全 文 ：植物科学学报　 ２０１６ꎬ ３４(２): ２８９~２９８
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｐｌａｎｔｓｃｉｅｎｃｅ.ｃｎ
ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５￣０８３７􀆰 ２０１６􀆰 ２０２８９
何思思ꎬ 高保燕ꎬ 黄罗冬ꎬ 李爱芬ꎬ 张成武. 不同培养模式下魏氏真眼点藻生长和产油特性的研究[Ｊ] . 植物科学学报ꎬ ２０１６ꎬ ３４(２): ２８９－
２９８
Ｈｅ ＳＳꎬ Ｇａｏ ＢＹꎬ Ｈｕａｎｇ ＬＤꎬ Ｌｉ ＡＦꎬ Ｚｈａｎｇ ＣＷ. Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｏｉｌ￣ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ ｖｉｓｃｈｅｒｉ Ｈｉｂｂｅｒｄ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｓ[Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ ２０１６ꎬ ３４(２): ２８９－２９８
不同培养模式下魏氏真眼点藻生长和产油特性的研究
何思思ꎬ 高保燕ꎬ 黄罗冬ꎬ 李爱芬ꎬ 张成武∗
(暨南大学水生生物研究中心ꎬ 生态学系ꎬ 广州 ５１０６３２)
摘　 要: 为了解魏氏真眼点藻(Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ ｖｉｓｃｈｅｒｉ Ｈｉｂｂｅｒｄ)的生物学特性ꎬ 探究“批量法”、 “两步法”、 “补料
法”和“添加碳酸氢盐”４种不同培养模式对魏氏真眼点藻生长和油脂积累的影响ꎬ 本文分别采用不同初始浓度的
硝酸钠供应、 更换培养基、 分次少量补加硝酸钠及添加低浓度 ＮａＨＣＯ３或 ＮＨ４ＨＣＯ３等方法培养魏氏真眼点藻ꎮ
结果显示ꎬ “批量”培养下ꎬ 硝酸钠浓度为 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 时藻细胞生物量达到 ８􀆰４１ ｇ / Ｌꎬ 油脂最高可达到
６５􀆰１６％ꎬ 油脂产率为 ０􀆰３０ ｇ􀅰Ｌ－１􀅰ｄ－１ꎮ “两步法”和“补料法”培养对藻细胞油脂积累没有显著影响ꎬ 而通过“添
加碳酸氢盐”培养对该藻细胞生长和油脂积累的效果最显著ꎬ 其中 ＮａＮＯ３＋ ＮＨ４ＨＣＯ３组生物量达到 １１􀆰５６ ｇ / Ｌꎬ
油脂最高达 ６０􀆰９２％ꎬ 与相同氮浓度“批量”培养相比ꎬ 生物质浓度提高了 １􀆰０ ｇ / Ｌꎬ 总脂含量提高了 １０％ꎬ 大大
提高了该藻的总脂产率(达到 ０􀆰３９ ｇ􀅰Ｌ－１􀅰ｄ－１)ꎮ 因此ꎬ 魏氏真眼点藻是一株高产油藻株ꎬ 当添加低浓度碳酸氢
铵时最有利于促进该藻生物质浓度和总脂含量的提高ꎬ 这是一种最佳的培养模式ꎬ 具有潜在的开发和利用价值ꎮ
关键词: 魏氏真眼点藻ꎻ 培养模式ꎻ 生物质浓度ꎻ 总脂产率ꎻ 碳酸氢盐
中图分类号: Ｑ９４７ꎻ Ｑ９４９􀆰２　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１６)０２￣０２８９￣１０
　 　 　 收稿日期: ２０１５￣０９￣１８ꎬ 退修日期: ２０１５￣１０￣２７ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金项目(３１１７０３３７)ꎻ 国家高技术研究发展计划“８６３”项目(２０１３ＡＡ０６５８０５)ꎻ 广东省低碳专项(２０１１￣
０５１)ꎻ 珠海市科技重大项目(ＰＢ２００４１０１８)ꎻ 珠海市科技攻关项目(ＰＣ２００８１００８)ꎮ
Ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ ｗａｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｇｒａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ (３１１７０３３７)ꎬ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｃｈｉｎａ (８６３ Ｐｒｏｇｒａｍꎬ ２０１３ＡＡ０６５８０５)ꎬ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｌｏｗ￣Ｃａｒｂｏｎꎬ Ｒｅｆｏｒｍ ａｎｄ Ｄｅ￣
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ ( ２０１１￣０５１ )ꎬ Ｍａｊｏｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｚｈｕｈａｉ Ｃｉｔｙ
(ＰＢ２００４１０１８)ꎬ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｒ ＆ Ｄ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ Ｚｈｕｈａｉ Ｃｉｔｙ(ＰＣ２００８１００８) .
　 作者简介: 何思思(１９９０－)ꎬ 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为微藻生物技术和分子生物学(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｚｊｈｅｓｉｓｉ＠１６３􀆰 ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ): 张成武(１９６３－)ꎬ 男ꎬ 教授ꎬ 博士生导师ꎬ 研究方向为微藻生物学和生物技术(Ｅ￣ｍａｉｌ:
ｔｚｈａｎｇｃｗ＠ｊｎｕ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ)ꎮ
Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｏｉｌ￣ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ ｖｉｓｃｈｅｒｉ
Ｈｉｂｂｅｒｄ ｕｎｄｅｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｓ
ＨＥ Ｓｉ￣Ｓｉꎬ ＧＡＯ Ｂａｏ￣Ｙａｎꎬ ＨＵＡＮＧ Ｌｕｏ￣Ｄｏｎｇꎬ ＬＩ Ａｉ￣Ｆｅｎꎬ ＺＨＡＮＧ Ｃｈｅｎｇ￣Ｗｕ∗
(Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｃｏｌｏｇｙꎬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｊｉｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１０６３２ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｗｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｇａ Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ ｖｉｓｃｈｅｒｉ
Ｈｉｂｂｅｒｄꎬ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｒｅｄ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｓ (ｂａｔｃｈꎬ ｔｗｏ￣ｓｔａｇｅꎬ ｆｅｄ￣ｂａｔｃｈ ａｎｄ
ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ￣ａｄｄｉｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ) ｏｎ ｉｔｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ. Ｗｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｅ. ｖｉｓｃｈｅｒｉ ｂｙ
ｓｕｐｐｌｙｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅꎬ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｒｅｐｌａｃｅｄ ｗｉｔｈ ｆｒｅｓｈ ｍｅｄｉｕｍꎬ ｗｉｔｈ ａ ｓｍａｌｌ
ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｎｉｔｒａｔｅ ａｎｄ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｏｒ ａｍｍｏｎｉｕｍ
ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ａｄｄｅｄ. Ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｅａｃｈｅｄ ８􀆰４１ ｇ / Ｌꎬ ｗｈｉｌｅ
ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｗａｓ ６５􀆰１６％ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ０􀆰３０ ｇ􀅰Ｌ－１􀅰ｄ－１ . Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ
ｔｈｅ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅꎬ ｔｈｅ ｔｗｏ￣ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｆｅｄ￣ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｌｉｐｉｄ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅ. ｖｉｓｃｈｅｒｉ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ￣ａｄｄｉｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｄ ｈａｖｅ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ
ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎꎬ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｍａｘｉｍｕｍ ｂｉｏｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ
ＮａＮＯ３＋ ＮＨ４ＨＣＯ３ ｇｒｏｕｐꎬ ｗｈｉｃｈ ｒｅａｃｈｅｄ １１􀆰５６ ｇ / Ｌꎬ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｒｅａｃｈｅｄ ６０􀆰９２％.
