全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(5)：494～499
Journal of Wuhan Botanical Research
植物铝离子胁迫的研究方法综述
汤华 ，向福英 ，柳晓磊 ，帅爱华4
(1．海南大学生命科学与农学院，海13 570228；2．热带生物资源教育部重点实验室 ，海口 570228：
3．海南大学人事处，海口 570228；4．湖北省恩施州职业技术学院，湖北恩施 445O00)
摘 要：酸性土壤上，植物的生长受到很大的抑制，铝对植物的毒害是最主要的问题。为了揭示植物铝离子胁迫反
应及其耐铝性的机理，科学家们进行了大量研究，取得了许多喜人的进展。根据前人研究，对植物铝离子胁迫的研
究方法进行了综述。在试验材料的处理方面介绍了大田栽培、室外盆栽、室内盆栽、营养液栽培等方法；在耐铝性
鉴定方面介绍了受害症状、根相对伸长率等直接鉴定法和化学染色、有机酸分泌量等间接鉴定法 ；在铝离子胁迫基
因研究方面，介绍了基因定位技术、基因差异表达研究技术、蛋白质差异表达研究技术及转基因技术等研究方法。
关键词：植物；铝胁迫；研究方法
中图分类号：Q945．78 文献标识码：A 文章编号：1000．470X(2007)05．0494．06
A Review of Research Methods on Plant Aluminum Stress
TANG Hua ．一，XIANG Fu．Ying ，LIU Xiao．Lei -．SHUAI Ai．Hua
(1．c0比 of Science andAgriculture，Hainan University，Haikou 570228，China；2．Key Lab ofTropicBiologicalResource。
MinistryofEducation，Haikou 570228，China；3．Personnel Department，Hainan Univers ，Haikou 570228，China，
4．coacge ofEnshi Profesional Technology，Enshi，Hubei 445000，China)
Abstract：The growth of plant was strongly inhibited in acid soil，and aluminum toxicity was the most
important reason．Scientists have done extensive research work on aluminum-stress responses and
aluminum-tolerant mechanism of plant for a long time，and have made lots of remarkable progress．In this
article，a review about research methods of plant aluminum-stress was made．For material treatment
methods of experiment，it introduced field cultivating，pot-planting outdoors，pot-planting indoors，and
nutrient solution culture．For aluminum-tolerance identification，it introduced direct—identification methods
including toxic symptoms，root relative elongation and SO on，indirect-identification methods such as
chemical staining and organic acid secretion．In gene research of aluminum-stress，many method s were
introd uced about gene mapping，gene diferential expression，protein diferential expression，transgenic
techniques，an d so on．
Key words：Plan t；Aluminum stress；Research method
