全 文 ：第 10 卷第 4 期
2012 年 7 月
生 物 加 工 过 程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol． 10 No． 4
Jul． 2012
doi:10． 3969 / j． issn． 1672 － 3678． 2012． 04． 004
收稿日期:2011 － 05 － 03
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973 计划)资助项目(2009CB724702) ;南京工业大学学科基金资助项目(39708010)
作者简介:高浩峰(1986—) ，男，江苏南通人，硕士研究生，研究方向:微藻生物技术;李 环(联系人) ，女，副教授，E-mail:lihuan45678@163． com
半连续及连续培养小球藻减排沼液及 CO2
高浩峰，李 环，韦 萍
(南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 210009)
摘 要:采用半连续或连续模式培养小球藻，考察小球藻减排沼液和 CO2的能力。结果表明:在半连续培养模式
中，当更新率为 30%时，沼液中的 N、P质量浓度可分别稳定在 16 ～ 18 和 0． 4 ～ 0． 6 mg /L，达到污水二级排放标准;
提高更新率到 40%以上，3 d后微藻生物量及其对沼液中 N、P的吸收达到动态平衡，但 N、P去除率未达到污水直
接排放标准;在连续培养模式中，分别选用 20%及 30%的日更新率，7 L 规模12 d后沼液中的总氮(TN)仍高达
55. 64 mg /L。说明大规模培养条件下的光限制是微藻法减排沼液的主要制约因素。
关键词:沼液;普通小球藻;培养模式;氮;磷;去除
中图分类号:Q55 文献标志码:A 文章编号:1672 － 3678(2012)04 － 0016 － 05
Reduction of biogas slurry and CO2 by Chlorella vulgaris
in semi-continuous and continuous cultures
GAO Haofeng，LI Huan，WEI Ping
(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China)
Abstract:Chlorella vulgaris was cultivated by semi-continuous and continuous mode to reduce the emis-
sions of both biogas slurry and CO2 ． In semi-continuous cultivation mode，when the renewal rate was
30%，nitrogen and phosphorus contents in the biogas slurry were stable at 16 to 18 mg /L and 0. 4 to 0. 6
mg /L，respectively，which met the secondary sewage discharge regulations． While the renewal rate in-
creased to higher than 40%，a dynamic equilibrium was obtained between the microalgae biomass and its
absorption of nitrogen and phosphorus in the biogas slurry after three days，but the removal rates of nitro-
gen and phosphorus did not meet the direct sewage discharge standard． Effects of chlorella vulgaris on the
removal of nitrogen and phosphorus in the biogas slurry were investigated in a columnar photobioreactor by
selecting the daily renewal rates at 20% and 30% in continuous mode． The results exhibited that the total
nitrogen amount in the biogas slurry remained at 55． 64 mg /L after 12 days on the 7 L scale． Emission re-