Ｔｈｕｓꎬ ｔｈｅ ｂｉｏｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ａｌｍｏｓｔ １􀆰０ ｇ / Ｌ ａｎｄ １０％ꎬ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ. Ｉｎ
ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄｓ ａｌｓｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ (０􀆰３９ ｇ􀅰Ｌ－１􀅰ｄ－１) . Ｏｕｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ
ｔｈａｔ Ｅ. ｖｉｓｃｈｅｒｉ ｉｓ ａｎ ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ ｍｉｃｒｏａｌｇａ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ.
Ｍｏｒｅｏｖｅｒꎬ ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｏｗ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ
ａｎｄ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ. ｖｉｓｃｈｅｒｉꎬ ａｎｄ ｉｓ ｔｈｕｓ ａ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ ｖｉｓｃｈｅｒｉ Ｈｉｂｂｅｒｄꎻ Ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｓꎻ Ｂｉｏｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎻ Ｐｒｏ￣
ｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄｓꎻ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ
　 　 真眼点藻纲是 Ｈｉｂｂｅｒｄ 等[１]１９７０ 年根据其细
胞学和超微结构特征从黄藻纲(Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｃｅａｅ)中
分离出来而成立的一个新纲ꎮ 该纲的藻类仅含有叶
绿素 ａꎬ 主要的类胡萝卜素为堇菜黄素、 无隔藻黄
素和 β￣胡萝卜素[２]ꎮ 该纲的大多数种类富含油脂ꎬ
均含有二十碳五烯酸(ＥＰＡ)ꎬ 可作为生产 ＥＰＡ 和
类胡萝卜素的潜在藻株和极具微藻生物能源开发潜
力的藻种资源ꎮ
魏氏真眼点藻(Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ ｖｉｓｃｈｅｒｉ Ｈｉｂｂｅｒｄ)
属于真眼点藻纲真眼点藻属 (Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ”) [２]ꎮ
前期的研究发现[３]ꎬ 不同初始硝酸钠浓度培养条
件下魏氏真眼点藻的生长、 形态变化和油脂积累明
显不同ꎬ 在高氮浓度(１７􀆰６ ｍｍｏｌ / Ｌ)下生物质浓度
可达到 ９􀆰１４ ｇ / Ｌꎻ 低氮条件(３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ)下生物
质浓度达到 ６􀆰５１ ｇ / Ｌꎬ 油脂含量达到 ６０􀆰８１％ꎮ 表
明该藻是一株高产油藻株ꎬ 在高氮浓度下其生物质
积累量较高ꎬ 总脂含量则随着氮浓度的降低而升
高ꎬ 具有较高的研究和开发利用价值ꎮ
不同培养条件下藻细胞的生长存在较大的差
异ꎬ 而目前有较多的研究主要集中在光照强度、 温
度、 ｐＨ值和盐度等环境因素对藻类细胞生长的影
响[４]ꎮ 为了进一步提高微藻油脂产率、 降低生产
成本ꎬ 应针对不同培养方式对微藻生长和代谢产物
积累的影响进行深入研究ꎮ Ｐｒｏｃｈáｚｋｏｖá 等[５]认
为ꎬ 通过改变培养基中的营养盐浓度或者采用不同
的培养方式ꎬ 可以改变微藻生长及其细胞内脂类、
多糖和色素等代谢产物的合成途径ꎬ 是一种较为快
速、 有效提高微藻生长和代谢产物积累的手段ꎮ
因此ꎬ 本研究利用不同氮浓度供应、 更换培养
基、 补加氮源或添加低浓度 ＮａＨＣＯ３或 ＮＨ４ＨＣＯ３
等方法ꎬ 测定魏氏真眼点藻不同培养条件下生物质
浓度、 总脂含量和总脂产率等指标的变化规律ꎬ 比
较“批量”、 “两步法”、 “补料法”和“添加碳酸氢
盐” ４种培养模式对魏氏真眼点藻生长和油脂积累
的影响ꎬ 旨在为获得微藻的优化培养方式和提高微
藻油脂产率提供理论依据ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 藻种
魏氏真眼点藻(Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ ｖｉｓｃｈｅｒｉ Ｈｉｂｂｅｒｄ
Ｓｔｒａｉｎ ＪＮＵ４)ꎬ 购自德国哥廷根大学藻种库ꎬ 由暨
南大学水生生物研究中心微藻生物技术与生物能源
实验室保藏ꎮ
１􀆰 ２　 主要仪器与试剂
仪器: 高速冷冻离心机(ＳＯＲＶＡＬＬ ｂｉｏｆｕｇｅ)、
紫外分光光度计(ＵＶ￣２４５０)、 冷冻干燥机(ＶｉｒＴｉｓ
ｗｉｚａｒｄ ２􀆰０)、 氮吹仪(Ｎ￣ＥＶＡＰＴＭ１１１)、 恒温磁力
搅拌器(９４￣２ ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ)等ꎮ
试剂: 硝酸钠、 碳酸氢钠、 碳酸氢铵、 二甲基
亚砜、 甲醇、 乙醚、 正己烷等试剂均为分析纯ꎮ
１􀆰 ３　 魏氏真眼点藻的培养
利用柱状光生物反应器(Ø ３ ｃｍ × ６０ ｃｍ)培
养藻细胞ꎬ 加富 １％ ＣＯ２的压缩空气ꎬ ３００ μｍｏｌ
ｐｈｔｏｎｓ􀅰ｍ－２􀅰ｓ－１单侧连续光照ꎬ 培养温度控制在
(２５ ± １)℃ꎬ 初始接种浓度为 ＯＤ７５０ ＝ ０􀆰５５ ±
０􀆰０２ꎬ 培养基为改良的 ＢＧ￣１１ 培养基ꎮ 培养周期
为 １８ ｄꎬ 每天取样测定生物质浓度ꎬ 每 ３ ｄ 收集
藻样冻干测定总脂含量ꎬ 每个实验组设置 ３ 个
平行ꎮ
１􀆰 ３􀆰 １　 “批量”培养
以硝酸钠为氮源ꎬ 设置 １８􀆰０、 １２􀆰０、 ６􀆰０、
３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ４种初始浓度ꎬ 培养至第 １８ ｄꎮ
０９２ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷　
１􀆰 ３􀆰 ２　 “两步法”培养
以硝酸钠为氮源ꎬ 设置 １８􀆰０、 １２􀆰０、 ６􀆰０、
３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ４ 种初始浓度ꎬ 培养至对数中期(第
９ ｄ)时ꎬ 离心弃出原培养基ꎬ 将藻细胞分别转入
不含氮源的新鲜 ＢＧ￣１１ 培养基中ꎬ 继续培养至第
１８ ｄꎮ
１􀆰 ３􀆰 ３　 “补料法”培养
(１)３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ补氮组: 以 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ硝酸