1 研究植物铝离子胁迫的必要性
酸性土壤影响着全世界40％耕地的作物产量，
主要分布在热带、亚热带及温带地 区的发展中国
家⋯，在中国，酸性土壤分布遍及 14个省区，主要在
我国南方地区，总面积达 203万 km ，约占全国耕地
的2l％[2]。在酸性土壤上，植物的生长发育受到很
大的抑制，农作物的产量潜力不能充分发挥出来，导
致农业生产产量低、经济效益差。酸性土壤影响作
物生长的土壤因素有铝毒、锰毒、H 毒(高 H 浓
度)及营养元素的缺乏。由于铝占土壤阳离子交换
总量的20％ 一80％，在 pH<5的酸性条件下，土壤
中可溶性的铝(主要是 Al¨ )对大多数作物都会产
生严重毒害，影响产量，铝害是酸性土壤的最主要障
碍因子。
目前，耕地面积正 日益减少，土壤环境 日趋恶
化，而人口还在不断增加，粮食安全问题面l临很大的
压力。为了保障粮食安全，一方面要严格控制现有
耕地面积的减少，遏制耕地土壤质量的下降或恶化；
另一方面要提高耕地的单位面积生产力水平，提高
土地的利用效率。为了提高单位面积的生产力水
平，发掘现有耕地的生产潜力和农作物的遗传改 良
是重中之重[3]。由于酸性土壤耕地的生产潜力还
有很大的上升空间，因此，提高酸性土壤上的农作物
收稿 Et期：2007—02—02，修回Et期：2007—05—12。
作者简介：汤华(1974一)，男，湖北恩施人，博士，副教授，研究方向为植物遗传育种与分子生物学(E-mail：thtiger@163．corn)。
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第 5期 汤 华等：植物铝离子胁迫的研究方法综述 495
产量 ，已经引起了广泛的重视。运用现代生物技术
选育耐酸性土壤的农作物品种，是人类开发和利用
酸性土壤最可依赖、也最有希望的出路。对植物铝
离子胁迫进行深入研究，对于揭示植物铝离子胁迫
的生理机制和分子机理十分重要，对植物耐铝的分
子育种也有积极的推动作用。
2 铝离子胁迫研究的材料处理方法
要研究植物的铝离子胁迫，就必须对遗传材料
进行铝离子胁迫处理，根据实验的目的和要求，选择
适当的材料处理方法十分重要。一般而言，材料处
理方法包括大田栽培、室外盆栽、室内盆栽、营养液
栽培、细胞培养等。
2．1 大田栽培
大田栽培是最早采用的处理方法，将材料直接
种植在酸I生土壤大田中，通过对其全生育期的田间
生长长势、生育期、产量及株高等多种农艺性状进行
考察评价，判断其耐铝性的好坏HJ。大田栽培为自
然胁迫，对植物耐铝性进行评估能给出直观和贴近
生产实际的结论，但由于容易受天气、病虫害、栽培
管理等多种不可控制因素影响，不可能跨季节或跨
年度创造一致的胁迫条件，给准确评估和连续性工
作造成了困难；有工作量大，周期长、费用高的缺点。
对于植物耐铝的遗传改良而言，大田栽培是必不可
少的步骤。
2．2 室外盆栽
在实际研究过程中，某些研究单位离酸性土壤
的大田栽培地点较远，存在交通不便、试验管理困
难、实验取材和性状观察不便等诸多限制因素。针
对这种情况，产生了室外盆栽方法，即将含铝的酸性
土壤取到就近的场地，用容器对材料进行种植和栽
培 ]。室外盆栽的好处是管理方便及时，能对水肥
等条件进行有效的控制，性状的考察和数据采集便
利。室外盆栽的缺点是在处理大量材料时工作量
大，往往会出现场地受限的情况，另外，受天气和季
节的影响大，暴风暴雨对试验有影响，冬季试验无法
开展。
2．3 室内盆栽
针对室外栽培存在的缺点，室内盆栽方法开始
体现出优越性，即在温室或者实验室进行小规模的
材料栽培，采用容积相对较小的容器，以酸性土壤为
基质，种植和处理材料 】。该方法的优点是管理更
加方便，对营养元素可进行更准确的控制，排除了天
气的干扰和季节的限制 ，一年四季都可进行试验。
2．4 营养液栽培
为了方便取材，保证实验处理的可操作性和一
致性，耐铝研究开始采用营养液栽培的方式处理材
料【 。营养液栽培是使用化学营养液栽培作物的
方法，又叫水培法。营养液中包括作物必需的所有
营养元素，即氮 (N)、磷 (P)、钾 (K)、钙 (ca)、
镁(Mg)、硫(s)等大量元素和铁(Fe)、锰(Mn)、硼
(B)、锌(zn)、铜(cu)、钼(Mo)等微量元素。不同
的作物和品种，同一作物不同的生育阶段，对各种营
养元素的实际需要有很大的差异。所以，在选配营
养液时，要先了解各类作物，各个生育阶段，对各类
营养元素的需要量，以此为依据来确定营养液的组
分和比例。
