全 文 ：武汉植物学研究 2000, 18( 6) : 443～448
Journal of Wuhan Botanical Research
青藏高原近缘野生大麦 5S rRNA基因
染色体原位杂交定位

闫　玲　 丁　毅

陈新平　 宋运淳　 方呈祥
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室　武汉　430072)
提　要　采用原位杂交技术, 以 5S rRNA 基因为探针, 对产于青藏高原的 4 份近缘野生大麦
和栽培大麦, 即:二棱野生大麦 H ordeum v ulgar e L . ssp. sp ontaneum ( Koch) Hs
, 六棱野生
大麦 H . vulgar e L . ssp. agr iocr ithon ( A○ber g ) Hs
, 六棱瓶形野生大麦 H . vulgar e L . ssp.
ag riocr ithon var . lagunculif orm ( Bakht) Hs
,栽培大麦 H . vulgar e. L . 进行了研究,将杂交结
果进行观察与统计, 并建立起 5S rRNA 基因定位的模式图。结果表明 5S rRNA 基因在染色
体上的位点呈现动态变化, 由二棱野生大麦、六棱瓶形野生大麦到六棱野生大麦、栽培大麦,
位点数目有递增的趋势, 而且位置也发生了某些改变。探讨了5S rRNA 基因进化与大麦染色
体进化间的关系以及原位杂交技术在系统进化研究中的应用。
关键词　近缘野生大麦, 5S rRNA 基因, 原位杂交, 系统发育
中图分类号: Q349　文献标识码: A　文章编号: 1000-470X ( 2000) 06-0443-06
CHROMOSOMAL LOCALIZATION OF 5S rRNA GENES
IN WILD RELATIVES OF BARLEY FROM QING-ZANG
PLATEAU BY IN SITU HYBRIDIZATION
Yan Ling　Ding Yi　Chen Xinping　Song Yunchun　Fang Chengxiang
( K ey Laboratory of MOE f or P lant Dev elopm ental B iology , Wuhan Univ ersity　Wuhan　430072)
Abstract　Four representatives of wild relativ e and cultiv ar o f bar ley, i. e. tw o-row ed w ild
barley H ordeum v ulg ar e L . ssp. sp ontaneum ( Koch) Hs
, six-r ow ed wild barley H . v ulgar e
L . ssp. agr iocr ithon ( A
○
berg ) Hs
, six-row ed bo ttle-shaped w ild bar ley H . vulgare L . ssp.
ag riocr ithon var . lagunculif orm ( Bakht) Hs
and cultivated ba rley H . vulgar e L . ssp. v ulgar e
Hs
f rom Q ing-Zang Plateau w ere studied by in situ hybridization using 5S rRNA genes as
probe . Locat ed 5S rRNA genes sites w ere used to constr uct an idio g ram, w hich pro vided as
molecular kar yo type. It showed that 5S rRNA genes in bar ley were movable taking into
account of it s localization and, to tal number of sites for 5S rRNA genes incr eased fr om t wo-




通讯联系人( Author for corr esp on dence. E-m ail : yid ing@ w hu. edu. cn)。
收稿日: 2000-03-13,修回日: 2000-05-23。第一作者:女, 1975年生,硕士研究生,从事分子细胞遗传学研究。
国家自然科学基金( No. 39670051)和国家教委博士点基金资助项目。
row ed w ild bar ley , six-rowed bott le-shaped w ild bar ley to six-r ow ed w ild bar ley and cultiv a-
ted barley. The r elationship betw een evo lution of 5S rRNA genes and that of bar ley as w ell
as the application of in s itu hybridizat ion in phylog eny w ere discussed.