duction of biogas slurry employing the microalgae method was primarily restricted by the light limitation
during the large-scale cultivation．
Key words:biogas slurry;Chlosella． vulgaris;culture mode;nitrogen;phosphorus;removal
随着工业的发展和人口的增加，CO2浓度持续
升高，温室效应日益严重，地球气候变暖的问题已
成为当代科学界研究的重大课题［1］。微藻具有生
长迅速、易于培养等优点，同时微藻能固定 CO2，因
此微藻法生物固碳亦成为国内外研究的重要方向
之一［2 － 4］。
沼气发酵过程可去除原料中大量的可溶性有
机物，但是发酵废液(沼液)中仍残存高浓度的 N、P
等营养物质。因此沼液的直接排放会造成水体污
染，而沼液中的 N、P 及无机盐恰好是普通小球藻
(Chlorella vulgaris)的优质肥料。若利用小球藻来
减排沼液不但能解决沼液排放所导致的环境问题，
还能有效固定空气中 CO2，并以藻细胞生物质能的
形式被重新利用，从而达到对废弃物资源化再利用
的目的，具有显著的环境效益和经济效益［5 － 7］。
王钦琪等［8］研究发现，当混合气体中 CO2体积
分数为 10%时，对 N、P 的去除效果最佳;但批次培
养周期约14 d后，小球藻对沼液的处理量太小，远远
不能满足普通沼气站对沼液排放的需求。半连续
培养和连续培养可有效扩大沼液处理量，且沼液的
更新可及时降低藻细胞的密度进而解除光限制，再
输入 N、P等营养物质，为藻细胞提供良好且稳定的
生长环境，这样可使小球藻长期处于对数生长期，
从而提高小球藻处理沼液和固定 CO2的能力
［9 － 13］。
笔者在前期研究的基础上，扩大沼液减排规模
到 3. 5 及 7 L，考察半连续模式和连续培养模式下的
小球藻减排沼液及 CO2的能力，以期对沼液的生态
法处理及微藻的低成本培养提供一定的实际应用
价值。
1 材料与方法
1． 1 藻种保藏
实验藻种为普通小球藻(Chlorella vulgaris) ，由
暨南大学张成武教授提供。
液体保藏培养基为 BG11 培养基(g /L) :NaNO3
1. 5，MgSO4·7H2O 0. 075，K2HPO4·3H2O 0. 04，Na2CO3
0. 02，CaCl2·2H2 O 0. 036，柠檬酸 0. 006，柠檬酸铁
0. 006，2Na·EDTA 0. 001;微量元素(mg /L) :H3 BO3
0. 061，CuSO4·5H2 O 0. 002 5，MnSO4·H2O 0. 169，
ZnSO4·7H2O 0. 287，钼酸铵 0. 012 5)。在液体培养基
加入 2%的琼脂制得平板保藏培养基。藻种保存方
式为平板 4 ℃冰箱放置保种和液体室温弱光静置保
种(每天摇 2 ～3次)。
1． 2 沼液培养基
采用南京工业大学国家生化中心沼气发酵后
的沼液为小球藻培养的基础培养基。沼液经过沉
降池去除较大的固体颗粒后，再经过板框压滤机过
滤去除较小的颗粒，液体部分储存在废液池中备
用。分别采用碱性 K2S2O8消解紫外分光光度法、钼
酸铵分光光度法、等离子发射光谱法测定沼液中的
总氮(TN)、总磷(TP)和金属离子浓度［14 － 18］，结果
见表 1。由表 1 可知，沼液含有小球藻生长所需的
基本营养成分，即可以利用微藻细胞来富集吸收沼
液中的各种营养成分，从而达到沼液减排的目的。
表 1 沼液中 N、P及金属离子质量浓度
Table 1 Contents of nitrogen，phosphorus and metal ions in biogas slurry
元素 TN TP K + Ca2 + Fe3 + Mg2 + Mn2 + Cu2 + Zn2 + Hg2 + Pb2 +
ρ /
(mg·L －1)
279． 37 31． 41 475． 8 160． 02 1． 044 100． 94 1． 162 0． 056 0． 086 0． 192 0． 128
1． 3 小球藻的培养
以日光灯为光照光源，光照强度为 6 000 lux，光
照光暗时间比为 18∶ 6，培养温度为 25 ～ 28 ℃。将
小球藻藻种接种到纯沼液中，初始接种量 OD680值在
1． 0 左右，通入混合空气培养，每天取样对微藻生物
量及沼液中的 N、P含量进行测量。
半连续培养:小球藻培养一段时间后，当沼液
中 N、P量分别低于 20 和 1 mg /L，达到二级污水排
放标准时，以一定的更新率对光反应器中的沼液进