耐铝研究中，一般将营养液的 pH值设为 4．3，
设置加铝的胁迫处理和不加铝的对照处理，铝离子
浓度可根据研究 的需要来进行设定 J，通常配好
pH 4．3的 1．0 mol／L的AICI 的溶液，在完成对植物
材料的营养液预培养后加入，常用 的浓度范 围是
100～300 mmol／L。耐铝研究采用营养液栽培有很
多的优点：①能对营养元素的含量进行精确控制，包
括铝离子的含量；②能减少试验误差，增强试验数据
的可靠性；③能避免病虫害的影响和破坏；④不受地
区、土质、环境等条件的限制。在实践过程中，研究
者可根据实验和研究的客观需要对上述方法进行选
择。当然，营养液栽培法也有缺点，主要是不利于进
行全生育期栽培，难以完全模拟出酸性土壤的实际
情况等。将营养液栽培法和土壤盆栽法相结合，能
很好 地解决这个 问题。目前，已在玉米 ，小
麦【1 “ 等植物的耐铝性研究方面应用广泛，取得了
较为理想的结果。
3 植物耐铝性的鉴定方法
在植物铝离子胁迫研究中，对植物材料的耐铝
性进行可靠而准确的鉴定十分重要，这是后续研究
工作开展的根本保障。采用的方法可以分为直接鉴
定法和间接鉴定法两大类。
3．1 直接鉴定法
根据铝离子胁迫下，植物农艺性状的变化来鉴
定耐铝性的强弱，即为直接鉴定法。受害症状是最
直接的依据。在铝离子胁迫下，根系和地上部生长
受阻，根部的受害表现为根伸长受到抑制，根尖膨
大，表皮脱落等；植株地上部分的受害症状表现为
茎、叶的干物质重量减少，叶片数减少，叶片变小变
黄，叶缘卷曲，叶尖枯黄。苗期受害严重的，叶片前
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端会出现水渍状萎焉症状；对于成株期受害而言，主
要表现为植物生长不够健壮，植株的生物量减少。产
量大幅下降⋯。通过受害症状，可对植物的耐铝性
作出定性判断。
为了直接作出定量的判断，也可对相应的指标
进行测量。采用大田栽培时，可对植物的生物量、产
量等进行定量评价。采用室外盆栽、室内盆栽和营
养液栽培时，可以对株高、地上部鲜重、根系鲜重、地
上部干重、根系干重、受害症状的级别等农艺性状和
指标进行考察鉴定 J。采用营养液栽培时。还可对
根长、侧根数、根相对伸长率等指标进行精细测
定Ll引，用于耐铝性的判定。对于这些直接鉴定法的
指标，最好以铝胁迫和无铝胁迫的相对百分率为最
终参数进行评价。铝离子毒害植物的首要部位是根
系，针对根系进行耐铅I生研究时，一般采用土壤盆栽
与营养液栽培相结合的方法。
3．2 间接鉴定法
问接鉴定法是通过相对复杂的物理、化学、生理
生化乃至分子生物学手段，测定问接的指标和参数，
对植物的耐铝性进行评价。问接鉴定法过程较复
杂。但被测定的指标往往与植物铝离子胁迫反应的
生理生化过程密切相关。在植物耐铝性研究中，采
用较多的间接鉴定法有：根的化学染色法、根的酶活
力测定，根系分泌物的测定、根的显微结构观察等。
植物受到铝离子胁迫时，根尖细胞的内外会产
生不同程度的铝离子积累。桑色素(mofin)或者苏
木精(hematoxylin)能够特异性地与铝离子结合，形
成有颜色的复合物，因此通过这两种染料染色，根据
染色 的深浅就可 判断细胞 中铝离子 积累 的程
度 。H]。大量的研究表明 ，铝离子在根尖的
积累量与植物的铝离子敏感性呈高度正相关，与耐
铝性呈高度负相关。一般而言，耐铝基因型的苏木
精、桑色素染色程度较低。根系 Trc还原强度测
定。即采用氯化三苯基四氮唑(TTc)法测定的是根
系的脱氢酶的活性，脱氢酶的活性与根系的活力呈
正相关。在铝离子胁迫时，根系 Trc还原强度越
高。其耐铝性就越强，反之越弱 。
植物在铝离子胁迫下，根尖会分泌大量的有机
酸，螯合 Al¨ ，降低根际周围 Al¨ 的浓度和活性。
有机酸的分泌量越高，其耐铝性越强，因此，对有机
酸的含量进行测定，可用于鉴定耐铝性。在铝离子
的胁迫诱导下，不同的植物分泌不同种类的有机酸，
豆科植物主要分泌柠檬酸 ，玉米主要分泌柠檬
酸 ∞ 和苹果酸 引，烟草分泌柠檬酸 ，小麦主要
分泌苹果酸 圳，荞麦 和芋头 主要分泌草酸。
不同种类的有机酸解除铝离子毒害的能力是不一样
的，其中以柠檬酸的能力最强，其次为草酸，苹果酸。
4 植物铝胁迫基因的研究方法进展
随着分子生物学技术的发展和广泛运用。已经
从基因水平对植物的铝离子胁迫展开了卓有成效的
研究，取得了很多喜人的进展。采用的研究方法主
要包括如下几种：
4．1 基因定位技术
在很多植物中，耐铝性是一种数量性状，受多基
