全 文 ：武汉植物学研究 2003, 21 (2) : 165～ 169
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
红豆杉细胞培养产物提取策略及其对紫杉醇的影响Ξ
罗 杰, 刘 凌, 胡道伟
(华中科技大学生命科学与技术学院, 武汉　430074)
摘　要: 研究了硫酸铈铵及原位提取对红豆杉细胞悬浮培养过程中细胞生长、紫杉醇合成及释放的影响。红豆杉细
胞悬浮培养过程中培养第 12 d 添加 2 m göL 硫酸铈铵能获得最大紫杉醇产量 813 m göL , 其中 214 m göL 释放到细
胞外, 分别为对照组的 4 倍及 12 倍。同时添加 2 m göL 硫酸铈铵、5% 油酸 (vöv)时胞外紫杉醇产量达到 9 m göL , 为
对照组的 45 倍。将硫酸铈铵及原位提取与补料培养相结合, 最高紫杉醇产量可达 2415 m göL , 其中 60% 释放到胞
外。
关键词: 红豆杉; 紫杉醇; 硫酸铈铵; 原位提取
　　中图分类号: Q 813. 1+ 1　　　　　文献标识码: A 　　　　　文章编号: 10002470X (2003) 0220165205
Inf luence of Taxol Production by Product Extraction Stra teg ies
in Cell Cultures of Taxus ch inens is
LUO J ie, L IU L ing, HU D ao2W ei
(S chool of L if e S cience and T echnology , H uaz hong U n iversity of S cience and T echnology , W uhan　430074, Ch ina)
Abstract: T he effects of p roduct release and in situ ex tract ion on cell grow th and taxo l release and
accum u lat ion in cell su spen sion cu ltu res of T ax us ch inensis w ere invest iga ted. A ddit ion of 2 m göL
ammon ium cerou s su lphate on day 12 gave the greatest taxo l p roduct ion at 813 m göL , among
w h ich 214 m göL w as released ou t of the cell, w h ich w as 4 and 12 t im es that of the con tro l cu l2
tu re. Ex tracellu lar taxo l p roduct ion reached 9 m göL w hen 2 m göL ammon ium cerou s su lphate
and 5% o leic acid (vöv) w ere added together, w h ich w as 45 t im es that of the con tro l cu ltu re.
T he h ighest taxo l accum u lat ion of 24. 5 m göL w ith the release ra t io of 60% w as ob ta ined w hen
2 m göL ammon ium cerou s su lphate, 5% o leic acid (vöv) and feeding so lu t ion w ith 20 göL su2
cro se w ere added.
Key words: T ax us; T axo l; Ammon ium cerou s su lphate; in situ ex tract ion
　　紫杉醇 (T axo l) 是一种来源于红豆杉属植物的
二萜类生物碱, 自 1992 年被 FDA 批准用于治疗转
移性卵巢癌以来, 已经被成功地应用于多种恶性肿
瘤及非肿瘤性疾病, 成为目前公认的最有希望的治
疗癌症的药物之一[1 ]。目前用于紫杉醇生物合成的
红豆杉细胞株绝大多数属于非分泌型。因此对于植
物细胞悬浮培养生产紫杉醇而言, 传统的提取方法
是进行细胞破碎后再采用有机溶剂提取。由于紫杉
醇是一种细胞毒素, 有明显的抑制细胞分裂的作用,
其在细胞内的大量积累势必影响细胞本身的生理代
谢。如果能在基本不降低细胞活性及紫杉醇合成能
力的情况下促使紫杉醇向细胞外分泌, 不但能够减
少其对细胞的毒害, 而且有利于提高紫杉醇产量, 同
时也便于实现连续生产。要实现紫杉醇的胞外释放,
必须向培养体系中加入适当的促释放剂。常用的化
学方法有加入DM SO、甘露醇等; 物理方法有调节Ξ 收稿日期: 2002208228, 修回日期: 2002211212。基金项目: 国家“863”高技术发展计划项目 (102212206201)。
