全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(11): 1962−1969 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2011ZX08005-004-002)和江苏省农业科技自主创新基金项目(CX(11)1201)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 沈新莲, E-mail: xlshen68@126.com
第一作者联系方式: E-mail: fxq861223@aliyun.com
Received(收稿日期): 2013-03-29; Accepted(接受日期): 2013-06-09; Published online(网络出版日期): 2013-07-31.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130731.1819.007.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01962
棉属野生种旱地棉苏氨酸醛缩酶基因 GarTHA 的克隆及功能验证
范昕琦 刘章伟 冯 娟 徐 鹏 张香桂 沈新莲*
江苏省农业科学院经济作物研究所 / 农业部长江下游棉花与油菜重点实验室, 江苏南京 210014
摘 要: 盐胁迫是影响作物生长和发育的重要因素之一。一些棉属野生种具有较好的耐盐性, 是开展棉花耐盐性机
制研究以及改良陆地棉耐盐性的重要资源。本研究基于 cDNA-AFLP技术分离获得的旱地棉(Gossypium aridum)盐胁
迫下差异表达片段序列信息, 经电子克隆技术和 RT-PCR 方法克隆了旱地棉苏氨酸醛缩酶基因 cDNA 全长, 命名为
GarTHA (GenBank登录号为 KC167360)。该 cDNA全长为 1018 bp, 包含一个 822 bp的完整 ORF, 编码 273个氨基
酸残基, 蛋白质分子量为 82.57 kD, 等电点为 4.89。GarTHA基因与杨树 PtTHA基因同源性最高, 为 84.6%。为进一
步验证其功能, 利用拟南芥逆境胁迫启动子 rd29A构建植物表达载体, 将GarTHA基因的完整ORF转入拟南芥中, 获
得转基因植株并进行了耐盐性鉴定。结果表明, 在盐胁迫下转基因拟南芥种子的发芽率明显高于野生型, 且转基因植
株的根长显著高于野生型。说明 GarTHA基因可能参与植物的盐胁迫反应, 从而提高植物抗逆性。
关键词: 旱地棉; 苏氨酸醛缩酶; 耐盐性; 结构特征; 功能分析
Cloning and Functional Analysis of GarTHA Gene from Gossypium aridum
FAN Xin-Qi, LIU Zhang-Wei, FENG Juan, XU Peng, ZHANG Xiang-Gui, and SHEN Xin-Lian*
Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Cotton and Rapeseed (Nanjing), Ministry of Agriculture,
Nanjing 210014, China
Abstract: Salinity stress is one of the most important factors that impede the growth and development of various crops. Some
Gossypium wild species with tolerance to high salinity are valuable germplasm resource for studying salt tolerance mechanism in
Gossypium and improving salinity resistance in upland cotton. In the previous study, we obtained a differential expression fragment
by comparing differential expression transcript under stress treatment in diploid G. aridum species using cDNA-AFLP technique. In
this study, using the partial cDNA sequences as queries, the Gossypium EST database was screened and the corresponding cDNA
sequence containing a complete ORF was assembled. As a result, a novel gene, encoding G. aridum threonine aldolase, was cloned.
The gene was designated as GarTHA (G. aridum THA; GenBank accession number: KC167360). The ORF of GarTHA was 822 bp
encoding 273 amino acid residues with a predicted molecular weight of 82.57 kD and a predicted isoelectric point of 4.89. The
GarTHA showed the highest similarity of 84.6% with poplar PtTHA. To characterize its putative function, we transformed the ORF of
GarTHA gene driven by rd29A promoter into Arabidopsis. The growth of transgenic plants was observed under salinity stress. The
seed germination rate and root length of transgenic Arabidopsis were significantly higher than those of the wild type plants under salt
stress. The results showed that GarTHA gene could improve salt resistance in plants.