因控制。QTL定位技术是在 20世纪 80年代后期。
随着分子生物学技术的兴起而发展起来的一种研究
数量遗传的方法，其基本原理是利用适当的分离群
体，构建较高密度的、均匀覆盖全基因组的分子标记
连锁图，然后结合分离群体中各个体的标记基因型
及性状表型值，通过特定的专业软件进行统计运算，
将控制数量性状的基因位点，即 QTL定位在分子标
记连锁图上，并分析其遗传效应。
要进行 QTL定位，首先要构建一个 目标性状的
分离群体。QTL定位要求 目标性状在群体中分离明
显，符合正态分布，故在选择亲本时，应尽可能选择
性状表现差异大和亲缘关系较远的材料。目前在
QTL定位中常用的群体有 F 群体、回交群体、回交
自交系群体、双单倍体群体、重组 自交系群体，永久
F 群体，近等基因系群体等。不同的群体具有不同
的特点，可根据研究的基础和要求进行选择。其次
是进行分子标记实验，DNA分子标记的种类很多，
在 QTL定位中运用较多的是 RFLP、RAPD、AFLP、
SSR等。最后就是选取恰当的方法和专业软件，完
成 QTL定位。QTL定位的方法主要有单标记分析
法 引，区间作图法 川，复合区间作图法 。 和多区间
作图法 驯等。
目前。QTL定位技术已大量运用到植物耐铝基
因的研究中。Riede等将小麦耐铝基因定位在 4D
染色体的长臂上 (4DL)，命名为 AltBH 。Luo和
Dvorak将中国春小麦耐铝基因定位于 4DL，命名为
Alt2 E。¨
。 此后，相继在黑麦 。 、大麦 。引、高粱 圳等
作物上对耐铝基因作了定位。Magalhaes等对禾本
科作物 的耐铝基 因定位 的比较研究发现，小麦
(AltBH)、黑麦(Alt3)和大麦(azp)的耐铝基因位
点定向同源 ]。wu等以相对根长作为生理抗铝指
标。将水稻的耐铝QTL定位在 1、3、9和 l2号染色
体上 。引；Ma等定位了3个水稻耐铝 QTL，分别位于
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第 5期 汤 华等 ：植物铝离子胁迫的研究方法综述 497
染色体 1、2、6号上 。Kobayashi等在拟南芥中也
发现 了两个耐铝 QTL，定 位于染 色体 1号和 5
号l3 。在玉米中，在染色体2、6、8号上定位了5个
QTL 。
4．2 基因差异表达研究技术
植物耐铝性的差异，从本质上说是基因差异表
达的结果，在相同胁迫下，不同的材料会表达不同的
基因；对于同一个材料，在不同的胁迫下，也会表达
不同的基因。生物随时有成千上万的基因表达，当
目的基因不清楚时，要分离 目的基因十分困难。比
较不同材料或相同材料在不同生理状态下的基因表
达上的差异，有助于研究基因的表达模式和功能，并
且能够分离克隆特异性表达的基因。因此，基因差
异表达研究技术被大量运用在植物铝离子胁迫研究
中。目前最常用的方法包括消减杂交、DDRT—PCR、
cDNA—RDA、cDNA—AFLP、SSH、基 因芯片和 SAGE
笙 [39]
1r 0
Cruz—Ortega构建 cDNA文库研究小麦的铝胁迫
反应，获得了 1，3-p一葡聚糖酶和一个类微丝结合蛋
白的cDNA克隆，并认为植物的铝毒反应会引起细
胞防御相关基因的上调表达L加J。Hamel等对小麦
中铝诱导基因的研究发现，检测的大部分基因是植
物对其它生物和非生物胁迫的共同响应基因L4 。
Richards构建拟南芥的铝胁迫 cDNA文库，鉴定了5
个前期快速上升表达的基因，4个中后期上升表达
的基因，还有两个抑制表达的基因，认为 Al¨ 胁迫
诱导了拟南芥根系的氧胁迫反应，氧胁迫反应可能
是植物铝离子胁迫反应的核心组成部分 。MiUa
等采用SAGE技术对黑麦中的铝诱导基因作了详细
的研究H 。Wat采用抑制消减杂交(SSH)的方法，
构建甘蔗的消减文库，发现了14个与信号传导及基
因表达调控有关的基因，28个未知功能基因，其中
的23个是其它禾本科植物抗逆研究己经发表的
EST序列【川。通过 SSH技术 ，已经在玉米 J、拟南
芥 等植物上创建了消减 cDNA文库，并分离了铝
诱导基因。
4．3 蛋白质表达研究技术
蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直
接体现者，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明
生物在不同生理条件下的变化机制。研究不同时期