钠浓度为初始培养浓度ꎬ 每隔 ３ ｄ向培养液中补加
硝酸钠 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌꎬ 共补氮 ５ 次ꎬ 总共补加氮浓
度为 １８􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌꎬ 培养至第 １８ ｄꎮ
(２)１􀆰５ ｍｍｏｌ / Ｌ补氮组: 以 １􀆰５ ｍｍｏｌ / Ｌ硝酸
钠为初始浓度ꎬ 每隔 ２ ｄ 补加硝酸钠 １􀆰５ ｍｍｏｌ / Ｌꎬ
共补氮 ７次ꎬ 最终总氮浓度为 １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌꎬ 培养
至第 １８ ｄꎮ
１􀆰 ３􀆰 ４　 “添加碳酸氢盐”培养
(１)ＮａＮＯ３＋ ＮＨ４ＨＣＯ３组: 先以 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ
硝酸钠浓度作为初始培养浓度ꎬ 每隔 ３ ｄ 补加
３􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ 硝酸钠ꎬ 补加 ２ 次后培养至第 ９ ｄꎬ
再向其中加入 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３ꎬ 总氮浓度
仍为 １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌꎬ 分别通空气和 １％ ＣＯ２两种通
气方式培养至第 １８ ｄꎮ
(２) ＮａＮＯ３ ＋ ＮａＨＣＯ３ 组: 每隔 ３ ｄ 补加
３􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ 硝酸钠ꎬ 补加 ２次后培养至第 ９ ｄꎬ 再
加入 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＮＯ３和 ２５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＨＣＯ３ꎬ
维持总氮浓度在 １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌꎬ 分别通空气和 １％
ＣＯ２培养至第 １８ ｄꎮ
(３)以 ３􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ ＨＣＯ３作为初始氮
源ꎬ ３􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＋ ３ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３组每隔
３ ｄ 补加 ３􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３ꎬ 共补加 ３ 次ꎻ
３􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＋ １ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３组先每隔 ３ ｄ
补加 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３ꎬ 补加 ２ 次培养至第
９ ｄꎬ 随后每隔 ２ ｄ 补加 １􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３ꎬ
共补加 ３次ꎬ 最终总氮浓度为 １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌꎮ
１􀆰 ４　 ｐＨ值测定
每天取少量“添加碳酸氢盐”培养模式下各个
实验组的样品ꎬ 利用 ｐＨ测试仪实时测定培养液的
ｐＨ值ꎮ
１􀆰 ５　 生物质浓度的测定
每天取各个培养组的藻液 ５ ｍＬꎬ 于 ０􀆰４５ μｍ
混合纤维滤膜(预先烘至恒重)真空抽滤ꎬ 然后于
１０５℃烘箱中烘干至恒重ꎮ 用单位体积藻样的干重
(ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔꎬ ＤＣＷ)表示ꎬ 即:
ＤＣＷ(ｇ / Ｌ) ＝ ２００ × (Ｗ２－Ｗ１)ꎮ
其中ꎬ Ｗ１为混合纤维滤膜烘至恒重后的重量ꎻ
Ｗ２为滤膜和藻样烘至恒重后的总重量ꎮ
１􀆰 ６　 总脂含量的测定
每隔 ３ ｄ 取各个实验组一定体积的藻液ꎬ
３０００ ｒ / ｍｉｎ 离心 ５ ｍｉｎꎬ 收集藻泥置于小塑料瓶
中ꎬ 于冷冻干燥机中冷冻干燥ꎮ 冻干的藻粉贮存在
４℃冰箱中备用ꎮ 取适量冻干的藻粉ꎬ 按照 Ｋｈｏ￣
ｚｉｎ￣Ｇｏｌｄｂｅｒｇ 等[６]的方法并加以改良提取总脂ꎮ
操作步骤为:
① 准确称取一定量的藻粉(记为 Ｍ０)ꎬ 置于预
先放入转子的玻璃离心管中ꎻ ② 加入 ２ ｍＬ二甲基
亚砜￣甲醇混合液(Ｖ ∶ Ｖ ＝ １ ∶ ９)ꎬ ５０℃水浴搅拌
１􀆰５ ｈꎬ 再冰浴磁力搅拌 １􀆰５ ｈꎬ ３０００ ｒ / ｍｉｎ 离心
３ ｍｉｎꎬ 收集上清液ꎻ ③ 再向上述藻渣中加入
４ ｍＬ 乙醚￣正己烷混合液(Ｖ ∶ Ｖ ＝ １∶ １)ꎬ 冰浴搅拌
抽提 １􀆰５ ｈꎬ ３０００ ｒ / ｍｉｎ离心 ３ ｍｉｎꎬ 收集上清液ꎻ
④ 重复上述步骤ꎬ 直至藻渣提取完全ꎬ 变成白色
或灰白色ꎻ ⑤ 合并所有上清液ꎬ 加入４ ｍＬ 蒸馏
水ꎬ 静置分层ꎻ ⑥ 将上层有机相浓缩转移至预先称
重的 ２ ｍＬ ＥＰ管中ꎬ 用氮气完全吹干至不含有机溶
剂ꎬ 称重ꎬ 于－２０℃冰箱中保存备用ꎮ 每个取样点
设置 ２个平行ꎬ 利用差重法计算总脂的绝对含量(占
藻粉干重的百分比)ꎬ 计算公式为:
总脂含量(％ ＤＣＷ) ＝ (Ｍ２－Ｍ１) /Ｍ０× １００％ꎮ
其中ꎬ Ｍ１为空 ＥＰ 管的重量ꎻ Ｍ２为含总脂的
ＥＰ管的总重量ꎮ
１􀆰 ７　 总脂产率的计算
单位体积总脂产率: Ｐ (ｇ􀅰Ｌ－１􀅰ｄ－１) ＝ (ｍｔ×
Ｌｔ) / ｔ ꎮ
其中ꎬ ｍｔ为收获时藻的生物质浓度(ｇ / Ｌ)ꎻ Ｌｔ
为收获时总脂含量(％ ＤＣＷ)ꎻ ｔ 为培养时间(ｄ)ꎮ
１􀆰 ８　 数据处理与分析
采用 Ｅｘｃｅｌ 和 Ｏｒｉｇｉｎ ８􀆰６ 对数据进行分析处
理ꎬ 并用软件 ＳＰＳＳ １３􀆰０ 对数据进行单因素方差
分析(Ｄｕｎｃａｎ法)ꎬ Ｐ < ０􀆰０５表示差异显著水平ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 不同培养方式下魏氏真眼点藻生物质浓度的
时相变化
通过比较 “批量”、 “两步法”、 “补料法”、
１９２　 第 ２期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 何思思等: 不同培养模式下魏氏真眼点藻生长和产油特性的研究
“添加碳酸氢盐”４ 种培养模式下魏氏真眼点藻生
物质浓度在培养周期内的变化情况可知ꎬ 以硝酸
钠为初始氮源对魏氏真眼点藻进行“批量”培养
(图 １: Ａ)ꎬ 在培养末期其生物质浓度获得最高
值ꎬ 且随着氮源浓度的加大而升高的大小顺序
为: １８􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组(１０􀆰６９ ｇ / Ｌ) > １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ
组(１０􀆰５８ ｇ / Ｌ) > ６􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组 (１０􀆰５６ ｇ / Ｌ) >
３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ组(８􀆰 ４１ ｇ / Ｌ) ꎮ 单因素方差分析结
果表明ꎬ １８􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组、 １２􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组和
６􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组三者之间差异不显著(Ｐ > ０􀆰０５)ꎬ
但与 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ低氮组差异显著(Ｐ < ０􀆰０５)ꎮ
与“批量”培养相比ꎬ “两步法”培养(图 １: Ｂ)
通过更换培养基的方法ꎬ 在培养至第 ９ ｄ 后改
用新无氮 ＢＧ￣１１ 培养基进行培养ꎬ 此时藻细胞
的生物质浓度先小幅下降、 然后快速生长ꎬ 培
养至第１８ ｄ 时ꎬ １８􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组和 １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ
组生长最快ꎬ 分别获得生物质浓度 １０􀆰８２ ｇ / Ｌ 和
１０􀆰７９ ｇ / Ｌꎬ 各浓度组与“批量”培养相比没有显著
差异(Ｐ > ０􀆰０５)ꎮ
采用“补料法”培养的 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 补氮组和
１􀆰５ ｍｍｏｌ / Ｌ补氮组的结果显示(图 １: Ｃ、 Ｄ)ꎬ 随
着培 养 时 间 的 推 移 和 硝 酸 钠 的 不 断 补 给ꎬ
３􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ 补氮组藻细胞的生长逐渐趋向于
１８􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组ꎬ 至培养末期生物质浓度达到
１０􀆰３０ ｇ / Ｌꎻ 同样 １􀆰５ ｍｍｏｌ / Ｌ 补氮组与“批量”培
养的 １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组接近ꎬ 最终生物质浓度达到
１０􀆰９０ ｇ / Ｌꎮ 与“批量”培养相比ꎬ “补料法”培养对
魏氏真眼点藻细胞生长的影响不显著(Ｐ > ０􀆰０５)ꎮ
采用“添加碳酸氢盐”培养方式培养魏氏真眼
点藻的结果显示(图 １: Ｅ、 Ｆ)ꎬ 各实验组生物质浓
度间差异显著(Ｐ < ０􀆰０５)ꎬ 通 ＣＯ２培养的各组藻
细胞生长显著快于通空气培养(Ｐ < ０􀆰０１)ꎬ 且通
ＣＯ２培养中 ＮａＮＯ３ ＋ ＮＨ４ＨＣＯ３ 组又显著快于
ＮａＮＯ３＋ ＮａＨＣＯ３组(Ｐ < ０􀆰０５)ꎬ 至第 １８ ｄ 时获
得最高生物质浓度分别为 １１􀆰５６ ｇ / Ｌ和 １０􀆰５２ ｇ / Ｌ
(图 １: Ｅ)ꎮ 其最高生物质浓度与“批量”培养相比
提高了约 １􀆰０ ｇ / Ｌꎮ 因此ꎬ 继续以 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ
ＮＨ４ＨＣＯ３为初始氮源并结合补料法进行培养ꎬ 设置
３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＋ ３ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３组和 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ
＋ １􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３组进行实验ꎬ 结果显示(图
１: Ｆ)ꎬ 随着培养时间的延长ꎬ 各组藻细胞呈快速生
长状态ꎬ ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＋ １􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３组和
３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＋ ３􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３组之间没有
显著差异(Ｐ > ０􀆰０５)ꎬ 最终生物质浓度分别达到
１１􀆰５１ ｇ / Ｌ 和 １１􀆰５６ ｇ / Ｌꎬ 并且高于 １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ
ＮＨ４ＨＣＯ３组(１０􀆰５７ ｇ / Ｌ)ꎮ
综上分析可见ꎬ “添加碳酸氢盐”培养对魏氏
真眼点藻细胞生长影响最显著ꎬ 其中 ＮａＮＯ３ ＋
ＮＨ４ＨＣＯ３组、 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＋ ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３
组和 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＋ １􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３组的效
果最显著ꎬ 与“批量”培养相比生物质浓度提高了
约 １􀆰０ ｇ / Ｌꎻ 而“两步法”培养和“补料法”培养对该
藻生长影响不显著ꎮ
２􀆰 ２　 “添加碳酸氢盐”培养对培养基中 ｐＨ 值的
影响
向培养基中加入 ＮＨ４ＨＣＯ３或 ＮａＨＣＯ３进行
“添加碳酸氢盐”培养过程中ꎬ 实时检测培养基中
ｐＨ值的变化ꎮ 从图 ２: Ａ 可看出ꎬ 添加低浓度
ＮＨ４ＨＣＯ３和 ＮａＨＣＯ３后分别进行通空气和通 ＣＯ２
培养ꎬ 培养前期(０ ~ ９ ｄ)各实验组培养条件相
同ꎬ 藻细胞生长状况一致ꎬ ｐＨ 维持在 ７􀆰５ 左右ꎬ
第 ９ ｄ 加入 ＮＨ４ＨＣＯ３或 ＮａＨＣＯ３后ꎬ 通空气培
养的培养基中 ｐＨ 迅速上升ꎬ ｐＨ > ９ 甚至达到
１１ꎬ 而通 ＣＯ２的实验组中添加 ＮａＨＣＯ３后培养基
ｐＨ到达 ８􀆰０ 左右ꎬ 添加 ＮＨ４ＨＣＯ３后 ｐＨ 略有下
降ꎬ 约为 ７􀆰３ꎮ 从图 ２: Ｂ 可看出ꎬ 随着培养时间
的延长ꎬ ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＋ ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３组
和 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＋ １􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３组培养基
