全 文 ：武汉植物学研究 2001, 19 (5) : 440～ 444
J ourna l of W uhan B otan ica l Resea rch
沙田柚不同外植体离体培养与植株再生的研究Ξ
董高峰　黄　涛　李耿光　张兰英
(中国科学院华南植物研究所, 广州　510650)
Stud ies on the T issue Culture of D ifferen t Explan ts in vitro
and Plan t Regenera tion from C itrus g rand is cv. Shatian Y u
DON G Gao2Feng, HUAN G T ao, L I Geng2Guang, ZHAN G L an2Y ing
(S ou th Ch ina Institu te of B otany , T he Ch inese A cad emy of S ciences, Guangzhou　510650, Ch ina)
关键词: 沙田柚; 离体培养; 不定芽诱导率
Key words: C itrus g rand is O sbeck cv. Shatian Yu; Cultu re in v itro; Induction percen tage of
adven tit ious shoo ts
　　中图分类号: Q 943. 1　文献标识码: A 　文章编号: 10002470X (2001) 0520440205
利用组织培养进行柑桔良种的快速繁殖可以克服常规方法费时的缺点, 为进一步进
行无病原体苗木繁育、诱变育种及遗传转化创造有利条件。目前我国开展此项工作较为广
泛, 已先后在红江橙[1 ]、柠檬[2 ]、金柑[3 ]、甜橙[4 ]及蕉柑[5 ]等柑桔类中建立了组织培养的再
生体系, 但在柚类中相关的研究较少。笔者以沙田柚为材料, 在离体培养条件下, 成功诱导
上下胚轴、根段及子叶的不定芽形成和植株再生。
1　材料与方法
111　植物材料
沙田柚种子 (C itrus g rand is O sbeck cv. Shat ian Yu) 经表面消毒后黑暗培养无菌苗,
当苗长至20 d 左右时, 将上胚轴和根段切成约1 cm 长, 下胚轴切成约015 cm 长的小段, 子叶
切成 015 cm × 015 cm 的小块, 每处理一般接种 40 块。一般培养 30 d 后进行统计。
112　离体培养
采用M S 为基本培养基, 根据实验要求附加不同浓度的BA、NAA、IBA 及活性炭, 每
天光照 12 h, 培养温度 (26 ± 2)℃。Ξ 收稿日期: 2001201213, 修回日期: 2001207202。基金项目: 国家自然科学基金 (39870539)、广东省自然科学基金 (980478)及广东省科技创新百项工程 (99)资助
项目。
作者简介: 董高峰 (1971- ) , 男, 在读博士, 从事植物细胞工程研究。
2　结果与分析
2. 1　不同外植体对不定芽发生的影响
采用沙田柚的上胚轴、下胚轴、根段及子叶等不同外植体接种, 在附加BA 015 m göL
的M S 培养基上, 实验结果 (表 1)表明不同外植体不定芽的发生能力有明显差异: 上胚轴
表 1　不同外植体对不定芽发生的影响
T able 1　Effect of differen t exp lan ts on the fo rm ation
of adven tit ious shoo ts
外植体
Exp lan ts
外植体数
N o. of
exp lan ts
形成芽
Fo rm ation shoo ts
出芽外
植体数
N o. of
exp lan ts
w ith shoo ts
不定芽
诱导率
% of
shoo ts
芽生长
情况
Shoo t’s
situation
出芽所
需天数
D ays of
shoo t
上胚轴 Ep ico tyls 40 38 95 丛生 22
下胚轴H ypoco tyls 40 34 85 丛生 30
子叶Co tyledons 40 5 12. 5 单生 45
根段Roo t segm ents 40 3 7. 8 丛生 40
上不定芽诱导率最高 (可达
95% ) , 平均出芽所需天数为
22 d; 下胚轴上不定芽诱导
率稍低, 出芽所需天数为
30 d; 子叶和根段上不定芽
诱导芽率明显较弱, 出芽所
需天数也明显增加, 而且不
定芽的长势较弱。因此, 沙田
柚组织培养诱导不定芽, 不
仅与外源激素有关, 而且受
外植体材料的影响也较大。
2. 2　不同基本培养基对上胚轴不定芽发生的影响
