 说明 70% 乙醇, 乙二醇原液以及由此组成
的复合提取剂效果欠佳。A ′泳道底色重, 条带与泳
道反差小, 说明 12% 的尿素也不是合适的提取剂。
从图 1 还可看出, F 和 G 两种提取剂对浙皮 1
号种子的醇溶蛋白提取效果相同, 而且在此复合组
分提取剂中条带最为清晰。C ( ISTA 标准提取剂, 下
同) 和D 效果也相同, 但条带清晰度明显不如 F 和
G 的好。C 和D 与 F 和 G 之间的差别在于后两种提
取剂制备的样品液在泳道 F′和 G′的É 区位置
44 mm 处、Ê 区 80 mm 和 85 mm 处、Ë 区 110 mm
处比前两种提取剂制备的样品液所在泳道 (C′和
D′) 相应区域各增加 1、2、1 条深带 (图 1 中箭头所
示)。说明 F 和 G 两种提取剂不仅对浙皮 1 号种子
醇溶蛋白提取的组分多, 而且对同一蛋白组分提取
的数量也有增加。
根据不同提取剂对 ZDM 4675 (昌都青稞)、鄂皮
1 号和Betzes 大麦种子醇溶蛋白提取的样品液在电
泳图谱 (图片未列出) 上条带数统计结果 (表 2) 可
知, 在供试的所有大麦品种中, F 和 G 两种提取剂
提取效果基本相同, 提取的组分最多, C 和D 两种
提取剂提取效果亦基本相同, 提取的蛋白组分次之,
其它提取液对上述 3 个品种种子醇溶蛋白提取效果
类似于浙皮 1 号, 样品液在电泳图谱中带型类似于
图 1。
表 2　不同提取剂对大麦种子醇溶蛋白的提取效果 (电泳图谱条带数)
T ab le 2　Effect of differen t ex tract ion so lu tions w ith the ho rdeins of barley
(num ber of bands in the electropho regram s)
品种　Cultivars
提取剂3 　Extraction so lu tion
A B C D E F G H I J
浙皮 1 号 (Zhe P i21) 8 0 9 9 3 12 12 7 7 7
ZDM 4675 3 0 12 12 6 15 15 9 9 9
鄂皮 1 号 (E P i21) 4 1 9 9 5 10 10 5 5 5
Betzes 4 0 6 6 2 9 9 5 5 53 提取剂A～ J 同表 1 (Extraction so lu tion A～ J are the sam e of T ab le 1)。
2. 2　不同提取剂对小麦种子醇溶蛋白提取效果的
电泳比较
从图 2 可见, 鄂恩 1 号种子经不同提取剂提取
的样品液电泳后, 在电泳图谱上 F′和 G′泳道条带数
量最多, 均为 31 条; 其次是C′和D′泳道, 条带数为
19 条, 说明提取剂 F、G 对鄂恩 1 号种子醇溶蛋白提
取效果最好, C、D 提取效果次之。A ′泳道底色重, 根
据小麦醇溶蛋白图谱条带的分区方法[8 ] , 可观察到Ξ和 4 区有 3 和 5 条带, 但在 Β、Α区条带不清晰。泳
道B′、E′、H′、I′、J′仅在 Ξ和 4 高分子量醇溶蛋白区
呈现一定数量蛋白条带, 在低分子量的 Β和 Α区则
无条带出现。可见这 6 种提取液的提取效果较差, 类
似于对大麦浙皮 1 号种子的提取效果。
图 2 中C′、D′泳道条带一一对应, 可见, C、D 两
种提取液提取的蛋白组分基本相同。同样, F、G 两
种提取剂亦如此。上述结果说明C 与D 之间、F 与
G 之间对小麦鄂恩 1 号种子醇溶蛋白的提取效果也
不存在明显差异。以C′和 F′两泳道为例比较可知,
在 Ξ 区, F′泳道在 20 mm 处增加 1 深带 (图 2 中箭
头所示) , 深带数由C′泳道的 2 条增加到 3 条, 同时
增加了 9 条浅带。在 4 区, C′泳道在 33 mm 处为浅
带, 但在F′泳道中变为深带 (图2中箭头所示) ; 另
图 2　不同提取剂对鄂恩 1 号种子醇溶
蛋白提取的样品液的电泳图谱
F ig12　Gliadin electropho regram of Een21 in
differen t ex tract ion so lu tion
462 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　　
外, F′泳道在 42、45 mm 处增加 2 条浅带。在 Β区,
F′泳道在 52 mm 处增加 1 条深带 (图 2 中箭头所
示)。在 Α区, 2 个泳道条带则基本相同。可见, 提取
