全 文 ：武汉植物学研究 2006，24(4)：377—380
Journal of Wuhan Botanical Research
几种白菜类蔬菜卡那霉素抗性的研究
王峰 ，卢永恩 ，李汉霞
(1．华中农业大学园艺林学学院，武汉 430070；2．暨南大学药学院，广州 510632)
摘 要 ：标记基因的利用是筛选和鉴定基因转化的细胞、组织和转基因植株的有效方法。针对目前遗传转化中常
用的卡那霉素(Km)抗性基因，对几种白菜类蔬菜的卡那霉素抗性作了较系统的探索，发现 5．0 ms／L Km可完全抑
制大白菜、小白菜及菜心子叶的再生；幼苗Krn抗性测验表明各品种均表现出随着Km浓度的提高，子叶黄化率升
高、根茎变短、鲜重减轻的趋势。白菜类蔬菜的卡那霉素抗性检测为遗传转化和阳性后代筛选奠定了基础。
关键词：白菜类蔬菜；卡那霉素(Km)；敏感性；选择标记 ；转基因
中图分类号：$634 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000-470X(2006)04-0377-04
Kanamycin Resistance of Several Vegetable Brassicas
WANG Feng 一，LU Yong—En 。LI Han—Xia ’
(1．Coaege ofHorticulture and Forestry Sc~ng：es，HuazhongAgrictdtural Univers ，Wuhan 430070，China；
2．Ji’aan UniversityColegeofPharmacy，Guangzhon 510632，China)
Abstract：The use of marker gene is an eficient method to select and identify transgenic cel，tissues and
plan tlets． In the light of kanamycin resistance gene widely used in plant genetic tran sformation，a syste—
matic investigation that contributes to genetic transform ation on resistance of several vegetable brassicas is
made in this experiment．The tests showed that 5 mg／L kanamycin could completely inhibit regeneration
of cotyledon of vegetable brassicas．Kanamycin resistance assay of seedlings suggested the tendency that
cotyledon yelow rates increase，root and stem length decrease，and fresh weigh decrease with the level of
kanamycin improved．This provided a base for genetic tran sform ation of vegetable brassicas and screening
of their offspring．
Key words：Vegetable brassicas；Kanamycin；Sensitivity；Selection marker；Transgene
白菜类蔬菜包括大白菜(Brassica campestris L．
sp．pekinensis)、小白菜(B．caml~stris L．sp．chinen—
s )和菜心(B．campestris L．sp．chinensis var．paa—
chinensis)，均为十字花科 (Cruciferae)芸薹属(Bras—
sica)A基因组作物。结球大白菜在各类蔬菜中栽培
面积最大，且供应量多，销售时间长；小白菜、菜心属
不结球白菜，在长江流域及其以南地区一年多茬栽
培，周年供应。这些蔬菜与人们的 日常生活密切相
关，在农业生产上占有一定的地位。
转基因的方法最常用的有农杆菌介导的遗传转
化法和基因枪转化法。无论哪种方法，转化细胞与
非转化细胞相比都只占少数，而作为异种细胞的转
化细胞的竞争力很弱。基因转化过程中，建立一个
能抑制非转化野生型细胞生长，而对转化细胞影响
不大的选择系统，可有效地提高转化子的筛选效率。
通常这种选择系统是通过导人一个抗生素、药物或
除草剂抗性的选择标记基因来实现。在选择压力
下，未转化细胞受到抑制不能生长、发育，转化细胞
被赋 予 抗 性 能 正 常 生 长、发 育，并 分 化 成 植
株[】]。目前在植物的转化筛选中通常采用卡那霉
素(Km)作为筛选剂，一些研究者利用卡那霉素作
为筛选标记在不同的实验中分别得到相应的转基因
植物 j】。利用标记基因在试管内对大量转基因后
代进行鉴定、筛选，是一种经 济简便 的方法。因
此，探讨白菜类蔬菜种子和幼苗对 Km的敏感性，对
于转基 因植物的后代进行简单有效的筛选和鉴
定，以保证转基因后代的遗传稳定和纯度就显得至
关重要。笔者在此方面做了较系统的探索 ，为白菜
类蔬菜的遗传转化及转基因植株后代鉴定奠定了
基础。
收稿 日期：2005．12431。修回日期：2006435—12。
基金项 目：湖北省武汉市科技攻关项目(992002045)。
作者简介：王峰(19"／9一)，男，博士，助理研究员，主要从事基因工程研究。
十 通讯作者(E—mail：hxli@mail．hzau．edu．cn)。
