全 文 ：书植物科学学报 ２０１３，３１（２）：１７８～１８５
ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅＪｏｕｒｎａｌ
ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１１４２．２０１３．２０１７８
嗜热藻 ＢＰ１中几个蓝细菌光敏色素结构域体内
重组及光化学性质研究
刘冰冰１，陈 煜２，邓明刚３，赵开弘３，周 明３
（１．华中农业大学生命科学技术学院，武汉４３００７０；２．华中科技大学环境科学与工程学院，武汉 ４３００７４；
３．华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉４３００７０）
摘 要：通过蛋白质序列同源性比对分析，在嗜热藻（ＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｅｌｏｎｇａｔｕｓＢＰ１）里面找到了与已知
的Ｐｂ／Ｐｇ型蓝细菌光敏色素ＴｅＰｉｘＪ和ＴｅＴｌｒ０９２４同源的３个基因ｔｌｒ０９１１、ｔｌｒ１２１５和ｔｌｒ１９９９。通过分子克隆技术
把它们的ＧＡＦ结构域分别构建在 ｐＥＴ３０ａ（＋）表达载体上，与可生成藻蓝胆素（ＰＣＢ）的质粒 ｐＡＣＹＣＤｕｅｔｈｏ１
ｐｃｙＡ在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）体内重组，生成重组蛋白，利用亲和层析柱分离纯化，纯化后的蛋白质经过锌荧光和
蛋白质酸性尿素变性以及荧光光谱和吸收光谱等实验分析鉴定，结果表明，Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ存在蓝光吸收态 Ｐｂ４０６ｎｍ
和绿光吸收态Ｐｇ５２７ｎｍ之间的可逆光转换，它可共价结合两种藻胆色素，即藻紫胆素（ＰＶＢ）和藻蓝胆素（ＰＣＢ），
Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ则存在蓝光吸收态 Ｐｂ４１７ｎｍ和青光吸收态 Ｐｔ４９６ｎｍ之间的可逆光转换，它同样共价结合 ＰＶＢ和 ＰＣＢ，
而Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ１和Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ２不能自发结合藻胆色素，不具有光活性。
关键词：蓝细菌光敏色素；可逆光转换；体内重组
中图分类号：Ｑ７１ 文献标识码：Ａ 文章编号：２０９５０８３７（２０１３）０２０１７８０８
ＲｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｉｎｖｉｖｏａｎｄＰｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＳｅｖｅｒａｌ
ＣｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｒｏｍｅＤｏｍａｉｎｓｆｒｏｍＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ
ｅｌｏｎｇａｔｕｓＢＰ１
ＬＩＵＢｉｎｇＢｉｎｇ１，ＣＨＥＮＹｕ２，ＤＥＮＧＭｉｎｇＧａｎｇ３，ＺＨＡＯＫａｉＨｏｎｇ３，ＺＨＯＵＭｉｎｇ３
（１．ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７０，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｅｇｅｏｆ
ＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＨｕａｚｈｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｗｕｈａｎ４３００７４，Ｃｈｉｎａ；
３．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＨｕａｚｈｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＢｙｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎｃｅｈｏｍｏｌｏｇｙｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｗｉｔｈｔｈｅＰｂ／Ｐｇｔｙｐｅｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｏ
ｃｈｒｏｍｅＴｅＰｉｘＪａｎｄＴｅＴｌｒ０９２４，ｔｈｒｅｅｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｇｅｎｅｓｔｌｒ０９１１，ｔｌｒ１２１５ａｎｄｔｌｒ１９９９ｆｒｏｍ
ＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｅｌｏｎｇａｔｕｓＢＰ１ｗｅｒｅｆｏｕｎｄ．Ｂｙｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｔｈｅＧＡＦ
ｄｏｍａｉｎｓｏｆｔｈｏｓｅｇｅｎｅｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ３０ａ（＋），ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅＥ．
ｃｏｌｉｓｔｒａｉｎＢＬ２１（ＤＥ３）ｈａｒｂｏｒｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄａｎｄｔｈｅｐＡＣＹＣＤｕｅｔｈｏ１ｐｃｙＡｐｌａｓ
ｍｉｄｆｏｒｐｈｙｃｏｃｙａｎｏｂｉｌｉｎ（ＰＣＢ）ｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｔｈｅｅｘ
ｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｈｉｓ）６ｔａｇｇｅｄａｔｔｈｅＮｔｅｒｍｉｎｕｓｗｅｒｅｐｕｒｉｆｉｅｄｗｉｔｈｎｉｃｋｅｌａｆｉｎｉｔｙＨｉｓＴｒａｐ
ｃｈｅｌａｔｉｎｇｃｏｌｕｍｎ．Ｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｗｉｔｈｚｉｎｃｉｎｄｕｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ａｃｉｄｉｃ
ｕｒｅａｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｕｍ．ＲｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴｌｒ０９１１ＧＡＦ