行更换。
连续培养:小球藻培养一段时间后，当沼液中
N、P量分别低于 20 和 1 mg /L 时，用恒速流动泵以
一定的速率从光反应器中放出沼液，用另一个恒速
流动泵以相同的速率向反应器中加入新的沼液。
更新率是指更新培养基占总培养基的百分比。
在半连续培养模式中，当微藻的培养条件和营养条件
一定时，特定藻株的最适更新率是一定的。更新率的
增加，会使藻细胞的浓度下降，光衰减变小［12］;反之，
更新率降低，光衰减变大，透过培养液的光强会减弱，
同时会造成藻细胞生长所需的营养不足，严重影响生
物量的积累，从而影响藻细胞的产率。因此，更新率
作为半连续培养模式中的重要参数之一，对微藻的生
71第 4 期 高浩峰等:半连续及连续培养小球藻减排沼液及 CO2
长和细胞内生化组分都有重要的影响。
1． 4 生物量的测定
用光密度法来测定生物量。680 nm 处的光吸
收值间接表示。取 1 mL小球藻培养液，将藻液稀释
至 OD680在 0. 2 ～ 0. 8 之间，测定其在 680 nm下的光
吸收值。在半连续培养模式中，在每次沼液更新前
取藻液，测其生物量。
1． 5 CO2去除率的测定方法
向光生物反应器底部通入 CO2和空气的混合气
体，取 2 个气体取样袋分别收集通入光生物反应器
的混合气体和经小球藻培养后的气体，利用 CO2红
外气体分析仪分别测量 2 个取样袋中气体的 CO2浓
度。根据通气流量和通入气体与流出气体的 CO2浓
度变化计算小球藻对 CO2的去除率和去除量。
1． 6 微藻采收量、生长率及产率的计算
采收量 γ = VXρ (1)
式中:V为光生物反应器的装液量(mL) ;X 为更新
率(%) ;ρ为每日微藻培养基更新前的藻质量浓度
(g /L)。
生长率 K 的计算参考 Fabregas 等的计算公式
K =(lnρ1 － lnρ0)/(ln2ρ0) (2)
式中:ρ0为实验开始时的藻细胞质量浓度(g /L) ;ρ1
为实验结束时的藻细胞质量浓度(g /L) ;t 为实验时
间(d)。
产率 P = ρmax / t (3)
式中:ρmax为 t时间内收获微藻的质量浓度(g /L)。
1． 7 TN、TP的测定方法［17 － 18］
半连续培养过程中，在每日更新微藻培养液
前，取样测定 TN、TP的含量。
TN的测定:采用过硫酸钾氧化、紫外分光光度
法，得其线性关系为 m1 = 9. 764 5 × 10
－3(A220 －
2A275)+ 0. 006 2，其中 R
2 = 0. 998 4。ρ(TN)=
m1 /V1，V1 为测定样体积。
TP的测定:采用钼锑抗分光光度法，线性关系
为 m2 = 0. 075A700 + 0. 000 4，其中 R
2 = 0. 999 9。
ρ(TP)=m2 /V1。
2 结果与讨论
2． 1 半连续培养模式培养小球藻对 N、P的去除
采用 1 L的光生物反应器，设置了 5 个梯度的
更新率，光照强度为 6 000 lux，光暗时间比为 18∶ 6，
在室温条件下通入混合空气，观察小球藻的生长状
况及其对沼液中 N、P 及混合空气中 CO2的减排。
半连续培养模式中不同更新率的小球藻的生物量
变化如图 1 所示。
图 1 半连续培养下小球藻的生长曲线
Fig． 1 Growth of Chlorella vulgaris in
semi-continuous culture
沼液培养基中 TN、TP 量的变化见图 2。由图 2
可知:小球藻经 8 d 的快速生长后，随着半连续培养
的进行，40%和 50%组的 TN 和 TP 含量先迅速增加
3 d，第 11天后随着生物量的稳定也逐渐稳定下来，
其 TN、TP 的平均值分别为 53. 10、3. 33 mg /L 和
73. 34、5. 83 mg /L，远远超过半连续起始时的浓度;而
10%、20%和 30%组的 TN、TP含量则相对稳定，分别
在 20和 1 mg /L 以下波动，达到了污水排放的标准。
图 2 半连续培养下小球藻对沼液中
TN、TP的去除效果
Fig． 2 TN and TP removals of Chlorella vulgaris
in semi-continuous culture
由图 1 和图 2 还可知:各组经过 8 d 的快速生
81
生 物 加 工 过 程
第 10 卷
长后，沼液中 TN 和 TP 的平均值分别为 16. 02 和
0. 41 mg /L，均已达到污水排放标准，OD680值均达到
了 14 左右。启动半连续培养，按不同比例更新微藻
培养液，发现经 12 d 的连续更新后，各组的生物量
趋于稳定。在 10%更新率下，细胞生物量有所增
加;20%的更新率下，前几天细胞生物量基本保持不
