全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(5)：439~444
Journal ol Wuhan Botanical Research
极高CO2胁迫对被甲栅藻 (Scenedesmus armatus)
生理活性和细胞结构影响
徐敏 一，陈珊 ，刘国祥 ，胡征宇
(1．中国科学院水生生物研究所，武汉 430072}2．中国科学院研究生院，北京 100039)
摘 要：以被甲栅藻(Scenedesmus armatus)为材料研究极高浓度COz对其生理活性和细胞结构的影响。研究表明，
被甲栅藻能在 6O％的 CO。浓度下快速生长，在 5 、2O 、40 、60 、8O 、i00 COz浓度下的平均增长率分别是
1．228、0．925、0．741、0．305、0．042、0．001 g·L ·d～DW。通入极高浓度 C02(20％、4O％)后，被甲栅藻细胞的光
系统 II(PSII)最大光化学效率(F ／F )在 24 h内明显下降，对 PSII抑制作用较明显 ；其后 ，随培养时间的增长而逐
渐恢复正常。显微结构和亚显微结构显示极高 CO。浓度下培养了 6 d的藻细胞体积稍膨大、颗粒化，色素体结构相
对不完整，类囊体膜结构略显松散，蛋白核消失，细胞内的液泡数目增多。
关键词：极高 CO2胁迫；被甲栅藻；PS I光化学效率(F ／F )；亚显微结构
中囹分类号 ：Q945；Q949．21 7 文献标识码 ：A 文章编号：i000—47OX(2OO4)O5—0439—06
Pilot Study of Physi0logical and
Scenedesmus armatus Under
M orphological Acclimation of
Extreme-High-COz-Stress
XU Min ，CHEN Shan ，LIU Guo—Xiang ，HU Zheng—Yu ‘
(1．Institute of Hydrobiology，The Chinese Academy of Sciences，Wuhan 430072，China；
2．Graduate School of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039，China)
Abstract：Scenedesmus armatus was tested for its high—CO2．tolerant mechanism．It can thrive at
60 CO2 under contro1．The average growth rates were 1．228，0．925，0．741，0．305，0．042 and
0．001 g·L-1·d-1 DW at 5 ，20 ，40 ，60 ，80 ，100 CO2 conditions respectively，of
which the 20 0A CO2 is most applicable while 5 is most optimum．The maximum quantum effi—
ciency of photosystemII(PSII)primary photochemistry，given by F ／F 一 (F 一F0)／F ，de—
creased distinctly in the first 24hrs indicating photoinh ition in PSI，then gradualy recovered to
the normal levels．The microstructure and ultrastructure of ceils growing under air and 20 0A CO2
indicate some morphological adaptation changes：the chloroplast were not integrated as usual，in
which the pyenoids are missing or seldom seen after cultured with high CO2，besides the sizes of
the cells and the number of intracellular vacuoles were larger for the cells grown in 20 CO2 for
6 days than for those in air for the same period．These physiological and structural changes may
help US to find the way in which algae adapting to the extreme-high—CO2-stress．
Key words：Extreme—high—CO2一stress；Scenedesmus armatus；F ／F ；Ultrastructure
海滩绿球藻(Chlorococcum litorale)能在高达
60 CO。条件下生长 ¨，这是藻类耐受极高 CO。浓
度的开创性报道。在后来的研究中研究人员从生理、
生化和分子水平探讨了其适应极高 CO。浓度的机
收稿El期：2003—12—15，修回日期：2004—02—11。
基金项目：中国科学院水生生物研究所创新领域前沿项目资助}武汉市晨光计划资助(20035002016-31)。