ｃｏｎｔａｉｎｅｄｔｗｏｃｏｖａｌｅｎｔｌｙｂｏｕｎｄｂｉｌｉｎｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅｓ，ｐｈｙｃｏｖｉｏｌｏｂｉｌｉｎ（ＰＶＢ）ａｎｄｐｈｙｃｏｃｙａｎｏ
ｂｉｌｉｎ（ＰＣＢ），ａｎｄｅｘｈｉｂｉｔｅｄｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｐｈｏｔｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎａｂｌｕｅａｂｓｏｒｂｉｎｇｆｏｒｍ ａｔ
４０６ｎｍ（Ｐｂ４０６ｎｍ）ａｎｄａｇｒｅｅｎａｂｓｏｒｂｉｎｇｆｏｒｍａｔ５２７ｎｍ（Ｐｇ５２７ｎｍ）．Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦｗａｓａｌｓｏ
ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙｂｏｕｎｄｗｉｔｈＰＶＢａｎｄＰＣＢ，ａｎｄｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｐｈｏｔｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｅｘｉｓｔｅｄｂｅｔｗｅｅｎａｂｌｕｅ
收稿日期：２０１２０７０６，修回日期：２０１２１１１９。
基金项目：国家自然科学基金资助项目（２１０７２０６８；３１１１０１０３９１２）。
作者简介：刘冰冰（１９８７－），女，河南三门峡人，硕士研究生，主要从事蓝细菌光合作用和蛋白质工程研究。
通讯作者（Ａｕｔｈｏｒｆｏｒｃｏｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ．Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｕｍｉｎｇ３２１＠１２６．ｃｏｍ）。
ａｂｓｏｒｂｉｎｇｆｏｒｍａｔ４１７ｎｍ（Ｐｂ４１７ｎｍ）ａｎｄａｔｅａｌａｂｓｏｒｂｉｎｇｆｏｒｍａｔ４９６ｎｍ（Ｐｔ４９６ｎｍ）．Ｎｅｉｔｈｅｒ
Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ１ｎｏｒＴｌｒ１２１５ＧＡＦ２ｃｏｕｌｄｂｅｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙｂｏｕｎｄｗｉｔｈｂｉｌｉｎｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｒｏｍｅ；Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅｐｈｏｔｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ；ＡｓｓｅｍｂｌｙｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ
植物光敏色素是一种光感受器，它是一种含有
线性四吡咯生色团的水溶性蛋白质，存在两种不同
的形态：红光吸收形态（Ｐｒ）和远红光吸收形态
（Ｐｆｒ）［１］。植物光敏色素的这两种光形态可以发生
可逆光转换，它调节植物体内一系列的生理反
应［２］。在细菌中也发现了与植物光敏色素相似的
蛋白质［３］。
近年来更多的植物光敏色素的远缘族群已经被
分离出来，蓝细菌光敏色素是一类最近被鉴定可以
感受多种不同波长光线的光受体家族，它只存在于
蓝细菌内［４］。植物光敏色素 Ｎ末端的光受体组件
包括ＰＡＳ（ｐｅｒ／ＡＲＮＴ／ｓｉｍ）结构域，ＧＡＦ（ｃＧＭＰ磷
酸二酯酶／腺苷酸环化酶／ＦｈｌＡ蛋白）结构域和ＰＨＹ
（光敏色素亚结构域）结构域［５］。而蓝细菌光敏色
素特殊光响应的发生只需要与植物光敏色素近缘的
ＧＡＦ结构域［６］。
蓝细菌光敏色素存在相当多变的光谱特性，它
们的光谱变化几乎覆盖了近紫外和可见光区［４］。
在体外，第一个被发现具有蓝光吸收态（Ｐｂ）和绿光
吸收态（Ｐｇ）之间的可逆光转换的蓝细菌光敏色素是
ＳｙＰｉｘＪ１，它是一个蓝光趋化调节子，随后Ｐｂ／Ｐｇ型
的蓝细菌光敏色素开始被集中研究，例如 ＳｙＰｉｘＪ１、
ＴｅＰｉｘＪ和ＴｅＴｌｒ０９２４的研究［６－９］。这３种蛋白显示
出一个新奇的处在 Ｐｂ态（蓝光吸收峰在 ４２５～
４３５ｎｍ）和Ｐｇ态（绿光吸收峰在５３１～５３５ｎｍ）之间
的可逆光转换。同时蓝细菌光敏色素也可能涉及到
昼夜节律和细胞聚集的光感应重新组合［１０］。
本实验主要集中研究嗜热的嗜热藻（Ｔｈｅｒｍｏ
ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｅｌｏｎｇａｔｕｓＢＰ１），通过和已知的
Ｐｂ／Ｐｇ型蓝细菌光敏色素 ＴｅＰｉｘＪ和 ＴｅＴｌｒ０９２４进
行同源比对，找出了和它们具有同源性的两个可能
的蓝细菌光敏色素 Ｔｌｒ０９１１和 Ｔｌｒ１９９９，而 Ｔｌｒ１２１５
和这两个可能的蓝细菌光敏色素具有同源性。因此
取这３个基因的ＧＡＦ结构域在体外构建质粒，与可
生成藻蓝胆素（ＰＣＢ）的质粒 ｐＡＣＹＣＤｕｅｔｈｏ１
ｐｃｙＡ在大肠杆菌体内重组，生成重组蛋白，然后通
过荧光发射光谱、吸收光谱、ＳＤＳＰＡＧＥ等方法，对
重组蛋白的光化学特性和生物学特性进行分析鉴
定。蓝细菌光敏色素的研究对了解光敏色素及光敏
色素类似蛋白的进化关系有着重要的意义。
１ 材料和方法
１．１ 材料与试剂
大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）菌株 ＢＬ２１（ＤＥ３）
为本实验室保存；表达载体 ｐＥＴ３０ａ（＋）、ｐＡＣＹＣ
Ｄｕｅｔ１购自Ｎｏｖａｇｅｎ公司；重组质粒ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ
ｈｏ１ｐｃｙＡ由本实验室构建保存；ＤＮＡ回收试剂盒、
Ｔ４ＤＮＡ连接酶和限制性内切酶 ＢａｍＨⅠ、ＥｃｏＲⅠ、
ＨｉｎｄⅢ、ＳａｌⅠ为 ＭＢＩ公司产品。Ｔａｑ酶为 Ｂｉｏｓｔａｒ
公司产品；ＩＰＴＧ是 ＳＩＧＭＡ公司产品；亲和层析介
质购自 ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｍａｃｉ公司。嗜热藻（Ｔｈｅｒ
ｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓｅｌｏｎｇａｔｕｓＢＰ１）由中国科学院
化学研究所赵井泉老师赠予。引物合成以及测序由
南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
１．２ 结构域分析