　　　作者简介: 罗杰 (1971- ) , 男, 博士, 讲师, 主要从事植物及微生物细胞培养及分子生物学研究。
培养体系的 pH 值等[2 ]。采用有机溶剂对代谢产物
进行原位提取是提高培养过程次生代谢产物产量的
另一条有效途径。一般采用向培养体系中加入非极
性的有机溶剂的方法, 在基本不影响细胞活性的前
提下实现对产物的富集[3 ]。笔者利用一种稀土元素
硫酸铈铵[N H 4Ce (SO 4) 2 ]和油酸进行产物释放及原
位提取对红豆杉细胞悬浮培养过程中紫杉醇的合成
及释放影响进行了研究。
1　材料与方法
1. 1　红豆杉细胞株及其悬浮培养
所用中国红豆杉 (T ax us ch inensis) 细胞株来自
红豆杉幼茎诱导的愈伤组织。具体诱导方法、培养基
及悬浮培养方法见文献 [ 4 ]。补料培养时向每个
250 mL 摇瓶中 (含 100 mL 培养基) 添加 10 mL 补
料培养基。补料培养基的组成为: 62BA 10 m göL ,
2, 42D 4 m göL ,L H 10 göL , 蔗糖 200 göL , 其余成分
的浓度为B 5 培养基的 5 倍。
1. 2　第二相 (有机溶剂相)的预处理
有机相 (油酸)在使用前首先进行培养基成分的
预饱和: 有机相与 5 倍其体积的新鲜培养基搅拌过
夜, 静置分层后除去培养基相 (水相)。上述处理是为
了降低由于有机相吸附培养基中细胞生长所必需的
微量成分或生长因子而导致对细胞生长的损害。
1. 3　细胞鲜重、干重的测定
收获的细胞经过砂芯漏斗减压抽滤后, 滤饼用
蒸馏水洗涤 3 次以除去残余的培养基。再次减压抽
滤后称其鲜重。将上述抽滤的细胞冷冻干燥至恒重
后称其干重。
1. 4　紫杉醇的提取及测定
紫杉醇的提取及测定见文献[ 4 ]。紫杉醇产量为
胞内紫杉醇产量与胞外紫杉醇产量之和。
2　结果与讨论
2. 1　硫酸铈铵浓度对细胞生长、紫杉醇合成及释放
的影响
为了研究不同浓度硫酸铈铵对红豆杉细胞悬浮
培养过程中细胞生长及紫杉醇合成的影响, 在培养
开始时向培养体系中分别加入 0, 015, 1, 2, 5,
10 m göL 硫酸铈铵, 结果见图 1 及表 1。由图 1 可见
细胞生长随硫酸铈铵浓度的变化比较复杂。在培养
开始时加入低浓度 (015, 1 及 2 m göL ) 硫酸铈铵对
细胞生长有一定的促进作用, 这种促进作用在培养
前期更为明显。继续提高硫酸铈铵的浓度则对细胞
生长有一定的抑制。添加不同浓度硫酸铈铵, 培养第
12 及第 24 d 时紫杉醇产量见表 1。硫酸铈铵的添加
不仅有效地促进了紫杉醇的胞外释放, 而且在较低
图 1　不同硫酸铈铵浓度下 (mgöL )中国红豆杉细胞培养
过程中细胞干重的动态变化 (D 4 细胞系)
F ig11　T im e courses of cell grow th in cell suspension
cu ltu res of T ax us ch inensis (cell line D 4) at differen t
ammonium cerous su lphate concen tra t ions (m göL )
表 1　不同浓度硫酸铈铵对紫杉醇合成及分泌的影响 (D 4 细胞系)
T ab le 1　Effects of ammonium cerous su lphate at differen t concen tra t ions on taxo l p roduction and excretion in cell
suspension cu ltu res of T ax us ch inensis (cell line D 4)
硫酸铈铵 (m göL )
Ammonium cerous
su lphate
第 12 d 时紫杉醇产量　T axo l on day 12
总产量 (m göL )
To tal
胞外产量 (m göL )
In m edium
第 24 d 时紫杉醇产量　T axo l on day 24
总产量 (m göL )
To tal
胞外产量
(m göL )
In m edium
释放率 (% )
R elease rat io
0 0. 7 0 1. 9 0. 2 10
0. 5 1. 0 0. 1 2. 5 0. 3 12
1 1. 8 0. 3 3. 4 0. 9 26. 5
2 2. 8 0. 6 4. 6 1. 8 39. 1
5 3. 2 0. 8 1. 8 0. 8 44. 4
10 1. 3 0. 9 0. 8 0. 5 62. 5
661 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　　
浓度 (< 10 m göL ) 时还能显著提高紫杉醇产量。紫
杉醇的释放率随着硫酸铈铵浓度的提高而增加。培
养 24 d 时, 未添加硫酸铈铵的仅有 10% 的紫杉醇释
放到胞外, 而添加 10 m göL 硫酸铈铵时紫杉醇的释