我们采用M S、M T、B 5 及W h ite 等 4 种不同的基本培养基, 附加BA 015 m göL。实验
结果 (表 2)表明: 这 4 种培养基均能诱导沙田柚上胚轴形成丛生绿芽, 但其不定芽的发育
表 2　不同基本培养基对上胚轴不定芽发生的影响
T able 2　Effect of differen t basic m edia on the fo rm ation of
adven tit ious shoo ts from ep ico tyls
基本培养基
Basic
m edia
外植体数
N o. of
exp lan ts
形成芽
Fo rm ation shoo ts
出芽外
植体数
N o. of
exp lan ts
w ith shoo ts
平均单个外
植体芽数
A verage
shoo ts per
exp lan t
形成苗
Fo rm ation seedlings
成苗外
植体数
N o. of
seedlings
平均单个外
植体成苗数
A verage
seedlings
per exp lan t
M S 40 38 2. 8 24 2. 5
M T 40 36 2. 5 24 2. 0
B 5 40 30 1. 8 14 1. 5
W h ite 40 32 2. 5 16 1. 5
能力有较大的差异。
M T 和M S 培养基作
为前人进行柑桔类组
织培养的主要基本培
养基, 不仅较易形成
丛生绿芽, 而且生长
成苗的能力也较强,
其中又以M S 培养基
为最佳。B 5 和W h ite
培养基虽然也能诱导
上胚轴形成丛生芽,
但单个外植体平均不定芽数较少, 而且其生长成苗的能力也较弱。因此, 我们认为沙田柚
的离体培养仍以M S 作为基本培养基较为适宜。
2. 3　外源激素对上胚轴不定芽发生的影响
2. 3. 1　BA 浓度对不定芽发生的影响
由表 3 可知,BA 为 015 m göL 时 (以M S 为基本培养基) , 上胚轴的不定芽诱导率可
高达 95% , 此后随着BA 浓度的升高, 不定芽诱导率随之下降。若BA 浓度超过 015 m göL
就会产生抑制作用,BA 浓度越高, 抑制作用越明显。我们还观察到,BA 浓度为 210 m göL
时, 部分外植体变黄, 逐渐死亡, 当BA 浓度为 510 m göL 时, 大部分外植体死亡, 说明高
144　第 5 期　　　　　　　　　董高峰等: 沙田柚不同外植体离体培养与植株再生的研究
表 3　BA 浓度对不定芽发生的影响
T able 3　Effect of BA concen tra t ion on the fo rm ation
of adven tit ious shoo ts
BA 浓度 (m göL )
BA concen tration
(m göL ) 上胚轴 Ep ico tyls外植体数N o. ofexp lan ts 不定芽诱导率% ofshoo ts 平均单个外植体诱导不定芽数A verage no.of adven tit iousshoo ts per
exp lan t
0 40 65 1. 0
0. 2 40 80 1. 5
0. 5 40 95 2. 8
1. 0 40 80 3. 0
2. 0 40 50 3. 2
5. 0 40 10 3. 5
浓度的BA 会对外植体产生毒害作
用。在未加任何激素的情况下, 亦能诱
导上胚轴产生较高的出芽率, 说明沙
田柚上胚轴可能含有较多的内源激
素, 能够诱导其不定芽发生, 外加低浓
度的BA 则会对不定芽发生产生明显
的促进作用。平均单个外植体诱导不
定芽数也与BA 浓度有关,BA 浓度越
高, 单个外植体诱导产生不定芽的数
量越多。在不加BA 时, 主要形成单
芽, 而附加BA 则会增加单个外植体
成芽的数量。
2. 3. 2　不同激素组合对不定芽发生的影响
我们以上胚轴为外植体, 采用 6 种激素组合, 即 M S + BA 015 m göL、M S + BA
110 m göL、M S+ BA 015 m göL + IBA 012 m göL、M S+ BA 015 m göL + NAA 012 m göL、
表 4　不同激素组合对不定芽发生的影响
T able 4　Effect of differen t ho rmone com bination on
the fo rm ation of adven tit ious shoo ts
激素组合
A uxin concen tration
外植体数
N o. of
exp lan ts
不定芽诱导率
% of shoo ts
平均单个外
植体诱导芽数
A verage no.