通过 ＳＭＡＲＴ（ｈｔｐ：／ｓｍａｒｔ．ｅｍｂｌｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．
ｄｅ／）确定 Ｔｌｒ０９１１、Ｔｌｒ１２１５和 Ｔｌｒ１９９９这３个假定
的蓝细菌光敏色素的结构域构成［１１］。运用 Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｘ１８３软件对它们和 ＴｅＰｉｘＪ、ＴｅＴｌｒ０９２４的同源性
进行比对分析。
１．３ 引物设计和合成
以嗜热藻（Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓＢＰ１）基因组 ＤＮＡ序
列为模板，设计克隆引物（见表１）。在上下游引物的
表１ 本实验中设计的引物
Ｔａｂｌｅ１ Ｐｒｉｍｅｒｓｄｅｓｉｇｎｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ
ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ Ｐ３：５′ＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＣＴＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣ３′
Ｐ４：５′ＡＴＡＧＴＣＧＡＣＴＴＡＴＴＣＣＴＧＡＴＧＴＡＧＣＧＣ３′
ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ１Ｐ５：５′ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＧＧＡＧＡＴＴＴＴＧ３′
Ｐ６：５′ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＣＴＡＡＣＴＴＴＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧ３′
ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ２Ｐ７：５′ＣＡＡＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＴＴＣＧＣＣＡＡＡＣＣＣＴＧ３′
Ｐ８：５′ＣＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＣＡＣＣＴＧＡＧＴＣＧＣ３′
ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ Ｐ９：５′ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＴＣＣＴＡＡＣＣＴＧＣＴＧ３′
Ｐ１０：５′ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＧＧＧＴＡＡＡＴＧＧＧＴ３′
注：表中带下划线的碱基序列为添加的限制性内切酶的酶切位点。
Ｎｏｔｅ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓｉｔｅｓａｒｅｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ．
９７１ 第２期 刘冰冰等：嗜热藻ＢＰ１中几个蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究
５′端分别引入不同的限制性内切酶位点以及３个保
护碱基。
１．４ 质粒的克隆和重组菌株的构建
来源于嗜热藻（Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓＢＰ１）的基因组总
ＤＮＡ作为模板，用表１中相应的引物分别采用降落
ＰＣＲ扩增出目的片段，然后将合成片段直接连接到
表达载体ｐＥＴ３０ａ（＋），转化到大肠杆菌 ＢＬ２１感受
态细胞，在含有卡那霉素的平板上筛选阳性克隆子。
根据质粒酶切图谱初步确定阳性克隆子后，将初步
鉴定正确的菌种进行测序。
质粒 ｐＡＣＹＣＤｕｅｔｈｏ１ｐｃｙＡ中的两个基因的
表达产物为血红素氧化酶和胆绿素还原酶，在这两
种酶的作用下，大肠杆菌体内的血红素被逐步催化
生成ＰＣＢ。
将表达载体 ｐＥＴｔｌｒ０９１１ＧＡＦ、ｐＥＴｔｌｒ１２１５
ＧＡＦ１、ｐＥＴｔｌｒ１２１５ＧＡＦ２和 ｐＥＴｔｌｒ１９９９ＧＡＦ分
别与可以产生 ＰＣＢ的质粒 ｐＡＣＹＣＤｕｅｔｈｏ１ｐｃｙＡ
共同转化到大肠杆菌 ＢＬ２１感受态细胞，用含有卡
那霉素和氯霉素的平板筛选重组菌株。
１．５ 在大肠杆菌中蛋白质的表达和提纯
表达载体ｐＥＴ３０ａ（＋）的Ｔ７启动子下游含有６
个组氨酸的密码子，由此构建的质粒在大肠杆菌中
诱导表达得到的外源融合蛋白 Ｎ端都带有 Ｈｉｓｔａｇ
标签，故可采用镍离子亲和层析法进行提纯。
将重组菌株接种在含有２０μｇ／ｍＬ卡那霉素和
２０μｇ／ｍＬ氯霉素的３００ｍＬＬＢ培养基中，３７℃培
养至ＯＤ６００ｎｍ ＝０５～０６，置于冰水混合物里冰浴
３０～６０ｍｉｎ，加入终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ的 ＩＰＴＧ，摇
床转速设置为１５０ｒ／ｍｉｎ，在黑暗条件下２０℃诱导
表达１２ｈ。离心５ｍｉｎ（６５００ｒ／ｍｉｎ，４℃）收集细
胞，蒸馏水洗涤细胞２次，尽可能洗去残留的培养
液，然后用５ｍＬＳｔａｒｔＢｕｆｅｒ缓冲液（５００ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ，２０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液，ｐＨ７２）重悬细胞，
用超声波细胞破碎仪超声破碎１００次（功率２００Ｗ），
细胞匀浆离心３０ｍｉｎ（１００００ｒ／ｍｉｎ，４℃）得到澄净
的上清液。将重组蛋白上清液加入镍离子亲和层析
柱，先用３倍柱体积的 ＳｔａｒｔＢｕｆｅｒ平衡层析柱，然
后采用含５０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑的Ｂｕｆｅｒ洗脱杂蛋白，最
后收集重组蛋白采用含５００ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑的Ｂｕｆｅｒ。
提纯产物用透析液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钾缓冲液，
５００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，ｐＨ７２）透析过夜，以去除咪
唑，消除咪唑对重组蛋白的影响。
１．６ 重组蛋白ＳＤＳＰＡＧＥ和锌荧光实验
从提纯的蛋白质溶液中取出２０
!