放率则超过 60%。添加 2 m göL 硫酸铈铵得到的紫
杉醇产量最高, 为 416 m göL。N ie 等[5 ]曾报道低浓
度的稀土元素有利于生物合成及有丝分裂, 我们的
结果也显示低浓度的硫酸铈铵对红豆杉细胞悬浮培
养过程中细胞生长及紫杉醇合成均有一定的促进作
用。紫杉醇分泌的增加可能是由于硫酸铈铵对细胞
膜通透性产生影响的结果。由于稀土元素的离子半
径及化学性质与Ca2+ 相似, 所以在生物体中往往能
够作为 Ca2+ 的拮抗剂, 对膜上的 Ca2+ 通道产生影
响, 细胞膜的微结构发生变化, 改变细胞膜的通透
性。而较高浓度的稀土元素则会造成膜损伤。
2. 2　硫酸铈铵添加时间对细胞生长、紫杉醇合成及
释放的影响
于培养过程中第 0, 8, 12, 16, 20 d 加入 2 m göL
硫酸铈铵, 第 24 d 收获细胞, 胞外紫杉醇及总紫杉
醇产量见图 2。在培养过程中第 12 及 16 d (即对数
生长中、后期)加入硫酸铈铵对紫杉醇合成的促进作
用最大, 此时总紫杉醇产量分别为 8. 3 m göL 及
7. 1 m göL。在细胞培养开始时 (第 0 d)、对数生长前
期 (第 8 d) 及稳定期 (第 20 d) 加入硫酸铈铵对紫杉
醇的合成也有一定的促进作用, 但与对数中后期加
入硫酸铈铵相比效果较差。硫酸铈铵的添加时间对
紫杉醇的胞外释放也有较大影响。紫杉醇的释放率
图 2　硫酸铈铵添加时间对中国红豆杉细胞培养过程
紫杉醇合成及分泌的影响 (D 4 细胞系)
F ig12　Effects of ammonium cerous su lphate addit ion at
differen t cu ltu re stages on taxo l p roduction and
excretion in cell suspension cu ltu re of T ax us ch inensis
(cell line D 4)
　
随硫酸铈铵作用时间的延长而增加。第 0 d 加入硫
酸铈铵时紫杉醇胞外释放率为 39% , 第 20 d 加入硫
酸铈铵时释放率为 22%。
红豆杉细胞培养过程中第 12 d 加入 2 m göL 硫
酸铈铵, 细胞生长、紫杉醇合成及胞外释放的动态过
程 (见图 3: A )显示, 第 12 d 添加 2 m göL 硫酸铈铵
对细胞生长有一定的促进作用, 与未加硫酸铈铵的
对照组相比细胞干重略有增加, 两者最大细胞干重
分别为 1914 göL 及 1811 göL。另外, 添加硫酸铈铵
组的细胞干重在培养过程的最后 12 d 中下降较快,
而对照组中细胞干重基本维持不变, 这可能是由于
培养后期营养物质缺乏造成硫酸铈铵对细胞的毒害
作用增强所致, 因此培养中后期进行补料培养可能
有利于细胞干重的进一步增加及紫杉醇产量的提
高。图 3: B 为培养第12 d添加2 m göL 硫酸铈铵时紫
(A )
(B )
图 3　第 12 d 添加硫酸铈铵时细胞干重 (A)、
紫杉醇合成及分泌 (B)的动态变化
F ig13　T im e courses of cell grow th (A ) , taxo l
p roduction and excretion (B ) in cell suspension
cu ltu re of T ax us ch inensis (cell line D 4) w ith
ammonium cerous su lphate added on day 12
761　第 2 期　　　　　　　　　　　　罗 杰等: 红豆杉细胞培养产物提取策略及其对紫杉醇的影响
杉醇合成及胞外释放的动态过程。培养第12 d添加
2 m göL 硫酸铈铵时总紫杉醇及胞外紫杉醇产量均在
第24 d时达到最高, 分别为813 m göL 及2. 4 m göL。
此后总紫杉醇产量及胞外紫杉醇产量均出现下降,
说明紫杉醇可能并非最终代谢产物。胞外紫杉醇产
量降低的部分原因可能是由于胞外酶或细胞自溶后
释放的胞内酶水解胞外紫杉醇所致。Ketchum [6 ]曾
报道过紫杉醇的水解, 并认为紫杉醇能被有选择性
地水解为baccat in III, 因此如果能够避免或减少紫
杉醇的水解, 则有可能进一步提高紫杉醇产量。硫酸
铈铵的添加使最高总紫杉醇产量由未添加时的
1. 9 m göL 提高到8. 3 m göL , 提高了近3倍。
2. 3　硫酸铈铵添加与原位提取及补料培养联合应
用的影响
采用两相培养对胞外紫杉醇进行原位提取, 一
方面可以将释放到细胞外的紫杉醇富集到第二相
中, 从而减少紫杉醇的胞外降解。同时, 将胞外释放
与原位提取相结合也可以改变紫杉醇的合成以及释
放的动态平衡, 解除由于胞内紫杉醇浓度过高造成
的反馈抑制, 从而提高紫杉醇产量。植物细胞两相培
养过程中的一个重要因素是加入的第二相 (有机相)
对细胞的毒性问题, 另外紫杉醇应在有机相中有较
高的分配系数。有机相 (有机溶剂)对细胞ö酶的活性
影响的研究在近 20 年中取得了很大的进展。对于有
机溶剂生物毒性 (或生物相容性) 的量度参数, 目前