Keywords: Gossypium aridum; Threonine aldolase; Salt tolerance; Structural characterization; Functional analysis
土壤盐渍化是影响农业生产的一个重要因素 ,
世界上约有 3.33 亿公顷土地具有不同程度的盐渍
化。我国现有盐渍土面积约 34.70×106 hm2, 有
17.33×106 hm2 盐碱荒地尚待开发[1]。棉花属中等耐
盐作物, 是盐碱地先锋作物。近年来, 随着人口增
加、耕地面积减少, 粮棉油安全供给的矛盾日益突
出。进一步发掘棉花抗胁迫能力, 将棉花生产向沿
海滩涂及内陆盐碱地转移 , 对缓解粮棉争地矛盾 ,
稳定植棉面积, 实现农业生产的可持续发展具有十
分重要的意义。
第 11期 范昕琦等: 棉属野生种旱地棉苏氨酸醛缩酶基因 GarTHA的克隆及功能验证 1963


从棉花中克隆耐盐相关基因、开展耐盐机制研
究是改良棉花耐盐性的重要基础。植物中与盐胁迫
相关的基因主要有以下几类, 即与信号转导途径相
关的基因 [2-7], 与离子转运及离子平衡相关的基
因[8-9], 参与渗透保护物质的生物合成类基因, 主要
涉及水分胁迫如水通道蛋白[10], 胚胎发育晚期丰富
蛋白(LEA 类蛋白)[11-14]以及抗氧化胁迫如超氧化物
歧化酶(SOD)、过氧化氢酶、抗坏血酸、谷胱甘肽合
成酶基因等[15-19]。
甜菜碱是植物抗非生物胁迫中一类重要的渗透
保护性物质。当遇盐碱或水分胁迫时, 细胞质中积
累大量有机渗透调节剂甜菜碱, 而将细胞质中的无
机渗透调节剂被挤向液泡, 维持胞质与细胞内液泡
渗透平衡, 从而避免了细胞质高浓度无机离子对酶
和代谢的毒害。盐胁迫下植物体内甜菜碱的积累是
一种有利于植物在胁迫下生长的重要生理现象, 其
含量与植物耐盐性呈正相关[20-23]。研究表明苏氨酸
醛缩酶是由苏氨酸至甜菜碱生物合成过程中的关键
酶之一。在高等植物中, 苏氨酸醛缩酶普遍存在, 它
参与高等植物的氮素代谢过程, 苏氨酸在其作用下,
裂解成甘氨酸和乙醛, 乙醛可氧化成乙酸再生成乙
酰辅酶 A, 而乙酰辅酶 A 则参与了脂类的合成。甘
氨酸在甘氨酸 N-甲基化转移酶的作用下, 经过三步
甲基化作用合成甜菜碱 , 从而提高植株的抗逆
性[24-26]。
目前植物中有关苏氨酸醛缩酶在耐盐机制中作
用的研究较少[27], 在棉花中关于该基因的研究尚未
见相关报道。在前期的研究中我们利用 cDNA-AFLP
技术从棉属野生种旱地棉(Gossypium aridum)中克
隆了一个苏氨酸醛缩酶基因片段[28], 本研究拟利用
电子克隆及 RT-PCR技术克隆该基因的 ORF全长序
列, 分析该基因在盐胁迫下的功能, 为棉花耐盐性
的改良提供新的基因资源。
1 材料与方法
1.1 试验材料及盐处理方法
试验材料棉属野生种旱地棉(G. aridum)种子由
中国农业科学院棉花研究所海南岛野生棉种植园提
供。将旱地棉种子播于盆钵中, 待长至 4~5 片真叶
时将小苗从土中取出, 洗净根部泥土, 水培缓苗 3~5
d。然后用含 200 mmol L–1 NaCl (其中 [Na+]∶
[Ca2+]=15∶1)的营养液处理, 分别在处理 0、1、3、
6、12、24和 48 h后, 取叶片以液氮速冻于–70℃保
存备用。
拟南芥种子 (Arabidopsis thaliana, wild-type,
Col-0)由本实验室保存。将消毒灭菌处理的拟南芥种
子播于 1/2MS (含 1.5%的蔗糖)培养基上, 4℃, 黑暗
培养 2~3 d后转移到培养箱培养(16 h光照/8 h黑暗)
5~7 d。再将一周龄幼苗转移到灭菌基质(草炭土∶蛭
石=1∶1)中在 22℃/18℃, 16 h光照/8 h黑暗下培养,
待植株长出花蕾时采用浸花法转化[29]。下文所提到
拟南芥植物的正常培养都是在 22℃光照 16 h/18℃
黑暗 8 h的条件下。
1.2 总 RNA的提取
用改良的 CTAB法提取旱地棉叶片 RNA [30], 采
用 TRIzol试剂盒提取拟南芥 RNA。
1.3 目的基因的克隆
以本实验室通过 cDNA-AFLP 技术获得的一个
苏氨酸醛缩酶基因片段(153 bp)为探针 [28], 利用电
子克隆技术, 在 NCBI中用 BLAST程序(http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/PlantESTBLAST.