Ｌ，按照１∶１
的比例向蛋白质样品中加入上样缓冲液和巯基乙醇
（９∶１），混合均匀后，置１００℃沸水中煮沸１０ｍｉｎ，
制成聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳＰＡＧＥ）蛋白质样
品。电泳前，要先将样品离心３０ｍｉｎ（９０００ｒ／ｍｉｎ，
４℃），弃沉淀取上清液，用１２％的分离胶进行ＳＤＳ
ＰＡＧＥ。因要做锌荧光实验，将蛋白胶置于１５ｍｏｌ／
Ｌ醋酸锌溶液里至被浸末，室温黑暗中染色５ｍｉｎ
后，用 Ｂｉｏｒａｄ电泳凝胶成像系统分析并照相。醋
酸锌染色完成之后改用考马斯亮蓝 Ｒ２５０染色，脱
色完全后用凝胶成像系统分析并照相。
１．７ 光谱分析
采用ＤＵ８００紫外可见光谱仪测取吸收光谱，
狭缝宽度为１０ｎｍ，扫描速度为８００ｎｍ／ｍｉｎ，扫
描范围是 ２００～８００ｎｍ。荧光光谱采用 Ｐｅｒｋｉｎ
ＥｌｍｅｒＬＳ５５型荧光光谱仪测定，狭缝宽度为
１００ｎｍ，扫描速度为 １０００ｎｍ／ｍｉｎ，扫描范围是
３００～８００ｎｍ。
在蓝光照射时，是来自卤素灯的光线透过一个
λｍａｘ＝４２０ｎｍ、半带宽 ＝７５ｎｍ的干涉滤光器。
在青光照射时，是来自卤素灯的光线透过一个λｍａｘ＝
５１０ｎｍ、半带宽＝７５ｎｍ的干涉滤光器。在绿光照
射时，是来自卤素灯的光线透过一个λｍａｘ＝５６０ｎｍ、
半带宽＝７５ｎｍ的干涉滤光器。在红光照射时，
是来自卤素灯的光线透过一个 ＞６１０ｎｍ的截止型
滤光器。
１．８ 重组蛋白变性实验
为了确定重组蛋白结合藻胆色素的种类，需要
进行酸性尿素（８ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ２０）变性实验。在变
性条件下，脱辅基蛋白和藻胆色素的结合松散，藻胆
色素基本上呈游离状态，重组蛋白的吸收光谱和游
离藻胆色素的吸收光谱很相似，可以从其吸收特征
峰的位置确定藻胆色素的种类。通常情况下，取
４００
!
Ｌ透析蛋白样品，加入０３６ｇ尿素和３２
!
Ｌ
的浓盐酸，充分混匀后，黑暗中４℃反应３０ｍｉｎ，离
心３０ｍｉｎ（９０００ｒ／ｍｉｎ，４℃），取上清液测其吸收
光谱。
２ 结果与分析
２．１ 蓝细菌光敏色素结构域分析
根据 ＳＭＡＲＴ模块分析结构域可知（见图１），
０８１ 植 物 科 学 学 报 第３１卷
Ｔｌｒ０９１１和 Ｔｌｒ１９９９均包括 １个蓝细菌光敏色素
ＧＡＦ结构域，而 Ｔｌｒ１２１５含有２个 ＧＡＦ结构域，将
氨基酸序列为 ２８～１８０位的 ＧＡＦ结构域命名为
Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ１，而将氨基酸序列为 ３２３～４７０位的
ＧＡＦ结构域命名为 Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ２。ＧＡＦ结构域作
为蓝细菌光敏色素的感光区域，其它的信号传导结
构域包括ＥＡＬ结构域、ＧＧＤＥＦ结构域、组氨酸激酶
（ＨｉｓＫＡ＋ＨＡＴＰＡｓｅ＿ｃ）结构域。
通过将 Ｔｌｒ０９１１、Ｔｌｒ１２１５和 Ｔｌｒ１９９９的 ＧＡＦ结
构域的氨基酸序列与已经发现的蓝细菌光敏色素
ＴｅＰｉｘＪ和 ＴｅＴｌｒ０９２４的氨基酸序列比对，发现
Ｔｌｒ０９１１和Ｔｌｒ１９９９的ＧＡＦ结构域均包括１个保守
的［Ｄ／Ｅ］ＸＣＦ模块和ＣＨ残基。
Tlr0911
Tlr1215
Tlr1999
GAF GGDEF EAL HisKA
HATPase_c
100 residue
图１ 根据ＳＭＡＲＴ模块分析得到的Ｔｌｒ０９１１、Ｔｌｒ１２１５和
Ｔｌｒ１９９９的结构域组成
Ｆｉｇ．１ ＤｏｍａｉｎａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｏｆＴｌｒ０９１１，Ｔｌｒ１２１５ａｎｄ
Ｔｌｒ１９９９ｏｂｔａｉｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｍｏｔｉｆ
ａｎａｌｙｓｉｓｂｙＳＭＡＲＴ
２．２ 克隆质粒构建和重组菌株表达的鉴定
参照１３和１４中实验方法构建得到的质粒
用设计引物时引入的限制性内切酶做双切检测，
质粒 ｐＥＴｔｌｒ０９１１ＧＡＦ、ｐＥＴｔｌｒ１２１５ＧＡＦ１、ｐＥＴ
ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ２和 ｐＥＴｔｌｒ１９９９ＧＡＦ酶切后得到的
片段理论大小依次为５１３、４３５、４２６、６６９ｂｐ，根
据质粒酶切图谱初步确定阳性克隆子，选定测序
正确的菌株。然后参照１４、１５和１６中的实验
方法，将重组菌株表达后，取１ｍＬ细胞制取蛋白质
样品，用ＳＤＳＰＡＧＥ分离检测，从考马斯亮蓝 Ｒ２５０
染色的结果可以直观地看到目的蛋白的表达。脱辅
基蛋白 Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ、Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ１、Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ２
和 Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的 大 小 分 别 为 ２４８５、２２０２、
２１７９、３１５８ｋＤ，聚丙烯酰胺凝胶电泳条带大小与
预期符合（图２）。
２．３ 重组蛋白的吸收光谱和荧光光谱分析
参照１．５中的实验方法，得到在大肠杆菌体内
诱导表达的重组蛋白。通过吸收光谱和荧光光谱检
1 2 3 4 M
66
45
36