Key words　Wild r elativ es o f barley, 5S rRNA genes, in s itu hybridizat ion, Phylog eny
产于青藏高原的近缘野生大麦是研究大麦起源与进化的珍贵材料, 对它进行系统的
研究,有助于阐明大麦的系统与进化过程,为澄清有关大麦起源及系统发生、发育等问题
提供证据,也为大麦的遗传工程和遗传育种提供理论依据〔1〕。
在大多数真核生物中,核糖体 5S rRNA 基因是串联重复的多拷贝基因,它们独立存
在,并不与主体 RNA ( 18S-5. 8S-28S rRNA)相连,在生物体内含量丰富, 广泛分布,被称
为生物体内的活化石〔2〕。在高等植物中, 5S rRNA 基因的每个重复单位由转录区和转录
间隔区( Nontranscribed Spacer, NT S) 组成,转录区高度保守,而转录间隔区有较大变异,
这种高度保守性与变异性的统一,使得5S rRNA 基因成为研究真核生物中多拷贝基因的
分子形成和演化的有用标记〔3〕。分子细胞遗传学是研究植物基因组形成与演化的一个常
规工具〔4〕,其中原位杂交技术对分析近缘物种的染色体结构变化及进化有重要作用,它是
研究重复 DNA 序列或多拷贝基因在染色体上定位的最有效方法, 对于因缺乏多态性而
无法用传统的 RFLP 分析的基因位点也可以用原位杂交的方法检出〔5〕。由于检测方法的
改进及设备的更新,近年来原位杂交技术得到了较大发展,国内外研究者们采用该技术在
各种动植物中对 5S rRNA 基因进行了定位〔6～12〕,探讨了包括系统发育和系统进化在内的
多方面的问题。我们曾用 RAPD标记以及聚类分析尝试对中国近缘野生大麦的进化途径
进行探讨〔13〕,文中用 5S rRNA 基因对这些有代表性的材料的染色体进行比较定位,旨在
为中国青藏高原近缘野生大麦的细胞学研究提供染色体标记,同时也探讨了 5S rRNA 基
因作为标记在起源与进化研究中的作用。
1　材料与方法
1. 1　材料
选取产于中国青藏高原的二棱野生大麦(野生二棱白)、六棱野生大麦( ZYM 1166)、
六棱瓶形野生大麦(永 5793)以及栽培大麦 ( ZDM 4675) 等 4份具有代表性的材料(见表
1)。原始材料由中国科学院遗传研究所邵启全教授、四川农业大学徐廷文教授等提供。材
料的命名采用徐廷文的分类系统〔14〕。
表 1　供试大麦的名称及产地
Table 1　T he investig ated mater ials and their sources
材 料
Materials
学　名
Scient if ic nam e
产地
S ources
野生二棱白 H . vulg are L. ssp. sp ontaneum ( koch) Hs
四川
永 5793 H . vulg are L. ssp. agr iocr ithon var. laguncul if or m ( Bakht ) Hs
青海
ZYM 1166 H . vulg are L. ssp. agr iocr ithon ( A
○
b erg) Hs
西藏
ZDM4675 H . vulg are L. ssp. vulg are Hs
西藏
原位杂交所用
的含有 5S rRNA
基因的质粒探针
pT a794由西班牙
Alcal 大 学 A.