shtml)对棉属的EST数据库进行Blastn比对, 检索出
所有与查询探针高度同源的棉属 EST 序列
(CD486154、DT567433、DN799983、DR463228、
DR463773、DW477047、DW477048、DW513781、
DW513782、ES828657、CO098604.1、CO090746.1、
CO090745.1 、 FF403743.1 、 FG357312.1 和 CO
075985.1), 拼接后 , 获得的序列经在线软件预测
cDNA 全 长 (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html),
然后用在线软件 ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/gorf/gorf.html)预测完整开放阅读框(ORF)。
在ORF两端设计上游引物GarTHA-F: 5′-GAAA
CAATGGTGACCAAAACAGTAG-3′ 和 下 游 引 物
GarTHA-R: 5′-GTCTGACTTAGTTCCCATTTTCTT
C-3′。以盐处理的旱地棉 cDNA为模板采用 TransGen
Biotech公司的 EasyPfu DNA酶扩增目的基因。反应
体系含 2.5 U μL–1 EasyPfu DNA 聚合酶 0.5 μL、
10×EasyPfu buffer 2.5 μL、2.5 mmol L–1 dNTPs 2.0
μL、模板 1.0 μL, 上下游引物各 1.0 μL, 加 ddH2O
至终体积 25 μL。扩增程序为 94℃ 3 min; 94℃ 30 s,
60℃ 30 s, 72℃ 2 min, 34个循环; 72℃ 10 min, 4℃
保存。回收扩增产物并连接到 PTG19-T 载体上, 转
入大肠杆菌, 以菌液 PCR 筛选阳性克隆, 送上海英
骏生物技术有限公司测序。
1.4 生物信息学分析
利用 NCBI网站的 Blast程序进行数据比对, 利
用 GENSCAN (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)
在线软件进行基因预测 , 利用 ORF Finder (http:
1964 作 物 学 报 第 39卷


//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)寻找完整的开
放阅读框 , 利用 DNAMAN 软件包与其他植物的
THA 氨基酸序列进行蛋白序列多重比对 , 利用
MEGA4.0.2构建系统进化树。利用 Plants 数据库
(http://plantsp.genomics.purdue.edu/html/feature_scan
.html)网站在线工具预测蛋白结构。
1.5 半定量 RT-PCR检测
以半定量 RT-PCR 技术检测经 200 mmol L–1
NaCl处理 0、1、3、6、12、24和 48 h后旱地棉叶
片中 GarTHA的表达差异, 按照 TaKaRa公司的反转
录试剂盒说明书进行反转录操作。PCR 反应扩增程
序为 94℃ 3 min; 95℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃ 1 min,
36个循环; 72℃ 10 min, 4℃保存。以 1.2%的琼脂糖
凝胶电泳检测。扩增目的基因引物为 GarTHA-F 和
GarTHA-R, 内参选用 Histone3 (约 300 bp): 上游引
物序列为 5′-TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA-3′,
下游引物序列为 5′-GCGCAAAGGTTGGTGTCT
TC-3′。
1.6 植物表达载体的构建
以 pCAMBIA2301 (http://www.cambia.org/)为载
体基本骨架,拟南芥逆境胁迫诱导型启动子 rd29A表
达载体 pCAMBIA2301-rd29A-rbc的构建方法见冯娟
等[31]。
根据所得到的 GarTHA的 ORF序列设计构建载
体所需的目的基因引物 , 引物序列为 VC-THA-F:
5′-GCTCTAGAGCGAAACAATGGTGACCAAAACA
GTAG-3′ (下画线为 Xba I 酶切位点); VC-THA-R:
5′-TCCCCCGGGGGAGTCTGACTTAGTTCCCATTT
TCTTC-3′ (下画线为 Sma I酶切位点)。以盐处理 12 h
的旱地棉叶片 cDNA 为模板扩增 GarTHA 成熟蛋白
编码区。将扩增产物回收, 克隆。提取测序正确的
菌液的质粒, 进行 Xba I和 Sma I双酶切并回收目的
片段, 同时对 pCAMBIA2301-rd29A-rbc质粒也进行
Xba I和 Sma I双酶切并回收大片段, 然后将 2次回
收的片段连接构建植物表达载体 pCAMBIA2301-