作者简介：徐敏(1979一)，女，硕士研究生，主要从事藻类生理生化研究。
通讯作者。
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武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
制[2-1o]，及其应用于藻类固碳的可能性[1h ]，并给藻
类生物反应器和固碳应用的结合提供了新的思
路[¨]。尽管目前应用藻类进行生物固碳的应用成本
过高，暂时不具备立竿见影的实际应用价值，但是从
长远的环境利益出发，利用藻类固碳以减少大气中
增加的CO。仍有相当的理论价值。此外，这种能适
应极端环境的藻类还具有生命耐受机制的探讨
意义。
一 般认为，极高CO。浓度对细胞是有麻醉作用
的[1引，这种麻醉效应表现为抑制细胞生长和光合作
用水平，并出现生长的“滞后期(1ag phase)”If]。所以
能在极高 CO。浓度下生长的藻类并不多，主要是绿
藻和蓝藻，目前已报道过的种类除了海滩绿球藻，还
包 括 小 球 藻 属 (Chlorela sp．)[1h 1 、栅 藻 属
(Scenedesmus sp．)L1 、喜温红 藻(Cyanidium cal—
darium)[ 引，及大型藻江漓(Gracilari口tik ih口e)[ 2]
等十多种。选择栅藻作为研究对象是因为它对培养
条件要求不高，极易培养。笔者选用能适应极高COz
浓度的被甲栅藻(Scenedesmus armatus)进行实验，
并研究其在不同CO。浓度下的生长状况和生理变
化，为进一步的试验和应用奠定基础。
1 材料与方法
被甲栅藻(Scenedesmus armatus)藻种由美国亚
利桑那州立大学胡强博士提供，用 BG 培养于
150 mL的大试管中，底部通气，用气体流量计调配
空气和纯 CO。的比例达到不同浓度 CO。，观察栅藻
的生长和生理变化情况。
1．1 藻类的生长测定
取一定体积 的藻液，过滤 到滤纸上测定干
重[ ]，做生长曲线分析。
1．2 培养基 CO：浓度测定
以中和法 测定反应液 中游离 的 CO。，采 用
NaOH标准溶液滴定，反应生成NaHCO。，滴定终点
时溶液的pH=8．3，以酚酞作为指示剂，终点溶液呈
红色[1 。当溶液的pH值高于8．3时，用标准 H。SO
溶液滴定至终点 pH值 8．3。
1．3 培养基 pit值的测量
采用 pH计(ORLON 42oA)直接测定。
1．4最大光化学效率 F，／F 测定
样品经 15 rain的暗适应后，用植物效率分析仪
(HANSA TECH)测定 F ／F ：(F 一F。)／F ，分析
藻细胞在不同生长条件下 PSⅡ的最大光化学效率。
激发光为 2 850 E·ITI ·S_。，时间 6 S。
1．5 电镜观察
分别取在空气和高 CO。(20 )条件下的藻样进
行观察。步骤：①用 50 mmol／L pH7．0磷酸钠缓冲
液清洗 2次；②用 2％(v／v)戊二醛室温固定 9 h；③
用 2 锇酸 4℃固定过夜；④用梯度酒精脱水；⑤用
丙酮和Spurt’S树脂混合溶剂渗透{⑥用配制混合
Spurt’S树脂包埋后在 68"-70℃聚合 12"-16 h；⑦
用玻璃刀切片，铜网捞片；⑧用3 醋酸铀脂和醋酸
铅双染色L2 。
2 实验结果
2．1 不同 CO：浓度对栅藻生长的影响
实验结果显示，被 甲栅藻最高可以在 6O％的
CO。浓度下生长，当CO。浓度超过 8O 时，细胞增
长极为缓慢，远低于在空气条件下藻的生长。藻的生
长速率在 CO。浓度为 5 时最快，随着 CO 浓度的
升高其生长速率逐渐下降，在 25℃时，各 COz浓度
下的平均固碳率分别是：1．228、0．925、0．741、
0．305、0．042和0．001 g·L ·d DW(图 1)。因
此我们选用 2O 和 4O％ CO。浓度作为其它实验的
CO2浓度。
1 2 3 4 5 6
培 养lJ州 fd1
Caltur~time
图 1 不同CO：浓度对被甲栅藻生长的影响
Fig．1 The effect of C02 concentration on the growth
of Scenedesmus armatus
2．2 极高 CO：浓度对培养基 pit值的影响
一 般来说，极高 CO。浓度对藻细胞的影响作用
是通过改变培养液的pH值来实现的。表 1显示了
在通入不同 CO。浓度时，不含藻培养基 pH值和
CO。浓度的变化情况。随着通入 CO。浓度的升高，
溶液中CO。浓度也越高，溶液的 pH值越低(表 1)。
接种藻后通空气、20 9／5和40 CO 气体时，培养基
一 ⋯ l一一一⋯ 一一 一一 一
一
7 6 5 4 3 2 ● O
lll 0≥ J^0
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第 5期 徐 敏等 ：极高 CO 胁迫对被甲栅藻(& d 5 “5 n— nf“5)生理活性和细胞结构影响 441
表 1 通人不同CO：浓度下(不含藻)BG I培养基的pH值和溶液中C02浓度
Table 1 pH and CO2 of the BGIl aerated with different concentrations of C02(without algae)
的pH值变化情况见图 2：空气条件下，随着藻的生
长代谢和培养基的碱基化，其 pH值随之升高；而通
入高 CO。的培养体系 pH值一直处于较低状态，且
两者没有明显的差异
0 l 2 3 4 5 6
培养时 『HJ fd1
Culture timc