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378 武 汉 植 物 学 研 究 第 24卷
1 材料与方法
1．1 植物材料
大白菜 (Brassica campestris L．sp．pekinensis)
品种有华阳三号、鲁白六号；小白菜(B．campestris
L．ssp．chinensis)品种有苏州青、矮抗一号；菜心
(Brassica campestris L．ssp．chinensis vaF．paachinen—
s )品种有东莞白沙、49菜心。
1．2 抗生素及培养基的配制
卡那霉素(Km)购自Sigma公司，用无菌双蒸水
配至终浓度为 100 mg／mL，用0．22 m滤膜过滤灭
菌。实验所使用的培养基见表 1。
表 1 培养基一览表
Table 1 Compositions of media
培养基 ‘ 配 方
Media Composition
1／2MS 浓度减半的 MS盐类
SM· ； 瓣 队加· 从 · L
sM2 ； 蔗mg惦／L队加· 从 · L
+培养基中均含琼脂粉7．4 g／L，pH均为5．8。
+All media containing 7．4 s／L agar，pH 5．8．
1．3 实验方法
1．3．1 外植体内源 Kin抗性测验 取大白菜华阳
三号、小白菜苏州青及菜心东莞 白沙子叶分别接种
于含0，1，3，5，l0，20 mg／L Km的相应再生培养基
中，于(25±2)℃、光照强度 1 800 lx，16 h 8 h暗
的光周期等条件下培养。设置 3个重复，观察再生
情况，4周后统计结果。小白菜苏州青的再生培养
基为 SM1，大白菜华阳三号及菜心东莞白沙子叶的
最优再生培养基为 SM2。
1．3．2 幼苗Kin抗性测验 取大白菜华阳三号、鲁
白六号，小白菜苏州青、矮抗一号，菜心东莞白沙、49
菜心种子，先用自来水洗净，70％酒精浸泡 1 min，再
用0．1％ HgCl2溶液表面灭菌 l5～20 min，灭菌蒸馏
水冲洗 3～4次，播种于含不同浓度 Km(100，150，
200，250 mg／L)的 1／2MS培养基上，每个三角瓶内
播80粒左右种子，设置4个重复，于(25±2)℃、光
照强度 1 800 lx，16 h 8 h暗的光周期条件下培
养。观察发芽及出苗情况，并统计比较子叶黄化率、
根长、下胚轴和鲜重，大白菜在播种 1周后统计．小
白菜和菜心在播种后 5 d亏统计。
2 结果与分析
2．1 外植体对 Km抗性
子叶对 Km均表现为非常敏感，在含 Km的培
养基上会逐渐褪绿变 白，最后死亡。Km浓度为
1．0 mg／L时就对各品种子叶再生产生巨大阻碍作
用。不同品种子叶的Km敏感性测验统计结果列于
表 2。测验表明，5．0 mg／L Km可完全抑制大白菜、
小白菜及菜心子叶绿芽的再生，不能分化芽或只能
分化白色芽。因此，应使用5．0 mg／L Km来做筛选
培养，基本上可以保证在直接筛选的情况下没有逃
逸体。
表 2 Km对白菜类蔬菜子叶再生率的影响
Table 2 Efects of kanamycin on cotyledon segments of three
varieties of Brassica campestris
子叶再生率(％)
品种 Regeneration rate of cotyledon segments
Variety 0mCL 1 mCL 3 mCL 5mCL 10mCL 15 mCL 20mCL
Km Km Km Km Km Km Km
2．2 Kin对种子发芽及幼苗黄化率的影响
播种后 1 d内小白菜和菜心就可看见种皮破
裂，而大白菜发芽得慢一些，等到播种后 2 d内种子
才开始萌动。Km对种子萌动并无影响，可能由于
种子表面有种皮以及只接触培养基表面。
种子在未添加 Km的培养基(对照)上生长情
况良好，子叶绿色，充分展开，根系发达。与对照相
比，添加 Km的培养基上的种子均表现为萌动后子
叶不变绿色或只在子叶中心变绿，且伸展不开，根系
不发达，植株矮化等现象，而且 Km浓度越高子叶黄
化率越高、症状越明显(图 1)。而 Km对不同品种
的黄化率影响不同，在 Km浓度为 250 mg／L时华阳
三号和 49菜心的子叶黄化率分别为 94．87％和
87．03％，而鲁白六号和苏州青子叶黄化率分别为
66．66％和 66．oo％(图 2)。
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2．3 Km 对幼 苗生长 的影响
各晶种均表现出随着 Km浓度的提高．根茎变
斌 (罔 3) 鲜重 }轻 的趋势 (图 4)．且 不同 的品种 以
硬幼茼的 同部位对 Km敏感 度不一样 K丌 对
根 【乇、F胚辅和鲜 重均有 负面作用 ．对根长 的影响 比
刘下胚轴和鲜重的影响太．进与根直接牛长在培养
基中有关 对于华 三号柏49菜心．250 m 1 Km
址以使子叶黄化．生长明 受到抑制 因此．转基因
代 种于 可以用 250 L Km来进 行筛选 而鲁 白
六号和苏州青则需要进一步提高Kin浓度才能保证
较好的筛选效果
{菜典蔬禁属 十字花科芸薹届中的栽培变种
群 虽然芸蕞属植物中的甘蓝、芥蔑、甘蓝型油菜等
植物的遗传转化获得丁很大成功．但白菜类蔬菜的
遗传转化报 道很少 其 原困 丰要是 其不 易被农
朴茼感染．且感染后细胞也不易分化 合适的筛
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380 武 汉 植 物 学 研 究 第24卷
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