29
24
19
kD
１．Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ细胞样品；２．Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ细胞样品；
３．Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ１细胞样品；４．Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ２细胞样品；Ｍ．
蛋白质标准分子量。
１．Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥ．ｃｏｌｉ；２．Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦｅｘ
ｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥ．ｃｏｌｉ；３．Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ１ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥ．ｃｏｌｉ；
４．Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ２ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥ．ｃｏｌｉ；Ｍ．Ｍａｒｋｅｒｐｒｏｔｅｉｎｓ．
图２ 细胞中重组蛋白的考马斯亮蓝染色电泳图
Ｆｉｇ．２ ＳＤＳＰＡＧＥｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ
ｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｃｅｌ
测各体内重组体系得到的重组蛋白，由其光谱特征
可判断重组蛋白的光学活性以及偶联色素的种
类等。
Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ从大肠杆菌细胞中提纯后，得到
可溶的均质的蛋白质溶液。纯化的Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ在
蓝光的照射下，它的吸收光谱有２个明显的吸收峰
（见图３：Ａ１），其最大吸收峰分别位于４０６ｎｍ和
５２７ｎｍ，这个光吸收状态被命名为 Ｐｇ５２７ｎｍ；当
Ｐｇ５２７ｎｍ被绿光照射后，最大吸收峰位于４０６ｎｍ处
的吸收峰值上升，而５２７ｎｍ处的吸收峰几乎消失，
这个光吸收状态被命名为 Ｐｂ４０６ｎｍ。在这２个光吸
收状态的吸收光谱中，在５９２ｎｍ处有１个小的吸
收峰，它不受光照的影响。在Ｐｂ／Ｐｇ型的蓝细菌光
敏色素 ＴｅＰｉｘＪ和 ＴｅＴｌｒ０９２４的吸收光谱中也检测
到１个光钝化峰。在 Ｐｇ５２７ｎｍ转换为 Ｐｂ４０６ｎｍ时，它
的吸收光谱在 ４０６ｎｍ处吸收值上升至最高，在
５２１ｎｍ处吸收值下降至最低（见图３：Ａ２中吸收
差减光谱）。Ｐｇ５２７ｎｍ共有２个荧光发射峰，其最大
荧光发射峰值分别位于５７２ｎｍ和６４８ｎｍ；Ｐｂ４０６ｎｍ
共有 ２个荧光发射峰，它有 １个位于 ５７２ｎｍ和
６３３ｎｍ的双荧光发射峰，此位置荧光发射峰的高
低随着吸收峰的高低变化而变化，而它位于６４８ｎｍ
的荧光发射峰与 Ｐｇ５２７ｎｍ的荧光发射峰高低几乎一
致（见图３：Ａ３中荧光发射光谱）。因此得出结论：
１８１ 第２期 刘冰冰等：嗜热藻ＢＰ１中几个蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究
0 3.
0 2.
0 1.
0 0.
A
b
s
o
r
p
t
i
o
n
300 400 500 600 700 800
Wavelength (nm)
406 nm
527 nm
592 nm
Pg
527 nm
Pb
406 nm
A-1
B-2
0 3.
0 2.
0 1.
0 0.
A
b
s
o
r
p
t
i
o
n
300 400 500 600 700 800
Wavelength (nm)
417 nm
415 nm
496 nm
612 nm
Pt
496 nm
Pb
417nm
B-1
Pb -minus-Pt
417 n 96 nm
m
4
0 16.
0 08.
0 00.
-0 16.
A
b
s
o
r
p
t
i
o
n
300 400 500 600 700 800
Wavelength (nm)
-0 08.
417 nm
496 nm
90
60
30
0
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e
500 600 700 800
Wavelength (nm)
563 nm
644 nm
Pt
496 nm
Pb
417 nm
Pt
496 nm
Pb
417 nm
180
120
60
0
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e
Wavelength (nm)
Pg
527 nm
Pb
406 nm
Pg
527 nm
Pb
406 nm
648 nm
572 nm
A-3
500 600 700 800
B-3
A
b
s
o
r
p
t
i
o
n
300 400 500 600 700 800
Wavelength (nm)
0 03.
0 00.
-0 03.
-0 06.
0 06.