变，13 d后略有增长;30%、40%和 50%的高更新率
下，细胞生物量明显低于半连续培养起始生物量，
在半连续培养的第 3 天达到稳定，更新率 50%的生
物量最低。由此可知，虽然高更新率能够带来更充
足的微藻培养液，使微藻的生长率增大，但更新的
同时也流失了大量藻细胞，使藻浓度下降。当微藻
的生长率和藻细胞流失无法达到动态平衡时，小球
藻的生物量就会下降。
综合图 1 和图 2 可知:在低更新率下，每次更新
而获得的 N、P 量不能满足小球藻生长对营养的需
求，小球藻采收生物量较低。更新率为 40%和 50%
时，新加入的 N、P 的使本系中的 N、P 相对平衡，生
长稳定，有最高的采收量，但达不到对沼液处理的
要求。综上所述，采用 30%的更新率进行半连续培
养较利于小球藻的生长和对沼液 N、P的去除。
图 3 半连续培养下小球藻对 CO2的去除
Fig． 3 CO2 removal of Chlorella vulgaris
in semi-continuous culture
2． 2 半连续培养模式培养小球藻对 CO2的固定
在通气量为 200 mL /min、CO2 体积分数为
1. 5%、光强 6 000 lux 的培养条件下，半连续培养期
间，小球藻对 CO2的平均去除率和去除量见图 3。
由图 3 可以看出:小球藻对 CO2的去除率和去除量
均随着更新率的提高而增加，与半连续培养的日平
均采收量相吻合。这是因为随着更新率的提高，培
养基营养成分相应增加，微藻生长率因此也得到提
高，同时高更新率也使反应器中的生物密度下降，
透光率增加，同时也促进了小球藻光合作用的效率
和生长，使得微藻的固碳能力得到提升，CO2去除率
和去除量得以提高。
2． 3 连续培养模式培养小球藻对 N、P的去除
连续培养是指以一定的流速连续向培养系统
内添加新鲜培养液，同时以相同的速度放出老培养
液，使反应器内的细胞生长环境处于恒定状态。这
种恒定状态使细胞生长处于一个稳定的环境中，细
胞的生长速率、代谢活性也处于相对恒定的状态，
从而达到稳定培养微藻或产生大量代谢产物的
目的［13，19 － 20］。
图 4 连续培养下小球藻的生长曲线
Fig． 4 Growth of Chlorella vulgaris
in continuous culture
参考半连续培养模式下的日更新率，在 5 000
mL(装液量 3 500 mL)的培养模式中，以恒流泵匀速
更新沼液培养基，初步选定 20%、30% 2 个更新率。
20%更新条件下，恒流泵的更新率为 0. 8 mL /min，
每天微藻培养 16 h，即每日更新沼液约 750 mL。
30% 更 新 条 件 下，恒 流 泵 的 更 新 速 率 为
1. 2 mL /min，每日更新沼液约 1 150 mL。由于这种
较小流量的且流体不太均一(新鲜沼液及微藻利用
后的沼液皆为悬浊液)的恒流操作较难稳定，实际
操作以每日的更新总量为准。结果发现在此条件
下沼液的更新率已略高于微藻的生长速率，单位培
养基微藻的生物量及日采收量和半连续相比略有
下降，但对沼液中 N、P的吸收仍能满足沼液二级排
放的排放。
继续扩大培养规模到 10 L(装液量为 7 L)的柱
状光生物反应器，小球藻生长情况如图 4 所示。由
图 4 可以看出，由于光生物培养装置进一步扩大，其
受光面积与培养体积比值减小，制约了小球藻的生
长，到第 12 天微藻生物量才稳定下来，OD680维持在
4 ～ 6 之间，此时沼液中 TN(55. 64 mg /L) ，已超出城
镇污水排放标准，以微藻生物量形式固定的 CO2也
相应减少。分析原因:这主要是传统的柱状光生物
反应器难以满足微藻以自养为主的光照强度需求，
91第 4 期 高浩峰等:半连续及连续培养小球藻减排沼液及 CO2
高浊度的沼液及不透光的微藻细胞严重遮挡了光
粒子的透入，光限制已成为最大的工艺瓶颈。以后
的工作需要围绕新型高效光生物反应器的设计来
展开，才能使沼液的微藻处理真正走向应用。
3 结 论
1)选取更新率为 10%、20%、30%、40%、50%
5 个水平每日更新沼液，考察半连续培养下小球藻
的生长以及 N、P和 CO2去除情况，结果发现更新率
为 30%时，小球藻对沼液的处理能力最大;更新率
为 50%的条件下，小球藻的日平均采收量和 CO2去
除量最高。
2)扩大培养规模到 7 L，每天微藻培养 16 h，日
更新沼液 700 mL，无论是恒流匀速更新沼液，还是
每日间歇半连续更新，微藻的生物量仅为同条件下
1 L规模的 30% ～40%，12 d后沼液中的 TN仍高达
55. 64 mg /L，说明光限制是放大微藻处理体系的
瓶颈。
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