中的 ｐＨ 均发生了变化ꎬ 在整个培养周期内 ｐＨ 呈
持续下降的趋势ꎬ 且最终维持在 ｐＨ ５􀆰０左右ꎮ
２􀆰 ３　 不同培养方法对魏氏真眼点藻油脂积累的
影响
“批量”、 “两步法”、 “补料法”、 “添加碳酸
氢盐”４种培养模式对魏氏真眼点藻总脂含量均产
生了影响(图 ３)ꎮ
从“批量”培养过程可以看出(图 ３: Ａ)ꎬ 整个
培养周期内ꎬ 魏氏真眼点藻细胞内油脂逐渐积累ꎬ
且随着硝酸钠浓度的降低ꎬ 细胞内总脂含量(占细
胞干重)升高ꎬ 到第 １８ ｄ 时达到最高值ꎬ 各浓度
组总脂含量分别为 ５０􀆰５９％ (１８􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组)、
５１􀆰３０％(１２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ组)、 ６１􀆰２７％(６􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ
组)和 ６５􀆰１６％(３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ组)ꎮ
２９２ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷　
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18.0 mmol / L 18.0 mmol / L
12.0 mmol / L 12.0 mmol / L
6.0 mmol / L 6.0 mmol / L
3.0 mmol / L 3.0 mmol / L
18.0 mmol / L
+ 3.0 mmol / L
3.0 mmol / L
12.0 mmol / L
+ 1.5 mmol / L
1.5 mmol / L
+ 3.0 mmol / L NaNO - NaHCO / Air
+ 3.0 mmol / L NaNO - NH HCO / Air
+ 3.0 mmol / L NaNO - NaHCO / CO
+ 3.0 mmol / L NaNO - NH HCO / CO
3 3
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3 3 2
3 4 3 2
3.0 mmol / L NH HCO / CO
3.0 mmol / L + 1 NH HCO / CO
3.0 mmol / L + 3 NH HCO / CO
12.0 mmol / L NH HCO / CO
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4 3 2
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Ａ: “批量”培养ꎻ Ｂ: “两步法”培养ꎻ Ｃ和 Ｄ分别代表“补料法”培养的 ２个处理组ꎻ Ｅ和 Ｆ为“添加碳酸氢盐”培养的各处理组(箭
头指示各处理组更换培养基位点或补氮位点)ꎮ
Ａ: Ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅꎻ Ｂ: Ｔｗｏ￣ｓｔａｇｅ ｃｕｌｔｕｒｅꎻ Ｃ ａｎｄ Ｄ: Ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｆｅｄ￣ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｅ ａｎｄ Ｆ: Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ￣ａｄｄｉｔｉｏｎ
ｃｕｌｔｕｒｅ (ａｒｒｏｗｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｍｅｄｉｕｍ ｏｒ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｎｉｔｒｏｇｅｎ) .
图 １　 不同培养模式下魏氏真眼点藻生物质浓度的变化
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｂｉｏｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ ｖｉｓｃｈｅｒｉ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｓ
　 　 分别比较“两步法” 、 “补料法” 、 “添加碳
酸氢盐” ３ 种培养模式下藻细胞油脂积累情况ꎬ
结果显示(图 ３: Ｂ ~ Ｆ) ꎬ ３ 种培养模式下油脂
积累规律与“批量”培养相同ꎬ 均在培养末期达
到最高值ꎮ
“两步法”培养(图 ３: Ｂ)的各浓度组总脂含
量分别为 ５０􀆰３４％ ( １８􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组)、 ５３􀆰８３％
(１２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组)、 ６１􀆰１３％(６􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组)和
６５􀆰１６％(３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组)ꎬ 与“批量”培养各浓度
组相比没有显著差异(Ｐ > ０􀆰０５)ꎮ
３９２　 第 ２期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 何思思等: 不同培养模式下魏氏真眼点藻生长和产油特性的研究
+ 3.0 mmol / L NaNO
+ 3.0 mmol / L NaNO NaHCO / Air
+ 3.0 mmol / L NaNO NH HCO / Air
+ 3.0 mmol / L NaNO NaHCO / CO
+ 3.0 mmol / L NaNO NH HCO / CO
3
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3 4 3
3 3 2
3 4 3 2
-
-
-
-
3.0 mmol / L NH HCO / CO
3.0 mmol / L + 1 mmol / L NH HCO / CO
3.0 mmol / L + 3 mmol / L NH HCO / CO
12.0 mmol / L NH HCO / CO
4 3 2
4 3 2
4 3 2
4 3 2
A
B
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9.0
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7.5
7.0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
pH
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0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
pH
!"#$ ( )Cultivation time d !