Fominaya 博士馈
赠。
1. 2　方法
1. 2. 1　探针的转化、扩增及酶切鉴定　采用热激法转化质粒探针,受体菌为 DH5
菌
444 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 18卷　
株。碱裂解法提取扩增探针,参照Sambrook等的方法〔15〕进行。BamHI酶切鉴定。
1. 2. 2　探针的标记及标记效果　采用缺刻平移法标记探针(试剂盒购自华美公司)。反应
混合为 5 L 质粒 (约 1 g ) , 5L Bio-11-dU TP, 10 L dNT P 混合物( dAT P, dGTP,
dCT P) , 5 L 10×Buf fer, 5 L 酶液( DNaseI/ DNA polymer ase) ,加无离子水至 50 L,混
匀后 15℃反应 1. 5 h,加 5 L 终止液终止反应。点印渍检测标记效果。
1. 2. 3　染色体制片　按照丁毅等的方法〔16〕,稍有改进。取长至1～2 cm 生长旺盛的大麦
根尖, 4℃
-溴萘水溶液中预处理 2～3 h, 用甲醇∶冰乙酸( 3∶1)固定液固定 2 h 以上,充
分水洗, 用 2%纤维素酶(上海丽珠东风生物技术有限公司)和 2%果胶酶( Serv a)等量混
合酶液于 27℃酶解 3 h左右,用火焰干燥法制片。
1. 2. 4　原位杂交及检测　参照Gustafson 和Dill ( 1992)的方法〔17〕, 略有改进。杂交液包括
25 L 探针, 62. 5 L 去离子甲酰胺, 25 L 硫酸葡聚糖, 12. 5 L 20×SSC 和 1. 25 L
sssDNA(鲑鱼精子DNA)。杂交液于 100℃变性10 min,立即置于冰上5 min以上。染色体
制片在 60℃烤片 1 h, 37℃下用 RNaseA ( 1 g / mL) 处理 1 h, 70℃下 70%甲酰胺变性
3 min,后经70%、95%、100%乙醇系列脱水。每张制片加50 L 杂交液于 37℃保温过夜。检
测时, 首先用 20%去离子甲酰胺、2×SSC 和 0. 1×SSC 依次浸洗,室温下用 0. 1% T rition
浸洗。然后依次加羊抗生物素抗体、兔抗羊抗体生物素偶联物和SA -HRP, 37℃下各反应 30
min。室温下显色5 min。用 1∶20 Giemsa 染液染色7 min。二甲苯透明后封片。
1. 2. 5　杂交信号观察及统计分析　使用 OLYMPUS BH-2 显微镜观察杂交结果, 选择
信号清晰、染色体形态好、背景干净的分裂相进行显微摄影, 统计杂交信号点, 进行分析。
染色体的编号和排列按照 Linde-Laur sen等( 1997)的标准〔18〕进行。
2　结果与分析
对基因组中具有单杂交信号点(即只有一条姊妹染色单体上有信号点)和双杂交信号
点(即姊妹染色单体上同时具有信号点) (见图版Ⅰ)的细胞分别进行统计,计算其检出率,
结果如表 2所示。
表 2　5S rRNA 基因的原位杂交检出率
Table 2　T he detection frequency of in situ
hybr idization to 5S rRNA genes
材料
M aterial s
细胞总数目
Total n o.
of cell s
an alyz ed
有双杂交点的细胞数目
Both sis ter
chromat ids
label led
有单杂交点的细胞数目
S ingal
chr om at id
label led
有杂交点的细胞数目
Total no.
of label led
cells
野生二棱白 487 34( 6. 98% ) 74( 15. 2%) 108( 22. 2% )
永 5793 406 31( 7. 64% ) 71( 17. 5%) 102( 25. 1% )
ZYM1166 592 52( 8. 78% ) 115( 19. 4%) 167( 28. 2% )
ZDM4675 551 43( 7. 80% ) 117( 21. 2%) 160( 29. 0% )