521 nm
A-2
633 nm
Pb -minus-Pg
406 n nm
m
527
406 nm
Ａ１：Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ的吸收光谱；Ａ２：Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ的Ｐｂ４０６ｎｍ差减Ｐｇ５２７ｎｍ的吸收差减光谱；Ａ３：Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ的荧光发射
光谱；Ｂ１：Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的吸收光谱；Ｂ２：Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的Ｐｂ４１７ｎｍ差减Ｐｔ４９６ｎｍ的吸收差减光谱；Ｂ３：Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的荧光
发射光谱。
Ａ１：ＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｏｆＰｇ５２７ｎｍａｎｄＰｂ４０６ｎｍｏｆＴｌｒ０９１１ＧＡＦ；Ａ２：ＤｉｆｅｒｅｎｃｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆＰｂ４０６ｎｍｍｉｎｕｓ
Ｐｇ５２７ｎｍ ｏｆＴｌｒ０９１１ＧＡＦ；Ａ３：ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｍｉｓｓｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｏｆＰｇ５２７ｎｍ ａｎｄＰｂ４０６ｎｍ ｏｆＴｌｒ０９１１ＧＡＦ；Ｂ１：Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ
ｓｐｅｃｔｒａｏｆＰｔ４９６ｎｍａｎｄＰｂ４１７ｎｍｏｆＴｌｒ１９９９ＧＡＦ；Ｂ２：ＤｉｆｅｒｅｎｃｅａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆＰｂ４１７ｎｍｍｉｎｕｓＰｔ４９６ｎｍｏｆＴｌｒ１９９９
ＧＡＦ；Ｂ３：ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｍｉｓｓｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｏｆＰｔ４９６ｎｍ ａｎｄＰｂ４１７ｎｍ ｏｆＴｌｒ１９９９ＧＡＦ．
图３ Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ和Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的吸收光谱和荧光发射光谱
Ｆｉｇ．３ ＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｍｉｓｓｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｏｆＴｌｒ０９１１ＧＡＦａｎｄＴｌｒ１９９９ＧＡＦ
５２７ｎｍ处的吸收峰产生５７２ｎｍ处的荧光发射峰，
而６４８ｎｍ处的荧光发射峰是由不受光照影响的
５９２ｎｍ处的吸收峰产生的。光转换在绿光吸收状
态Ｐｇ５２７ｎｍ和蓝光吸收状态 Ｐｂ４０６ｎｍ之间是可逆的。
相比其它已知的 Ｐｂ型蓝细菌光敏色素，Ｐｂ４０６ｎｍ的
吸收峰蓝移了２０ｎｍ左右。
Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的吸收光谱和荧光发射光谱与
Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ的光谱性质大致上是一致的（见图３：
Ｂ１、Ｂ２和Ｂ３）。在蓝光照射后，它的吸收光谱有
２个明显的吸收峰，其最大吸收峰分别位于４１５ｎｍ
和４９６ｎｍ，这个光吸收状态被命名为 Ｐｔ４９６ｎｍ；当
Ｐｔ４９６ｎｍ被绿光照射后，最大吸收峰位于４１７ｎｍ处
的吸收峰值上升，相比 Ｐｔ４９６ｎｍ的对应吸收峰红移了
２ｎｍ，而４９６ｎｍ处的吸收峰几乎消失，这个光吸收
状态被命名为 Ｐｂ４１７ｎｍ。类似于 Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ在
５９２ｎｍ有１个光钝化峰，Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的２个光吸
收状态的吸收光谱中，在６１２ｎｍ处有１个小的吸
收峰，它同样不受光照的影响。在 Ｐｔ４９６ｎｍ转换为
Ｐｂ４１７ｎｍ时，它的吸收光谱在４１７ｎｍ处吸收值上升
至最高，在４９６ｎｍ处吸收值下降至最低（见图３：
Ｂ２中吸收差减光谱）。Ｐｔ４９６ｎｍ共有２个荧光发射
峰，其最大荧光发射峰值位于５６３ｎｍ和６４４ｎｍ；
Ｐｂ４１７ｎｍ共有２个荧光发射峰，它位于５６３ｎｍ的荧
光发射峰的高低随着吸收峰的高低变化，而它位于
６４４ｎｍ的荧光发射峰与 Ｐｔ４９６ｎｍ的荧光发射峰的高
低基本上是一致的（见图３：Ｂ３中荧光发射光谱）。
根据以上 Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的光谱性质得出结论：
４９６ｎｍ处的吸收峰产生５６３ｎｍ处的荧光发射峰，
而６４４ｎｍ处的荧光发射峰是由不受光照影响的
６１２ｎｍ 处的吸收峰产生的。在青光吸收状态
Ｐｔ４９６ｎｍ和蓝光吸收状态 Ｐｂ４１７ｎｍ之间存在可逆的光
转换。值得注意的是，Ｐｔ４９６ｎｍ的吸收峰是目前所有
已经发现的蓝细菌光敏色素里峰形最尖锐的，并且
它的吸收峰相比其它已知的 Ｐｇ型的蓝细菌光敏色
素蓝移了约３０ｎｍ。
从图 ４可以看出，Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ１和 Ｔｌｒ１２１５
ＧＡＦ２的吸收光谱没有特征性的吸收峰，它们不能
自发和藻胆色素结合。
２８１ 植 物 科 学 学 报 第３１卷
0 12.
0 08.
0 00.
A
b
s
o
r
p
t
i
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n
300 400 500 600 700 800
Wavelength (nm)
0 04.
Tlr1215-GAF1
A
0 12.
0 08.
0 00.
A
b
s
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i
o
n
300 400 500 600 700 800
Wavelength (nm)
0 04.