广泛采用的是溶剂的 logP 值 (溶剂在辛烷及水中的
分配系数之比)。当溶剂的 logP 值大于 4 时, 溶剂对
细胞的毒害作用较低[7 ]。油酸的 logP 值及对紫杉醇
的分配系数分别为717及154, 较适合作为第二相使
用。考虑到紫杉醇主要在对数后期及稳定期大量合
成, 所以确定将油酸在对数后期 (培养第16 d)加入。
到目前为止, 不少研究者都对利用两相培养进
行原位提取来提高次生代谢产物进行了研究[8 ]。图
4 为加入不同体积的油酸对生物量、紫杉醇合成及
释放的影响。油酸体积分率的增加使生物量略有下
降。Bu itelaar 等[9 ]曾对由于在水ö油界面失活而导致
的有机溶剂细胞毒性问题进行了研究, 结果表明这
种失活所造成的影响较小。另一方面有机溶剂可能
会溶解部分细胞生长所必需的培养基成分, 从而对
细胞生长产生影响。由于我们已经在使用有机相之
前对其进行了培养基成分的预饱和, 所以这种影响
作用也被减小。另外, 油酸体积分率对胞内紫杉醇产
量的影响也较小。加入 5% (vöv)的油酸时总紫杉醇
及胞外紫杉醇含量均最高 , 分别为5 14m g öL 及
图 4　油酸的体积百分比对细胞生长、
紫杉醇合成及分泌的影响 (D 4 细胞系)
F ig14　Effects of o leic acid vo lum e percen tage on
cell grow th, taxo l p roduction and excretion in cell
suspension cu ltu re of T ax us ch inensis (cell line D 4)
　
　
215 m göL。
图 5 为胞外释放 (添加硫酸铈铵)、原位提取 (添
加油酸) 及补料培养 (添加含蔗糖的补料培养液) 对
紫杉醇合成及释放的影响。添加硫酸铈铵使细胞内、
外紫杉醇产量都有较大的提高, 说明硫酸铈铵除了
1. 对照; 2. 第 12 d 加入 2 m göL 硫酸铈铵; 3. 第 16 d 加
入 5% 油酸; 4. 第 16 d 加入补料培养液 (含 20 göL 蔗
糖) ; 5. 同时添加硫酸铈铵及油酸; 6. 同时补料及添加油
酸; 7. 同时补料及添加硫酸铈铵; 8. 同时补料、添加硫酸
铈铵及油酸
1. con tro l; 2. 2 m göL ammonium cerous su lphate added
on day 12; 3. 5 % o leic acid added on day 16; 4. feeding
so lu tion w ith 20 göL sucro se added on day 16; 5. ammo2
nium cerous su lphate and o leic acid added; 6. o leic acid
and sucro se added; 7. ammonium cerous su lphate and su2
cro se added; 8. ammonium cerous su lphate, sucro se and
o leic acid added
图 5　不同红豆杉细胞培养策略对紫杉醇的
合成与分泌的影响 (D 4 细胞系)
F ig15　 Influence of differen t cu ltu re stra tegies
on taxo l p roduction and excretion in cell suspension
cu ltu res of T ax us ch inensis (cell line D 4)
861 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　　第 21 卷　　
能改变细胞通透性、增加紫杉醇胞外释放外, 对紫杉
醇的合成也有一定的诱导作用。油酸的添加对胞内
紫杉醇产量的提高作用较小 (提高 50% ) , 但却使胞
外紫杉醇产量提高了近 10 倍。添加有机相提高紫杉
醇产量的原因可以归结为: 有机相对有毒代谢产物
的原位提取减少了产物的分解; 改变了胞内ö外产物
分配平衡[10 ]。补料培养使胞内紫杉醇产量提高近 3
倍, 达到 418 m göL , 但对胞外紫杉醇产量几乎没有
影响。硫酸铈铵与油酸联合使用时胞外紫杉醇产量
达到 9 m göL , 为对照组的 45 倍; 硫酸铈铵与补料培
养联合使用时胞内紫杉醇产量达到 1216 m göL , 为
对照组的 714 倍。将产物释放、原位提取及补料培养
三者联合使用时胞内、胞外紫杉醇产量分别达到
713 m göL 及 1712 m göL , 总紫杉醇产量达到
2415 m göL , 且 60% 的紫杉醇释放到胞外。实验结果
表明, 通过这些方法, 可以使细胞部分转化为分泌型
细胞。这样既有利于解除胞内产物抑制, 促进紫杉醇
的大量合成, 又有利于工业化生产紫杉醇的下游提
取。
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