杂交信号(双杂交信号点和单杂
交信号点)的总检出率在二棱野生
白、永 5793、ZYM1166、ZDM4675
中分别为: 22. 2%、25. 1%、28. 2%、
29. 0%。根据统计结果,将杂交信号
点中的双点在染色体上的位置标
出,得到 4份供试材料中 5S rRNA
基因位点的模式图(图 1)。由模式图
可以看出, 5S rRNA 基因在 4份供
试材料中存在着数目及位置的多态性。野生二棱白、永 5793、ZYM1166、ZDM4675分别
具有 4个、5个、5个、7个基因位点, 呈数目递增的趋势,主要体现在染色体 7H、6H 上基
因位点数目的增加。在 4份材料中,第 5号染色体( 1H)上均无杂交信号,这与已报道的结
果相一致〔19, 20〕;第2号染色体( 2H )、第 3号染色体( 3H)上的基因位置基本一致,杂交信号
445　第 6期　　　　　　　闫 玲等:青藏高原近缘野生大麦 5S rRNA 基因染色体原位杂交定位
A. 5S rRNA 基因在二棱野生大麦(野生二棱白)中的核型模式图; B. 5S rRNA 基因在六棱野生大麦( ZYM1166)中
的核型模式图; C. 5S r RNA 基因在六棱瓶形野生大麦(永 5793) 中的核型模式图; D . 5S rRNA 基因在栽培大麦
( ZDM4675)中的核型模式图
A. Idiogram of 5S rRNA gen es dist ributed on ch romosomes of tw o-r ow ed w ild b arley tw o-rowed w hite-wild; B.
Idiogram of 5S rRNA genes dist rib uted on chromosomes of six -rowed w ild barley ZYM 1166; C. Idiogram of 5S
rRNA genes dis tributed on chromosomes of six-row ed bott le-sh aped barley Yong -5793; D. Idiogram of 5S r RNA
gen es dis tr ibuted on chrom osomes of cul tivated barley ZDM 4675
图 1　5S rRNA基因在青藏高原近缘野生大麦中的染色体分布模式图
Fig . 1　Idiograms of dis t ribut ion pat ter ns of 5S rRNA genes in w ild relat ives of
b arley fr om Qin ghai-Xizang Plateau
点与着丝粒的百分距离分别为 79. 2±2. 1和 63. 3±2. 7, 基因在其它染色体上则存在不
同程度的位置多态性:
第 1号染色体( 7H ) :野生二棱白、永 5793及 ZYM1166均无杂交
信号点; ZDM 4675的染色体短臂上有一个基因位点,杂交信号点与着丝粒的百分距离为
29. 8±1. 2。 第 4号染色体( 4H) : 杂交信号位于野生二棱白和永 5793的染色体长臂上,
与着丝粒的百分距离分别为 18. 2±3. 7和 41. 7±4. 6; 而 ZYM1166和 ZDM4675 中的杂
交信号点位于短臂上, 与着丝粒的百分距离分别为 67. 6±3. 1和 47. 1±2. 8。 第 6号染
色体( 6H ) :野生二棱白中无杂交信号, 永 5793和 ZYM1166长臂上各有 1个基因位点,与
着丝粒的百分距离分别为 40. 0±3. 2和 22. 5±4. 2; ZDM 4675 的长、短臂上各有 1个基
因位点, 与着丝粒的百分距离分别为 12. 5±2. 7和 70. 8±4. 5。!第 7号染色体( 5H) : 5S
rRNA基因在野生二棱白、永 5793、ZYM1166和 ZDM4675中均位于染色体长臂上,但位
置不同,与着丝粒的百分距离分别为: 52. 9±3. 9、72. 6±2. 7、41. 2±5. 1、19. 6±3. 3。
446 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 18卷　
3　讨论
细胞遗传学的研究表明二倍体大麦的核型是基本一致的,在进化过程中只有基因的
变化, 没有明显的染色体形态或数目的改变〔21〕, 这就需要对大麦染色体的次级结构及基
因进行研究, 才能得到更多的资料。我们曾采用 RAPD分析的方法对青藏高原近缘野生
大麦进行分析, 认为大麦可能的进化途径是由二棱野生大麦起始,经过几种中间类型, 进
化到六棱野生大麦,最终进化到栽培大麦〔13〕。
迄今为止, 5S rRNA 基因在大麦染色体上的定位情况有较大差异,不同的研究者,使
用不同的材料,得到了不同的结果。Fukui等( 1994)以栽培大麦 H ordeum v ulgare ( 2n=
14)及其易位系为材料检测出了 10个位点, 除 1H染色体上没有杂交点外,其余染色体上
均有基因位点,有的染色体( 3H、4H、6H、5H)上有 2个基因位点〔19〕。Taketa 等( 1999) 以