图 2 不同碳源浓度下培养体系(含藻)的 pH值变化
Fig．2 Changes of pH under different C02
concentrations(with algae)
2．3 极高 CO：浓度对被甲栅藻 PSII的 F，／F 值的
影响
在培养基中通入 2O 和 4O co 后，F ／F 在
几小时内便下降至较低水平 ，其中20 co。条件
0．8
0．7
0．6
E 0．5
＼
>
0．4
0．3
0．2
— 6 0 6 12 l 8 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78
时问 (『11
Time
图 3 通人CO：时间的长短对F，／F．值的影响
Fig．3 Changes of F ／F as the time of CO2 aerated
下，F ／F 值在 2 h内从 0．737下降至 0．495，下降
了32．9 ；40 c02条件下，4 h内从 0．737下降至
0．237，下降了 67．8 。最大降幅分别为 36．1 和
67．8 ，并且皆在前 24 h内保持在较低水平。随着
培养时间的延长，F ／F 值可逐渐恢复至正常水平。
而在通空气的平行试验中，被 甲栅藻的 F ／F 值基
本稳定在同一水平(图 3)。
2．4 极高 CO：浓度对被甲栅藻细胞形态的影响
在 2O CO。条件下，被甲栅藻细胞的形态结构
较正常细胞发生了一系列变化，表现在细胞略膨大，
色素体不完整，蛋白核结构不明显，少数集结体解体
成单个细胞 而当被甲栅藻细胞从极高CO 浓度条
件转到正常条件后，蛋白核又可以出现。从亚显微结
构中可以看出其类囊体膜略显松散，并富含基粒状
颗粒，蛋白核消失或极少出现，液泡数目明显增多且
内涵物丰富(见图 4)
3 讨论
我们的试验结果和 Hanagata报道的相一致，被
甲栅藻可以耐受极高浓度的 CO。，但是却没有出现他
提到的存在明显滞后期现象[1 ，而是在通极高 CO。
培养时很快达到对数生长期，同时具有较高的固碳速
率，说明这种栅藻能很好的适应极高 CO。条件。
通入极高浓度 CO。气体后培养基中 CO。浓度
增加，细胞内外的 CO。分压也相应升高，对细胞的
形态结构和光合系统必然产生影响，对藻细胞而言
则是形态上和生理、生化上的适应。其中类囊体膜趋
于松散 ，蛋白核消失或很少出现 ，当重置于正常条件
(低碳)下时蛋白核可重现 这种现象与蛋白核的功
能直接相关 ：一般蛋白核储存有 1，5一二磷酸核酮糖
羧 化酶(RuBP Case)和部分的碳酸酐酶 (CA)，CA
含量在低碳诱导下会增加，以增加细胞对 CO。的亲
和力和送达 RuBP Case的底物量，维持细胞的正常
生理活性L2。。，因此极高碳条件下蛋白核的功能可能
会受到抑制而减少合成，从而蛋白核不可见和极少
观察到 液泡的数目和体积明显增多和增大，可能与
2 ● O 9 8 7 6 5 4 3
I_I(I
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442 武 扭 植 物 学 研 究 第 22卷
N．细胞核{O．质体小球；PY．蛋白甚；S．淀l帕粒：V．液泡}CH，色幕体F CW．细胞壁 1．正常被甲栅蔫细咆}2．胁迫条件下
细胞液泡数量和体积增大：3．正常细胞中的蛋白横章口完整的排列紧密的色素体结构并布满整个细胞；4 旦条件下类囊
体变得松散 5．类囊体结构及附着的质体小球．致密有序 6．略追杀件下．樊囊体膜变得松散
N．Nucleus；0．Hastoglobuli F py．P3．2enoid{S Starch grain；V．Vacuoles；CH．Ch]orop[as[：CW ．CeI【waI【 1．Ukrastruc—
ture of f r ￡“ under air-showlng its normal strueture of vacuoles in numbers and sizes；2
． Showed incteased
number of vacuoi~s under 20 —high CO2一st,es~{3．Showed the pyrenoid and compact chlorop[ast；4 Lo0}ef thvlako Ld
memb rRnc8 of ch[oroplast under pressu re{5．Magnified view of the chlorop[ast in normal cells；6 F~tai[ed v Jew of ch【0r0
p[ast in cells under pressure
圉 4 空气条件下(1．3．5)和极高CO 浓度条件下(2．4，6)镀甲栅藻细胞亚显微结构的比较
Fig-4 Ultras[Ⅲ tⅢ 【comparison of the Scenedesm ⋯ ， under ai r
condition(I，3，5)and 20 high—CO=一stress(2．4，6)
细胞内各种离子(包括质子)的积累、用以维持细胞
在外界偏酸性环境的稳定性有关Ⅲ。
极高CO：浓度导致 F ／F 值迅速下降，说明细
胞光合 PSII系统活I生受到明显的抑制，与海滩绿球
藻在同样条件下的反应相同 这种抑制作用通常
伴随着 PSII量子产率(qbes— )的下降 。 和 PSI、PSII
荧光峰值比F724／Fd87的升高 ，反映了在极高
CO。浓度的胁迫条件下光台系统在能量分配上的菜