剂 F 和 G 对鄂恩 1 号种子醇溶蛋白提取的组分比
提取剂C 和D 的多, 且对同一组分提取的量也有增
加。
不同提取剂对鄂麦 6 号和藏冬 4 号种子醇溶蛋
白提取效果类似于对鄂恩 1 号的提取效果 (表 2)。
提取剂 F 和 G 效果最好, 在高分子量 Ξ区和 4 区提
取的蛋白组分比C、D 提取剂多, 且对同一组分提取
的数量亦有增加, 表现在C′、D′泳道中浅带在 F′、G′
泳道中对应位置变为深带。其它提取剂效果较差, 相
应泳道或是条带少, 带型较差; 或是泳道底色重, 反
差小, 不便于观察 (图片略)。
表 3　不同提取剂对小麦种子醇溶蛋白的提取效果 (电泳图谱中条带数)
T ab le 3　Effect of differen t ex tract ion so lu tions w ith the gliadins of w heat
(num ber of bands in the electropho regram s)
品种　Cultivars
提取剂3 　Extraction so lu tion
A B C D E F G H I J
G 鄂恩 1 号 (Een21) 12 9 19 19 9 31 31 9 10 11
鄂麦 6 号 (Em ai26) 9 5 14 14 9 30 30 3 8 0
藏冬 4 号 (Zangdong24) 4 3 19 19 6 36 36 2 17 43 提取剂A～ J 同表 1 (Extraction so lu tion A～ J are the sam e of T ab le 1)。
3　讨论
在提取液用量和同一提取条件下, 不同提取剂
对各供试大麦、小麦种子醇溶蛋白提取的样品液经
电泳比较可知, 在单一组分的 5 种提取剂 (A、B、C、
H、I) 中, 国际种子检验协会 ( ISTA ) 推荐使用的
25% 22氯乙醇提取的醇溶蛋白组分最多, 而且提取
的样品液经电泳后在图谱上带型清晰, 而 5% 22巯
基乙醇效果较差。
从醇溶蛋白概念上来理解, 用尿素溶液提取的
蛋白并非就是醇溶蛋白, 但鉴于一些资料[9, 10 ]以尿
素溶液提取的麦粒种子贮藏蛋白作为醇溶蛋白, 因
此本研究仍沿用尿素作为醇溶蛋白提取剂, 便于与
其它醇溶蛋白提取剂的提取效果及前人研究作统一
比较。
复合提取剂D (100 mL 25% 22氯乙醇中含有
6 g尿素)是在单一提取剂C (25% 22氯乙醇) 的基础
上添加了 6 g 尿素, 从图 1 和图 2 及表 1 和表 2 可
见, C、D 两种提取剂对所有供试材料种子醇溶蛋白
提取的组分数量和样品液在电泳图谱中带型完全一
致, 由此推断, 复合提取剂D 中添加尿素与单一提
取剂 25% 22氯乙醇并无区别。
从图 1 和图 2 中 H′、I′、J′泳道可看出, 不含巯
基乙醇的提取剂H、I、J 所提取的蛋白质分子量比含
有巯基乙醇的提取剂 (F 和 G) 提取的蛋白质分子量
大。如果含有巯基乙醇的提取剂对应泳道小分子量
蛋白质带纹的出现是由于亚基解离的结果, 则 F′和
G′泳道无论是在高分子量带纹区, 还是在低分子量
带纹区均应为浅带, 而不是深带。而实际结果是, F′
和 G′泳道在高、低分子量蛋白质带纹区均为深带,
因此, 似可排除巯基乙醇对高分子量蛋白质的解离
作用。
从上述讨论可知, 复合提取剂 G (100 mL 25%
22氯乙醇中含 6 g 尿素和 1 mL 22巯基乙醇) 由于在
复合提取剂D 的基础上添加了 22巯基乙醇, 结果增
加了对所有供试材料种子醇溶蛋白的提取数量, 并
且对同一蛋白组分提取的量亦有增加, 表现为电泳
图谱中对应条带由浅带变为深带 (图 1、图 2)。可见
添加 22巯基乙醇增加了提取剂的提取效果。
进一步分析比较可知, 复合提取剂 F (100 mL
25% 22氯乙醇中含 1 mL 22巯基乙醇) 中不含尿素,
但效果与 G 完全一致, 因此, 复合提取剂 G 中添加
尿素似无必要, 增加提取剂提取效果的是 22巯基乙
醇。
综上所述, 复合提取剂 F (100 mL 25% 22氯乙
醇中含 1 mL 22巯基乙醇) 无论对大麦还是小麦种
子醇溶蛋白都是最佳提取剂, 由 F 制备的样品液在
电泳图谱中带型清晰, 条带丰富。
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662 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