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
图 ２　 “添加碳酸氢盐”培养中培养基 ｐＨ值的变化
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐＨ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ￣ａｄｄｉｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ
　 　 通过“补料法”培养发现(图 ３: Ｃ 和 Ｄ)ꎬ 随着
硝酸钠的不断加入和培养时间的延长ꎬ ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ
补氮组藻细胞油脂积累明显高于 １８􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组
(５０􀆰６２％)ꎬ 油脂含量达到细胞干重的 ５４􀆰７１％ꎬ
增加了 ４􀆰０９％ꎮ 而 １􀆰５ ｍｍｏｌ / Ｌ 补氮组(４８􀆰４６％)
与 １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ组(５１􀆰３０％)相比略有下降ꎮ 其原
因可能是补加的氮源浓度过低ꎬ 随着培养时间延长
细胞内氮素消耗殆尽ꎬ 藻细胞内油脂积累受到
影响ꎮ
“添加碳酸氢盐”培养过程中ꎬ 各浓度组总脂
含量呈快速上升趋势(图 ３: Ｅ 和 Ｆ)ꎮ 培养至 １２ ｄ
后增长缓慢并逐渐趋于稳定ꎮ 当培养到第 １８ ｄ时ꎬ
通空气培养的 ＮａＮＯ３ ＋ ＮａＨＣＯ３组与 ＮａＮＯ３ ＋
ＮＨ４ＨＣＯ３组总脂含量分别为 ６０􀆰２５％和 ５８􀆰５５％ꎬ
通 ＣＯ２培养条件下 ２ 个处理组分别为 ６０􀆰２９％和
６０􀆰９２％ꎬ 这 ４ 个培养组间没有显著差异 ( Ｐ >
０􀆰０５)ꎬ 但与 “批量 ” 培养的 １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组
(５１􀆰３０％)相比提高了约 １０％且差异极显著(Ｐ <
０􀆰０１)ꎮ 而 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＋ ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３
组和 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＋ １􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３组藻细
胞的总脂含量分别为 ５５􀆰７４％和 ５７􀆰７３％ꎬ 分别提
高了 ４􀆰４４％和 ６􀆰４３％ꎮ
以上结果表明ꎬ “两步法”培养对魏氏真眼点
藻细胞油脂积累没有显著影响ꎻ “补料法”培养对
油脂的积累有一定促进作用ꎬ 但效果不显著ꎻ “添
加碳酸氢盐”培养对该藻细胞油脂积累影响最
显著ꎮ
２􀆰 ４　 不同培养方式对魏氏真眼点藻总脂产率的
影响
采用 ４ 种培养模式培养魏氏真眼点藻至第
１８ ｄ 时ꎬ 各处理组藻细胞总脂产率的变化各有不
同(图 ４)ꎮ
“批量”培养条件下藻细胞总脂产率在 ６􀆰０ ｍｍｏｌ /
Ｌ组最高ꎬ 达到 ０􀆰３６ ｇ􀅰Ｌ－１􀅰ｄ－１ꎻ １８􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ
组、 １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ组和 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组之间没有显
著差异(Ｐ > ０􀆰０５)ꎬ 约为 ０􀆰３０ ｇ􀅰Ｌ－１􀅰ｄ－１ꎮ “两步
法”培养条件下ꎬ 各个浓度组总脂产率与“批量”
培养各处理组相比差异不显著(Ｐ > ０􀆰０５)ꎬ 其中
在 ６􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组获得最高值(０􀆰３５ ｇ􀅰Ｌ－１􀅰ｄ－１)ꎮ
“补料法” 培养条件下 ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 补氮组和
１􀆰 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ 补氮组获得的总脂产率分别为 ０􀆰３１ ｇ􀅰
Ｌ－１􀅰ｄ－１和 ０􀆰２９ ｇ􀅰Ｌ－１􀅰ｄ－１ꎬ 与“批量”培养中的
１８􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组和 １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 组相近ꎬ 两者之
间差异不显著(Ｐ > ０􀆰０５ꎬ 图 ４: Ａ)ꎮ
“添加碳酸氢盐”培养的结果显示(图 ４: Ｂ)ꎬ
通 ＣＯ２培养的各处理组明显高于通空气培养的各
处理组ꎬ 各处理组总脂产率的大小为: ＮａＮＯ３ ＋
ＮＨ４ＨＣＯ３组(０􀆰３９ ｇ􀅰Ｌ
－１􀅰ｄ－１ ) > ３􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＋
３􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ ＨＣＯ３组 ( ０􀆰３７ ｇ􀅰Ｌ
－１􀅰ｄ－１ ) >
３􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＋ １􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３组(０􀆰３６ ｇ􀅰
Ｌ－１􀅰ｄ－１)> ＮａＮＯ３＋ ＮａＨＣＯ３组(０􀆰３５ ｇ􀅰Ｌ
－１􀅰ｄ－１)ꎬ
与“批量”培养的 １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ组总脂产率(０􀆰３０ ｇ􀅰
Ｌ－１􀅰ｄ－１)相比ꎬ 增长幅度较大ꎬ 最高增长幅度为
０􀆰０９ ｇ􀅰Ｌ－１􀅰ｄ－１ꎮ
４９２ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷　
18.0 mmol / L 18.0 mmol / L
12.0 mmol / L 12.0 mmol / L
3.0 mmol / L 3.0 mmol / L
6.0 mmol / L 6.0 mmol / L
+ 3.0 mmol / L + 1.5 mmol / L
18.0 mmol / L 12.0 mmol / L
3.0 mmol / L 1.5 mmol / L
+ 3.0 mmol / L NaNO NaHCO / Air3 3-
+ 3.0 mmol / L NaNO NH HCO / Air3 4 3-
+ 3.0 mmol / L NaNO NaHCO / CO3 3 2-
+ 3.0 mmol / L NaNO NH HCO / CO3 4 3 2-
12.0 mmol / L NH HCO / CO4 3 2
3.0 mmol / L + 1 mmol / L NH HCO / CO4 3 2
3.0 mmol / L NH HCO / CO4 3 2
3.0 mmol / L + 3 mmol / L NH HCO / CO4 3 2
+ 3.0 mmol / L NaNO3
70
70
70
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50
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40 40
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30
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0
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3 3
3 3
3 3
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6 6
6 6
9 9
9 9
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12 12
12 12
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15 15
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Ａ: “批量”培养ꎻ Ｂ: “两步法”培养ꎻ Ｃ和 Ｄ分别代表“补料法”培养的 ２个处理组ꎻ Ｅ 和 Ｆ为“添加碳酸氢盐”培养的
各处理组ꎮ
Ａ: Ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅꎻ Ｂ: Ｔｗｏ￣ｓｔａｇｅ ｃｕｌｔｕｒｅꎻ Ｃ ａｎｄ Ｄ: Ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ ｆｅｄ￣ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ Ｅ ａｎｄ Ｆ: Ｂｉｃａｒｂｏｎ￣
ａｔｅ￣ａｄｄｉｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ.