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第 5期 徐 敏等：极高 CO：胁迫对被~ (Scenedesmus nr nf“s)生理活性和细胞结构影响 443
略：细胞减少用于光合反应能量，即表现为 PSII活
性相对降低，减少分配于非循环光合磷酸化的电子
量，PSI活性增强[23，表明增加了用于循环光合磷酸
化的电子量，这样的结果有利于更多的电子用于胞
质的 ATP离子泵，维持细胞内质子浓度和 pH值的
稳定[引，保护细胞其它功能的实施。这种极高 CO
环境促使细胞调整能量从 PSII到 PSI的分配，并处
于低荧光状态，其过程 由LHCII磷酸化引起 PSlI／
PSI捕光截面比降低为推动力[ 。而电镜下观察到
极高 CO 条件下细胞内液泡的增多就是为 ATP酶
的富集提供场所，这一观点 Sasaki等指出海滩绿球
藻在极高 CO 浓度下液泡数 目和跨膜区域面积增
加，其液泡 H+一ATP酶活性为正常细胞的 2．5倍是
一 致的，是用以维持细胞内pH值稳定的一种变化，
并伴随减少卡尔文循环、降低光合效率[7]。而对非耐
受性的杆裂丝藻(Stichococcus bacilaris)的研究发
现其胞内pH下降明显[1引，可能是其不能适应极高
CO 的主要原因。在极高 CO 浓度下，被甲栅藻的
光合作用特征及其对无机碳的亲和力仍需进一步的
深入实验和探讨。
尽管在生物固碳方法的具体实施上目前仍存在
各种问题，但是结合藻类大规模光生物反应器培养
技术和某些藻类能耐受极高 CO 的特性 ，应用于大
型工业区(钢铁厂、发电厂等)的废气 CO 的固定、
回收和藻细胞的再利用的试验思路已经得到了越来
越多的认可，国外同行在这方面的研究也逐步增加，
作为CO 排放量大国，我们更有必要在这方面做深
入的研究。
参考文献：
[1]
[2]
[3]
[4]
Kodama N，Ikemoto H，Miyachi S．A new species of
highly COz-·tolerant fast-·growing marine microalga
suitable for high—density culture[J]．J Mar Biotech—
nol，1993。1(1)：21— 25．
Pesheva I，Kodama M ，Dionisio—Sese M L。Miyachi
S．Changes in photosynthetic characteristics induced
by transferring air—grow cels of Chlorococcum lit—
torale to CO2 conditions[J]．Plant Cell Physiol，
1994，35(3)：379— 387．
1wasaki I，Kurano N。M iyachi S．Effects of high—
CO,stress on photosystem I in a green alga，
Chlorococcum littorale，which has a tolerance to high
COz[J]．Photochem Photobiol(B：Biology)1 9 96。36
(3)：327—332．
1wasaki I，Hu Q，Kurano N，Miyachi S．Effect of
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[1O]
[11]
[12]
[13]
extremely high·-CO,stress on energy distribution be·-
tween photosystem I and photosystem II in a“high—
CO2”tolerant green alga，Chlorococcum littorale and
the intolerant green alga Stichococcus bacillaris[J]．
Photochem Photobiol(B：Biology)，1998，44(3)：
184— 190．
Sasaki T， Kurano N ， Miyachi S． Cloning and
characterization of high-·CO,-·specific cDNAs from a
marine microalga，Chlorococcum littorale，and effect
of CO2 concentration and iron deficiency on the gene
expression[J]．Plant Cell Physiol，1998，39(2)：
131—138．
Sasaki T ，Kurano N ，M iyachi S．Induction of ferric
reductase activity and of iron uptake capacity in
Chlorococcum littorale cells under extremely high—
CO2 and iron—deficient conditions[J]．Plant Cell
Physiol，1998，39(4)：405— 410．
Sasaki T，Pronina N A，M aeshima M ，1wasaki I，
Kurano N，Miyachi S．Development of vacuoles and
vacuolar H 一ATPase activity under extremely high