B
Tlr1215-GAF2
Ａ：Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ１的吸收光谱；Ｂ：Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ２的吸收光谱。
Ａ：ＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆＴｌｒ１２１５ＧＡＦ１；Ｂ：ＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆＴｌｒ１２１５ＧＡＦ２．
图４ Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ１和Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ２的吸收光谱
Ｆｉｇ．４ ＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｏｆＴｌｒ１２１５ＧＡＦ１ａｎｄＴｌｒ１２１５ＧＡＦ２
２．４ 重组蛋白变性实验结果
参照１８中的实验方法，将上述有光活性的蓝
细菌光敏色素Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ和Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ不同的
光吸收状态分别做酸性尿素变性实验。
酸性尿素变性的绿光吸收状态 Ｐｇ５２７ｎｍ吸收光
谱有２个吸收峰位于５６０ｎｍ和６５５ｎｍ，因为光照
射后重组蛋白Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ的蛋白质结构发生了改
变，导致与它连接的藻胆色素的空间构象发生了扭
曲，在变性条件下，藻胆色素呈现游离状态，但是扭
曲的构象无法恢复到天然构象，导致吸收峰出现异
常（见图５：Ａ１，Ａ２）。经绿光照射后，它的吸收特
征峰则恢复到 ５９７ｎｍ 和 ６６１ｎｍ，因此可知
Ｐｇ５２７ｎｍ中共结合了两种不同的藻胆色素，即藻紫胆
素ＰＶＢ和藻蓝胆素 ＰＣＢ。酸性尿素变性的蓝光吸
收状态 Ｐｂ４０６ｎｍ吸收光谱的吸收特征峰和游离的
ＰＶＢ及ＰＣＢ的吸收光谱是吻合的。根据上述的光
谱特征可以准确地得知，Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ共价的结合
着ＰＶＢ和 ＰＣＢ，且它的构型在 Ｐｇ５２７ｎｍ是包含着
Ｃ１５Ｅ的藻胆色素，在 Ｐｂ４０６ｎｍ是包含着 Ｃ１５Ｚ的
藻胆色素，这与之前所发现的Ｐｂ／Ｐｇ型蓝细菌光敏
色素ＴｅＰｉｘＪ是一样的。
Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ同 Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ一样，也共价结
合着ＰＶＢ和 ＰＣＢ（见图５：Ｂ１，Ｂ２），并且它们的
空间构型也是一致的，青光吸收状态 Ｐｔ４９６ｎｍ是包含
着Ｃ１５Ｅ的藻胆色素，蓝光吸收状态 Ｐｂ４１７ｎｍ是包
含着Ｃ１５Ｚ的藻胆色素。
Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ和Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的变性吸收光谱
特征，解释了Ｐｇ５２７ｎｍ和Ｐｂ４０６ｎｍ与Ｐｔ４９６ｎｍ和Ｐｂ４１７ｎｍ
之间的可逆光转换现象是由光驱动而引起与脱辅基
蛋白共价结合藻胆色素的 Ｃ１５／１６双键的 Ｚ／Ｅ异
构造成的。
２．５ 重组蛋白的ＳＤＳＰＡＧＥ和锌荧光实验结果
参照１６中的实验方法，在聚丙烯酰胺凝胶电
泳后，通过醋酸锌染色和考马斯亮蓝 Ｒ２５０染色，可
检测到目的蛋白的表达（见图６）。藻胆色素可与
Ｚｎ２＋形成螯合物，在一定波长光激发下可发射荧光。
通过重组蛋白的锌荧光实验，可以发现在紫外光照
射下，电泳条带中重组蛋白发出荧光，这证明在体内
重组过程中脱辅基蛋白和藻胆色素是共价偶联的，
这和酸性尿素变性实验的结果是吻合的。
３ 讨论
在本实验中，从嗜热藻（Ｔ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓＢＰ１）中
共找到３个基因，通过结构域分析推测，它们可能是
蓝细菌光敏色素。通过实验验证，Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ存
在蓝光吸收态Ｐｂ４０６ｎｍ和绿光吸收态Ｐｇ５２７ｎｍ之间的
可逆光转换，它可共价结合２种藻胆色素 ＰＶＢ和
ＰＣＢ，Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ则存在蓝光吸收态 Ｐｂ４１７ｎｍ和青
光吸收态Ｐｔ４９６ｎｍ之间的可逆光转换，它同样共价结
合 ＰＶＢ和 ＰＣＢ。而 Ｔｌｒ１２１５ＧＡＦ１和 Ｔｌｒ１２１５
ＧＡＦ２不能自发结合藻胆色素，不具有光活性。
令人惊奇的是，本实验还发现了２个新型的蓝
细菌光敏色素 Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ和 Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ，相比
其它已知的Ｐｂ型蓝细菌光敏色素，Ｐｂ４０６ｎｍ的吸收
峰蓝移了２０ｎｍ左右，Ｐｔ４９６ｎｍ的吸收峰是所有已经
发现的蓝细菌光敏色素里峰形最尖锐的，并且它的
吸收峰相比其它已知的Ｐｇ型的蓝细菌光敏色素蓝
移了约３０ｎｍ。它们进一步扩大了蓝细菌光敏色素
多变的光谱特性，提供了一个关于蓝细菌光敏色素
的光化学性质的新认识。
３８１ 第２期 刘冰冰等：嗜热藻ＢＰ１中几个蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究
0 24.
0 16.
0 00.
A
b
s
o
r
p
t
i
o
n
300 400 500 600 700 800
Wavelength (nm)
0 08.
A-1
0 24.
0 16.
0 00.
A
b
s
o
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i
o
n
300 400 500 600 700 800
Wavelength (nm)
0 08.
Dark form
Illuminated form
Dark form
A-2
0 27.
0 18.
0 00.
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300 400 500 600 700 800
Wavelength (nm)
0 09.
B-1
0 27.
0 18.
0 00.
A
b
s
o
r
p
t
i
o
n
300 400 500 600 700 800
Wavelength (nm)
0 09.