图 ３　 不同培养模式对魏氏真眼点藻总脂积累的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｓ ｏｎ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ ｖｉｓｃｈｅｒｉ
　 　 以上结果表明ꎬ “两步法”培养和“补料法”培
养对总脂产率的提高作用不明显ꎮ 然而ꎬ 通过“添
加碳酸氢盐”培养最有利于提高魏氏真眼点藻细胞
总脂产率ꎮ
３　 讨论
铵盐、 尿素和硝酸盐是微藻培养过程中常见的
氮素来源ꎮ 目前硝酸盐的应用广泛ꎬ 在微藻中的研
５９２　 第 ２期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 何思思等: 不同培养模式下魏氏真眼点藻生长和产油特性的研究
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18.0 mmol / L
12.0 mmol / L
6.0 mmol / L
3.0 mmol / L
+ 3.0 mmol / L
+ 1.5 mmol / L
“"#”%& “()”%& “*+)”%&
+ 3.0 mmol / L NaNO NaHCO / Air
+ 3.0 mmol / L NaNO NH HCO / Air
+ 3.0 mmol / L NaNO NaHCO / CO
+ 3.0 mmol / L NaNO NH HCO / CO
3 3
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12.0 mmol / L NH HCO / CO
3.0 mmol / L + 1 NH HCO / CO
3.0 mmol / L + 3 NH HCO / CO
mmol / L
mmol / L
A B0.50
0.45
0.40
0.35
0.30
0.25
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0.15
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图 ４　 不同培养模式对魏氏真眼点藻总脂产率的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｌｉｐｉｄｓ ｉｎ Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｓ ｖｉｓｃｈｅｒｉ
究也较多ꎮ Ｘｕ 等[７]研究认为ꎬ 真眼点藻纲椭圆藻
属(Ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｉｏｎ ｓｐ.)在铵盐中培养比在尿素和硝酸
盐中培养更有利于其生长和油脂积累ꎮ 而对小球藻
属(Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ.)和富油新绿藻(Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｏｌｅｏ￣
ａｂｕｎｄａｎｓ Ｃｈａｎｔａｎａｃｈａｔ)培养的研究结果恰恰相
反[８－１０]ꎮ 微藻吸收氮源存在两种转化机制: ＮＯ－３ /
ＮＯ－２(细胞质)和 ＮＯ
－
２ / ＮＨ
＋
４(叶绿体)ꎬ 最终以 ＮＨ
＋
４
形式进入藻细胞中[５]ꎮ 所以以铵态氮为氮源比硝
酸态更有利于藻细胞的吸收和利用ꎮ 但铵盐在培养
过程中产生的 ＮＨ３对藻细胞有毒害作用ꎬ 同时ꎬ
添加铵盐培养过程中ꎬ 培养基 ｐＨ 值随着铵盐的吸
收而变化ꎬ 使藻细胞无法承受过高浓度的铵盐ꎬ 因
此培养时其浓度不宜过高ꎮ
微藻总脂产率是由其生物质浓度和总脂含量
共同决定的ꎮ Ｚｈｅｎｇ 等[１１]研究发现ꎬ 改变索罗金
小球藻(Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｏｒｏｋｉｎｉａｎａ Ｓｈｉｈｈａｒａ ｅｔ Ｋｒａｕｓｓ)
培养基成分进行“两步法”培养ꎬ 在第一阶段生物
质浓度快速积累(从 １􀆰３ ｇ / Ｌ 到 ７３􀆰９ ｇ / Ｌ)ꎬ 此时
总脂含量仅占细胞干重的 １４􀆰５％ꎬ 第二阶段总脂
开始大量积累ꎬ 达到 ３８􀆰７％ꎬ 这与正常“批量”培
养相比ꎬ 生物质浓度和总脂含量均大大提高ꎮ Ｄｅ
Ｓｗａａｆ等[１２]研究认为ꎬ 寇氏隐甲藻 (Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏ￣
ｄｉｎｉｕｍ ｃｏｈｎｉｉ (Ｓｅｌｉｇｏ) Ｊａｖｏｒｎｉｃｋｙ)通过补加乙酸
进行“补料法”培养后ꎬ 生物质浓度、 总脂含量和
ＤＨＡ 含量均明显提高 (分别达到 １０９、 ６１、
１９ ｇ / Ｌ)ꎮ 此外ꎬ 近年来有文献报道ꎬ 高 ｐＨ 值和
低氮胁迫条件有利于微藻细胞内三酰甘油(ＴＡＧ)
的积累ꎬ 例如: Ｇａｒｄｎｅｒ 等[１３]研究发现ꎬ 绿藻纲
栅藻(Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｓｐ.)在高度碱性(ｐＨ > ９)环
境下 ＴＡＧ积累量有所增加ꎻ Ｇａｒｄｎｅｒ 等[１４ꎬ１５]研究
发现ꎬ 三角褐指藻 ( Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ
Ｂｏｈｌｉｎ)和莱茵衣藻 (Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ
Ｄａｎｇ) 培养过程中分别引入 ２５ ｍｍｏｌ / Ｌ 和
５０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＨＣＯ３有利于细胞内 ＴＡＧ 积累ꎮ 但
并不是所有的微藻都适应高 ｐＨ 环境ꎬ ｐＨ 过高反
而可能抑制藻细胞生长ꎬ 例如: 叶林超等[１６]研究
不同氮源对小球藻 ( Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｂｅｉｊｉｅｒｉ￣
ｎｅｃｋ)生长影响的结果发现ꎬ ５０ ｍｇ / Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３
(弱碱性)对该藻作用效果最好ꎮ
本研究中ꎬ “批量”培养条件下魏氏真眼点藻
在 １８􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ和 １２􀆰０ ｍｍｏｌ / Ｌ 初始硝酸钠浓度
下获得了较高生物质浓度和总脂含量ꎬ 但此时与低
氮浓度组相比总脂含量相对较低ꎮ “两步法”培养
和“补料法”培养可使藻细胞先在高氮浓度时生长、
低氮限制下积累油脂或者先在低氮条件下积累油
脂、 再通过不断补加氮源使细胞生长[１７]ꎮ 许多研
究表明ꎬ “两步法”培养和“补料法”培养能有效促
进微藻细胞生长和油脂积累ꎮ 但在本研究中ꎬ 与
“批量”培养相比ꎬ “两步法”培养未对魏氏真眼点
藻细胞的生长和总脂积累产生较大影响ꎬ 这与
Ｚｈｅｎｇ等[１１]的研究结果有所不同ꎮ 其原因可能是ꎬ
“两步法”培养的目的是通过更换培养基来去除原
培养基中由于持续培养而产生的细菌和毒素等物
质ꎬ 从而使藻细胞处于更为有利的环境中ꎬ 而本研
究发现ꎬ 魏氏真眼点藻在连续培养过程中产生的细
菌和代谢物等不利因子较少ꎬ 更换培养基前后培养
６９２ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷　
基变化不大ꎬ 对藻细胞的生长和油脂积累没有明显
影响ꎬ 因此与“批量”培养相比ꎬ “两步法”培养魏
氏真眼点藻没有得到预期的结果ꎮ “补料法”培养
对魏氏真眼点藻细胞有一定的促进作用ꎬ 但效果并
不明显ꎮ 这可能是因为硝酸钠“批量”培养条件下
该藻细胞已获得较高的生物质浓度和总脂含量ꎬ 再
用“补料法”培养其提高空间不大ꎮ 以上分析结果
说明“两步法”培养和“补料法”培养并不适用于所
有藻株ꎬ 要根据不同微藻选择不同的培养条件ꎮ
在硝酸钠补料培养基础上添加 ＮＨ４ ＨＣＯ３和
ＮａＨＣＯ３对魏氏真眼点藻细胞培养具有显著的促进
作用ꎬ 其中 ＮａＮＯ３＋ ＮＨ４ＨＣＯ３组效果最显著ꎬ 生
物质浓度达到最高(约 １１􀆰５ ｇ / Ｌ)ꎬ 与“批量”培养
相比提高了约 １􀆰０ ｇ / Ｌꎬ 总脂含量提高了近 １０％ꎬ
总脂产率也大大提高ꎮ 这可能是因为培养基中加入
ＮＨ４ＨＣＯ３同时补充了氮源和碳源ꎬ 改变了其 Ｃ / Ｎ
比例ꎬ 使藻细胞向着更有利于油脂积累的趋势发
展ꎮ 同时ꎬ ｐＨ值分析发现ꎬ 以 ＮａＮＯ３培养的整个
周期ꎬ ｐＨ维持在 ７􀆰５左右ꎬ 藻细胞生长状况较好ꎻ
在“添加碳酸氢盐”培养下ꎬ 向培养基中加ＮａＨＣＯ３
后ꎬ 培养基的 ｐＨ迅速上升ꎬ ｐＨ > ９甚至达到 １１ꎬ
藻细胞的生长受到了一定影响ꎻ 而 ＮａＮＯ３ ＋ ＮＨ４
ＨＣＯ３组添加 ＮＨ４ ＨＣＯ３后 ｐＨ 略有下降ꎬ 约为
７􀆰３ꎮ 因此ꎬ 随着游离 ＣＯ２吸收利用ꎬ 培养基中
ｐＨ不断上升ꎬ 这在一定程度上会制约藻细胞生
长ꎬ 而随着 ＮＨ＋４被利用ꎬ ｐＨ 逐渐下降ꎬ 因此添加
ＮＨ４ＨＣＯ３可保持魏氏真眼点藻生长过程中较低的
ｐＨ环境ꎬ 有效促进藻细胞快速生长ꎮ Ｗｈｉｔｅ 等[１８]
研究发现ꎬ 添加 ＮａＨＣＯ３培养后四肩突四鞭藻
(Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｕｅｃｉｃａ Ｋｙｌｉｎ(Ｂｕｔｃｈ))和拟微球藻
(Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｓａｌｉｎａ Ｈｉｂｂｅｒｄ)细胞密度、 色
素和总脂含量都有所提高ꎬ 且对两株藻效果不同ꎮ
Ｇａｒｄｎｅｒ 等[１３ꎬ１４]研究也认为ꎬ 添加 ＮａＨＣＯ３培养
后在高 ｐＨ 和氮限制共同作用下ꎬ 小球藻(Ｃｈｌｏ￣
ｒｅｌｌａ ｓｐｐ.)、 栅藻(Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｓｐｐ.)和三角褐
指藻的总脂含量显著提高ꎮ 此外ꎬ 藻细胞不能直接
利用 ＨＣＯ－３ꎬ 需要将其转化为 ＣＯ２后进入细胞碳固
定过程: (ＨＣＯ－３ ＋ Ｈ
＋) / (ＣＯ２ ＋ Ｈ２ Ｏ) [１９]ꎬ 因此
ＣＯ２水溶液比 ＨＣＯ
－
３更有利于细胞的吸收ꎮ 因此在
硝酸钠补料培养基础上添加 ２５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＮａＨＣＯ３ꎬ
魏氏真眼点藻细胞生物质浓度没有显著变化(Ｐ >
０􀆰０５)ꎬ 但培养液 ｐＨ 有一定程度的提高ꎬ 促进了
细胞总脂含量的积累ꎮ
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(责任编辑: 张 平)
８９２ 植 物 科 学 学 报 第 ３４卷