野生大麦 H . vulgare ssp. sp ontaneum ( C. Koch) T hell为材料, 只在染色体 2H、3H、7H
上检测出 3个基因位点,位置与前者也略有所不同〔20〕,这反映出大麦中 5S rRNA 基因的
数目可能是变化着的。
笔者采用 5S rRNA 基因( pTa794)为探针, 在青藏高原近缘野生大麦中进行原位杂
交,结果显示了 5S rRNA 基因在大麦中呈现动态变化。供试的 4份材料中, 5 号染色体
( 1H)上均没有基因位点,这与其他学者的检测结果相一致〔19, 20〕,有人认为这是因为自然
缺失造成的〔22〕。本研究的结果表明, 由二棱野生大麦、六棱瓶形野大麦到六棱野生大麦、
栽培大麦, 5S rRNA 基因位点数目有递增趋势,而且基因的位置呈现一种多态性现象,在
4份材料中,除染色体 2H、3H 长臂末端的基因位点一致外, 其余染色体上的位点均有所
不同。这说明在进化过程中基因可能发生了易位、重复等改变。
Scoles等通过对小麦属中几个种的研究,认为 5S rRNA 基因结构的变化可以由转录
间隔区的重复和缺失来解释〔23〕。Hanson等认为 rRNA 基因位点的增加是由于 rRNA 基
因从有 rRNA 基因位点的染色体易位到了没有 rRNA 基因位点的染色体上〔24〕。由此可以
推断,大麦的 5S rRNA 基因在漫长的进化历程中, 从二棱野生大麦经过中间类型的六棱
瓶形野大麦,到六棱野生大麦、栽培大麦,基因通过易位或其它转换方式在染色体上产生
了新的位点,原来的位置上可能会有部分残留,但这些残留序列可能已失去了基因的活
性,这需要进一步的研究。Zhang 等在对芍药属( Paeonia)的研究中也观察到 rRN A基因
位点数目增加的情况〔22〕。这种基因位点数目的变化是由于所用材料不同或环境条件引
起,还是由遗传变异造成,我们所知甚少,但从本实验结果分析,很可能是后者起主要作
用。这些变化能否反映材料间的进化关系,尚在探讨之中,但根据我们的RAPD结果与原
位杂交结果的对比,并综合 Fukui等〔19〕和T aketa〔20〕等的研究,我们认为5S rRNA 基因位
点的变化可能反映了进化过程中基因发生改变的一些痕迹。
用原位杂交技术定位 5S rRNA 基因来研究进化是一种新的思路。我们的研究结果为
大麦的核型进化和种间关系的研究提供了新的证据。将5S rRNA 基因的演化与大麦染色
体的演化相比较, 如果能够寻找到二者的内在关联性,对于系统演化的探讨将起到重要作
用。对大麦中更多的种或同种内不同样本进行分析, 将有利于完整地认识大麦属的变异情
况,对于从整体上认识禾谷类作物的基因组演化及建立 rRNA 基因的演化模式图都将有
447　第 6期　　　　　　　闫 玲等:青藏高原近缘野生大麦 5S rRNA 基因染色体原位杂交定位
特殊意义。
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448 武汉 植 物学 研究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 18卷　
闫玲等:青藏高原近缘野生大麦 5S rRNA 基因染色体原位杂交定位 图版Ⅰ
Yan Ling et al .: Chromosomal localizat ion of 5S rRNA genes in wild r elat ives of
barley fr om Qing zang Plateau by in situ hybridization PlateⅠ
5S rRNA 基因在青藏高原近缘野生大麦中的定位
A. 5S rRNA 基因在二棱野生大麦(野生二棱白)的第 2染色体长臂上检出; B. 5S rRNA 基因在六棱野生大麦( ZYM
1166)第 4染色体长臂和第 2染色长臂上检出; C. 5S rRNA 基因在六棱瓶形野生大麦(永 5793)的第 3染色体长臂上
检出; D. 5S rRNA 基因在栽培大麦( ZDM 4675)第 1染色体短臂上检出
Localizat ion of 5S rRNA genes in w ild relatives of barley f rom Qinghai-Xizan g Plateau
A. 5S r RNA genes sites w er e detected on the long arm of ch romosome 4( 4H) in two-row ed w ild b arley tw o-row ed
w hite-w ild; B. 5S rRNA genes s ites w ere detected on the long arm of chromosome 4 ( 4H) and chromosom e 2 ( 2H)
sim ultan eous ly in s ix-row ed wild barley ZYM 1166; C. 5S rRNA genes s ites w ere detected on the long arm of
ch romosome 3( 3H) ; D. 5S rRNA genes sites were detected on the short arm of ch romosome 1( 7H)