Dark form
Illuminated form
Dark form
B-2
Ａ１：变性的 Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ的 Ｐｇ５２７ｎｍ的吸收光谱；Ａ２：变性的 Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ的 Ｐｂ４０６ｎｍ的吸收光谱；Ｂ１：变性的
Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的Ｐｔ４９６ｎｍ的吸收光谱；Ｂ２：变性的Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的Ｐｂ４１７ｎｍ的吸收光谱。
Ａ１：ＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｏｆｄｅｎａｔｕｒｅｄＰｇ５２７ｎｍ ｏｆＴｌｒ０９１１ＧＡＦ；Ａ２：Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆｄｅｎａｔｕｒｅｄＰｂ４０６ｎｍ ｏｆ
Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ；Ｂ１：ＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｏｆｄｅｎａｔｕｒｅｄＰｔ４９６ｎｍ ｏｆＴｌｒ１９９９ＧＡＦ；Ｂ２：Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆｄｅｎａｔｕｒｅｄ
Ｐｂ４１７ｎｍ ｏｆＴｌｒ１９９９ＧＡＦ．
图５ 变性的Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ和Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的吸收光谱
Ｆｉｇ．５ ＡｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｐｅｃｔｒａｏｆｄｅｎａｔｕｒｅｄＴｌｒ０９１１ＧＡＦａｎｄＴｌｒ１９９９ＧＡＦ
M 1 2 M 1 2
a b
24
29
66
36
kD
１．Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ的锌荧光（ｂ）和考马斯亮蓝（ａ）染色凝胶电泳图；
２．Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的锌荧光（ｂ）和考马斯亮蓝（ａ）染色凝胶电泳图；
Ｍ．蛋白质标准分子量。
１．ＳＤＳＰＡＧＥｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｚｉｎｃｉｎｄｕｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ｂ）ａｎｄ
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ（ａ）ｏｆＴｌｒ０９１１ＧＡＦ；２．ＳＤＳＰＡＧＥｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈ
ｚｉｎｃｉｎｄｕｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ｂ）ａｎｄＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅ（ａ）ｏｆ
Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ；Ｍ：Ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒｓ．
图６ Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ和Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ的锌荧光和
考马斯亮蓝染色凝胶电泳图
Ｆｉｇ．６ ＳＤＳＰＡＧＥｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｚｉｎｃｉｎｄｕｃｅｄ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅｏｆ
Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦａｎｄＴｌｒ１９９９ＧＡＦ
蓝细菌光敏色素作为脱辅基蛋白在大肠杆菌体
内与作为辅基的藻胆色素共表达生成重组蛋白，在
这个实验中加入的是可以生成藻蓝胆素 ＰＣＢ的质
粒 ｐＡＣＹＣＤｕｅｔｈｏ１ｐｃｙＡ，但是 Ｔｌｒ０９１１ＧＡＦ和
Ｔｌｒ１９９９ＧＡＦ所结合的辅基色素均有２种，即藻紫
胆素ＰＶＢ和藻蓝胆素ＰＣＢ，而ＰＶＢ是ＰＣＢ的同分
异构体。
到目前为止，ＰＶＢ只在一些丝状蓝藻的藻红蛋
白的 α亚基中出现过，未曾发现 ＰＶＢ的生物合成
酶。Ｍａｓｔｉｇｏｃｌａｄｕｓｌａｍｉｎｏｓｕｓ中的 ＰｅｃＥ／Ｆ蛋白
可以在藻红蛋白的 α亚基与 ＰＣＢ体外重组时将
ＰＣＢ异构为 ＰＶＢ［１２－１４］。如文献９中报道，Ｉｋｅｕｃｈｉ
等将ＴｅＰｉｘＪ的ＧＡＦ结构域与 ＰＣＢ在大肠杆菌体
内共表达，最后得到的重组蛋白所结合的色素是
ＰＣＢ与 ＰＶＢ的混合体。将 ＴｅＰｉｘＪ的 ＧＡＦ结构域
单独表达，与单独表达得到的ＰＣＢ进行体外重组实
验，可以很清楚地看到 ＰＣＢ与 ＧＡＦ结构域的共价
偶联在几分钟之内完成，结合在 ＧＡＦ结构域上的
ＰＣＢ再缓慢地异构为 ＰＶＢ。该实验表明 ＴｅＰｉｘＪ的
ＧＡＦ结构域具有３个功能：自催化裂合酶、自催化
异构酶、光致异构化，但是这些功能的实现还需要蓝
细菌中其他因子的辅助。由此可以得知，Ｔｌｒ０９１１和
Ｔｌｒ１９９９的ＧＡＦ结构域可能也具有这３个功能。
根据之前的相关报道所知，ＧＡＦ结构域内保守
的半胱氨酸 Ｃｙｓ通过硫醚键共价结合藻胆色素发
色团，这个保守的 Ｃｙｓ称之为色素结合位点，而对
４８１ 植 物 科 学 学 报 第３１卷
于Ｐｂ／Ｐｇ型可逆光转换的蓝细菌光敏色素中位于
［Ｄ／Ｅ］ＸＣＦ模块中的 Ｃｙｓ的具体作用机理还没有
被明确阐明，关于Ｃｙｓ的作用目前有两个相反的模
型，光可逆结合模型和稳定双键模型。在接下来的
实验中，主要致力于这两个Ｐｂ／Ｐｇ型蓝细菌光敏色
素中Ｃｙｓ的具体机理的研究。
在植物光敏色素的研究中，比较困难的问题在
于缺少简单的光敏色素模型，同时还必须考虑到植
物体内各种光敏色素及其它光受体的相互作用。与
植物光敏色素相比，蓝细菌光敏色素的分子结构更
加简单，制备也更为方便，是深入研究光敏色素对植
物发育调控的理想材料。
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（责任编辑：王豫鄂）
５８１ 第２期 刘冰冰等：嗜热藻ＢＰ１中几个蓝细菌光敏色素结构域体内重组及光化学性质研究