of shoo ts
per exp lan t
M S+ BA 0. 5 m göL 40 95 2. 8
M S+ BA 1. 0 m göL 40 80 3. 0
M S+ BA 0. 5 m göL + IBA 0. 2 m göL 40 95 2. 5
M S+ BA 0. 5 m göL + NAA 0. 2 m göL 40 90 2. 4
M S+ BA 1. 0 m göL + IBA 0. 5 m göL 40 85 1. 8
M S+ BA 1. 0 m göL + NAA 0. 5 m göL 40 65 1. 5M S + BA 110 m göL +IBA 015 m göL 和M S+BA 110 m göL + NAA015 m göL 进行实验, 其实验结果如表 4。M S+ BA 0. 5 m göL附加 IBA 012 m göL 或NAA 012 m göL 对上胚轴上不定芽诱导率的影响均不大, 但单个外
植体诱导芽的数量降
低;M S+ BA 110 m g 附加 IBA 015 m göL 会略微提高上胚轴上不定芽诱导率, 而附加
NAA 015 m göL 则会明显抑制上胚轴上不定芽发生; 不论是 IBA 或NAA , 随着生长素浓
度的不断升高, 都会明显增加单芽的形成。我们同时还发现附加 012 m göL 的NAA 或
IBA , 可以提高不定芽的成苗质量和长势。
2. 3. 3　活性炭对形成芽的影响
我们以上胚轴为外植体, 采用两种培养基即在M S + BA 015 m göL 和M S + BA
110 m göL 上分别附加 013 g 活性炭, 结果表明: 与单独的M S+ BA 015 m göL、M S+ BA
110 m göL 相比, 附加 013 g 活性炭对上胚轴上不定芽诱导率影响不大 (不定芽诱导率分
别为 82% 和 85% ) , 但成苗能力明显增强, 新芽茎叶生长十分迅速, 植株明显比对照健壮,
而且绝大多数外植体只能诱导单芽的形成。另外, 我们还发现附加活性炭能有效地促进根
的形成, 在上述两种培养基上生根率均可达 50% 以上, 均为单条根。
244 武 汉 植 物 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　第 19 卷　　
2. 4　根的诱导和移栽
沙田柚组织培养诱导形成的芽, 在原培养基上可长出茎叶, 但一般不能形成根, 必须
将已形成茎叶的无根苗切下转入含有生长素的生根培养基中, 转瓶后一般 1 个月左右开
始形成根, 获得完整植株。实验表明: 以M S 基本培养基附加 110 m göL NAA 和 013 g 活
性炭的效果较好, 不仅生根率高 (可达 95% 以上) , 而且能保证新梢上部茎叶生长旺盛; 在
不含NAA 但附加 013 g 活性炭的M S 培养基上, 也能诱导生根, 但生根率较低; 而在只含
有高浓度NAA 的培养基上, 根的生长过于旺盛, 会产生簇状根, 从而可抑制上部新梢茎
叶的生长。
将带 3～ 4 片伸展叶片的试管苗从培养室中移出, 揭开三角瓶封口膜, 取出试管苗, 用
蒸馏水洗净根部培养基, 在室内自然光下于蒸馏水中进一步培养 1 周左右, 再置入
5 m göL IBA 溶液中浸泡 24 h, 最后单株移入营养钵。营养土采用 50% 塘泥÷50% 黄泥混
合, 钵苗置于外罩遮阴网的网室中正常生长, 其移栽成活率高达 90% 以上。
3　讨论
BA 在诱导柑桔类外植体的不定芽发生方面可发挥独特的作用, 但不同的柑桔品种,
其诱导出芽的最适BA 浓度也有着明显的差异, 如在红江橙[1 ]、蕉柑[5 ]和四季桔[6 ]等品种
中, 较适宜的BA 浓度分别为 1 m göL、1 m göL 和 2 m göL。在本实验中, 015 m göL BA 对
沙田柚直接出芽效果最为明显, 浓度过高反而会对出芽产生抑制作用。
对于活性炭的作用, 目前一般认为它有利于诱导生根, 并能促进根的伸长和生长[7 ] ,
我们的实验也证明了这一点。但对于它能否促进新梢的形成和伸长方面还存在着较大的
争论, 如M udge [8 ]和 Capuana 等[9 ]认为活性炭能促进新梢的形成和伸长, 而邢世岩则认
为活性炭对新梢增殖和生长具有明显的抑制作用[10 ]。我们的实验表明低浓度的活性炭对
不定芽的诱导率影响不大, 但能明显促进不定芽成苗和新梢伸长, 这一点与Bach [11 ]的结
论是一致的。
近年来, 随着生物技术的迅速发展, 通过遗传转化培育柑桔优良品种已成为新的发展
趋势。截止到目前, 国内外已有多人利用根农杆菌法成功地将外源基因转入柑桔植
株[12 14 ]。由于进行遗传转化的前提是必须建立高效的组织培养再生体系, 因此我们以沙
田柚不同外植体为材料, 系统研究了其再生芽能力、器官形成及植株再生, 并较大程度地
提高了不定芽的发生率, 从而可为沙田柚遗传转化工作的开展及转化效率的提高创造良
好的条件。
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