CO 2 conditions in Chlorococcum littorale cells[J]．
Plant Biol，1999，1(1)：68—75．
Beuf L， Kurano N ，M iyachi S． Rubisco activase
transcript(rca)abundance increases when the ma—
rine unicellular green alga Chlorococcum littorale is
grown under high—CO2 stress[J]．Plant Molecular
Biology，1999，41：627— 635．
Beuf L，Kurano N，M iyachi S．Effect of external pH
on inorganic carbon assimilation in unicellular marine
green algae[J]．Phycological Research，2000，48：
47— 54．
Satoh A ，Kurano N，M iyachi S。Inhibition of photo—
synthesis by intracellular carbonic anhydrase in mi—
croalgae under excess concentrations of CO2[J]．
Photosynthesis Research，2001，68：215— 224．
Maeda K，Owada M ，Kimura N ，Omata K，Karube
I．CO2 fixation from the flue gas on coal—fired ther—
mal power plant by microalgae[J]．Energy Convers
Mgmt，1995，36：717— 720．
Laws E A，Berning J L．Photosynthetic efficiency
optimization studies with the macroalga Gracilaria
tikvihae：implications for C02 emission control from
power plants口]．Bioresource Technology，1991，37：
25—35．
Hu Q，Kurano N，1wasaki I，Kawachi M and Miy—
achi S． Ultrahigh cell density culture of a marine
green alga，Chlorococcum littorale in a flat plate pho—
tobioreactor[J]．Appl Microbiol Biot，1998，49：
维普资讯 http://www.cqvip.com
444 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
[143
[15]
[16]
[17]
655— 662．
Seckbach J，Baker F A．Algae thrive under pure CO2
[J]．Nature，1970，227：744—745．
Sakai N，Sakamoto Y，Kishimoto N，Chihara M 。
Karube I．Chlorella strains from hot springs tolerant
to high temperature and high CO2[J]．Energy Con—
vets M gmt，1995，36：693— 696．
Chang E H and Yang S S．Some characteristics of
microalgae isolated in Taiwan for biofixation of car—
bon dioxide[J]．Bot Bul Acad Sin，2003，44：43—
52．
Hanagata N，Takeuchi T，Fukuju Y．Barnes D J and
Karube I．Tolerance of microalgae to high C02 and
high temperature[J]．Phytochemistry，1992，31：
3 345—3 348．
[18]
[19]
[2o3
[21]
Stein J R，Handbook of Phycological Methods：Cul—
ture Methods& Growth Measurement[M]．Cam—
bridge ：Cambridge University Press，1 973． 327—
329．
陈家荣．水化学实验指导书[M]．北京：中国农业出
版社，1996．124—126．
Miyachi S，Tsuzuki M ，Maruyama I，Gantar M 。
M iyachi S． Effects of C02 concentration during
growth on the intracellular structure of Chlorella and
Scenedesmus(Chlorophyta)[J]．J Phycol，1986，
22：313— 319．
杨胜铭，高辉远，邹琦．状态转换对光合作用中激发
能分配的调节及其与光破坏防御的关系[J]．植物生
理学通讯，2001，37(2)：89—94．
维普资讯 http://www.cqvip.com