细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的
差异表达，可以发现有差异的蛋白质。蛋白质研究
技术涉及到蛋白质的样品准备、蛋白质分离提取、蛋
白质电泳技术、蛋白质层析技术、蛋白质定量检测、
蛋白质测序技术及蛋白质的生物信息分析技术等。
将蛋白质研究技术运用到铝离子胁迫的研究中，分
离鉴定与铝离子胁迫相关的关键蛋白，是一个重要
的发展趋势。
Taylor等发现铝离子能诱导两个 51 kD疏水蛋
白在耐铝小麦中表达，而在铝敏感品种不表达，分析
表明它们与液泡膜上的 H 一ATPase上的 B亚基以
及线粒体膜上的 和 B亚基同源 J。Li等将拟南
芥中Mgn转运蛋 白(AtMGT)互补到酵母缺陷体
中，使酵母恢复了耐铝性L4 。Hamilton等研究了小
麦中一个与耐铝基因型共分离的蛋白质，与液泡的
H 一ATPase(V—ATPase)B亚基以及线粒体 ATPase
(F1F0一ATPase)的A、B亚基具有很高的同源性，并
证明能提高小麦的耐铝性 J。Sasaki等分离 了一
个铝 激 活 的 苹 果 酸 运 输 蛋 白基 因 ALMT1
(aluminum—activated malate transporter)，在耐铝小麦
品种 ET8和铝敏感品种 ES8根尖中的表达明显不
同，能诱导的苹果酸释放增强 。杨建立等研究发
现，在小麦中有 11种蛋白与耐铝品种有专一性 。
当前蛋白质组研究的核心技术就是双向凝胶电
泳 一质谱技术，即通过双向凝胶电泳将蛋白质分离，
然后利用质谱对蛋白质逐一进行鉴定，高通量、高灵
敏度和高精度是三个关键指标。随着蛋白质组学的
兴起，植物铝离子胁迫的研究必然向蛋白质组学的
方向发展。
4．4 转基因技术
将转基因技术运用到植物耐铝研究中具有两个
方面的作用，一是对获得的耐铝候选基因进行功能
证实，二是通过转基因技术，进行植物耐铝的分子育
种，获得耐铝的转基因植物材料。目前，转基因技术
主要包括基因枪法，农杆菌介导法，花粉管通道法，
子房注射法等。
De la Fuente等运用农杆菌介导法将柠檬酸合
成酶基因转入烟草中过量表达，使其耐铝能力增强，
这是人类首次采用转基因技术提高植物耐铝性的尝
试 。Ezaki等 将 拟 南 芥 铜 蓝 结合 蛋 白基 因
(AtBCB)、烟草谷胱甘肽硫转移酶基因(parB)、烟草
过氧化物酶基因(NtPox)、和烟草 GDP解离抑制物
基因(NtGDI)分别转入拟南芥，得到 4种耐铝性增
强的转基因植株，检测后发现，AtBCB基因可能抑制
铝的吸收，NtGDI基因促进拟南芥根尖 Al¨ 的释放 ，
parB基因和NtPox基因可缓解铝毒引起的氧胁迫；
这4种植物杂交出的F。代具有更强的耐铝能力，说
明这4种基因具有协同效应 ¨ 。Tesfaye等将含有
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498 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
CaMV 35S启动子的MDH和PEPC的嵌合基因分别
导人到苜蓿(Medicago sativa)中，使苹果酸脱氢酶活
性提高 1．6倍，根中有机酸含量增加4．2倍，有机酸
分泌量也随之增加了7．1倍，该结果证明：增加有机
酸合成可能是植物适应酸性土壤和抵抗铝毒的有效
方式 引。Anoop等将拟南芥的柠檬酸合成酶基因
(c5)导人油菜中过量表达，转基因植株中 CS活性
提高，根中柠檬酸含量提高，根对柠檬酸释放量也增
加2倍，耐铝能力增强，说明与柠檬酸合成或分解相
关的酶可能与植物耐铝机制有关 引。Delhaize等将
ALMT1基因转化大麦，转基因植株的苹果酸分泌能
力和耐铝能力都有显著地提高，该结果证明：ALMT1
是小麦等有机酸快速分泌型植物的耐铝能力强的主
要原因 J。可见，转基因技术在植物耐铝基因的功
能鉴定和植物耐铝种质的创建方面，其作用不可替
代。
5 结语
植物铝离子胁迫的研究 日益受到重视，研究方
法和手段也不断提高和改进，特别是受整个生命科
学研究领域的新技术、新学科、新思路的影响很大。
目前生命科学的研究主要向功能基因组学、代谢组
学、生物信息学、蛋白质组学等方向发展，并且相互
交叉渗透，因此，可以预见，植物铝离子胁迫的研究
将会有更多新方法和新思路产生，引领植物铝离子
胁迫研究取得更大突破。
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