rd29A-GarTHA。所有的效应质粒均经 PCR、酶切鉴
定正确。用电击法将 pCAMBIA2301-rd29A-GarTHA
质粒转入农杆菌菌株 EHA105 感受态细胞中, 获得
用于植物转化实验的工程农杆菌。
1.7 转化植株的获得和检测
通过浸花法将含重组质粒 pCAMBIA2301-
rd29A-GarTHA的工程农杆菌 EHA105转入 Col-0野
生型拟南芥, 于培养箱中正常培养, 3~4周后收获 T0
代成熟种子。将 T0代种子播种于含 100 mg L–1卡那
霉素的 1/2MS 培养基上初筛选, 播种 2 周后, 将野
生型和具有卡那抗性的 T1 代植株分别转移到基质
(泥炭土∶蛭石=1∶1)中单株培养, 然后进行 GUS
染色和目的基因 PCR检测, 得到 T1代阳性转化植株,
收获种子。GUS 染色过程是: 将新鲜的植物叶片放
入GUS染色缓冲液[10 mL体系含 0.5 mol L–1磷酸钠
缓冲液(pH 7.2) 1 mL、10% Triton X-100 0.2 mL、100
mmol L–1亚铁氰化钾 0.2 mL、100 mmol L–1铁氰化
钾 0.2 mL、100 mmol L–1 X-Gluc 0.2 mL、ddH2O 8.2
mL], 37℃ 2~5 h, 然后用移液器吸净染色液, 室温
条件下, 将染色样品依次在 20%、35%和 50%酒精中
分别浸泡 30 min脱色处理, 脱色后在室温下用 FAA
固定液(100 mL体系含 38%甲醛 5 mL、冰醋酸 5 mL、
70%酒精 90 mL)浸泡 30 min, 然后将植物样品放在
显微镜下观察。
将阳性 T1代转基因植株的种子播于土质基质
(蛭石∶泥炭土=1∶1)正常培养, 然后采集叶片进行
RT-PCR验证。基于 rd29A为逆境胁迫的诱导型启动
子, 目的基因的 RT-PCR检测在盐胁迫下进行, 具体
方法为, 将 PCR 阳性的 T1代种子播于土质基质(蛭
石∶泥炭土=1∶1), 3周左右将植株转移到含150
mmol L–1 NaCl的营养液中处理12 h, 采集叶片进行
RT-PCR 验证。 RT-PCR 检测所使用的引物为
GarTHA-F和 GarTHA-R。RT-PCR反应采用 TaKaRa
的 r-Taq酶进行扩增, 反应体系按照说明书配制, 扩
增程序为94℃ 3 min; 95℃ 45 s, 55℃ 45 s, 72℃ 1
min, 36个循环; 72℃ 10 min, 4℃保存。以1.2%的琼
脂糖凝胶电泳检测。
1.8 转基因植株的功能验证
将野生型和转基因拟南芥 T2代种子分别播于含
0或 150 mmol L–1 NaCl的 1/2MS培养基上, 置光照
培养箱正常培养, 3次重复, 每重复 50粒种子, 10 d
后观察植株表型并记录转基因株系的发芽率, 每重
复调查 20株苗的根长。采用 SPSS软件统计分析。
2 结果与分析
2.1 GarTHA基因的获得
通过 cDNA-AFLP 和电子克隆方法获得一长为
1897 bp的苏氨酸醛缩酶基因的 cDNA Contig。利用
GENSCAN和 ORF Finder软件预测该 cDNA全长为
1018 bp, 并发现该序列包含一个 822 bp 的完整
ORF。在 ORF 两端设计引物, 以盐处理旱地棉叶片
第 11期 范昕琦等: 棉属野生种旱地棉苏氨酸醛缩酶基因 GarTHA的克隆及功能验证 1965


的 cDNA为模板, 进行全长基因的扩增(图 1)。通过
TA 克隆, 测序获得该基因在旱地棉中的 cDNA 序
列, 测序结果经 Blast 比对, 证明所扩序列正确, 与
电子克隆序列相比, 序列相似度为 93.96%。将该基
因命名为 GarTHA 并提交 GenBank, 获得登录号为
KC167360。


图 1 GarTHA 全长 ORF 的克隆
Fig. 1 Cloning for full-length ORF of GarTHA
2.2 生物信息学分析
旱地棉苏氨酸醛缩酶基因 GarTHA cDNA 全长
为 1018 bp, 包含 822 bp的完整 ORF, 编码 273个氨
基酸残基 , 蛋白质分子量为 82.57 kD, 等电点为
4.89。将旱地棉苏氨酸醛缩酶基因编码的氨基酸序
列进行 BlastP 比对(图 2), 并构建系统发育树(图 3)
发现, GarTHA与拟南芥、杨树、马铃薯和玉米同源
基因的氨基酸相似度分别为 77.7%、84.6%、83.2%
和 75.8%。氨基酸序列多重比对结果表明, 旱地棉苏
氨酸醛缩酶和其他物种在 C端的保守性均较低。
在 Plants数据库 (http://plantsp.genomics.purdue.
edu/html/feature_scan.html)中分析表明, 该基因蛋白
包含氨基酸转移酶位点和9个N-肉豆蔻酰化位点 ,
表明该蛋白可能参与膜上蛋白间的相互作用, 并介
导氨基酸的跨膜转运, 其催化作用为催化苏氨酸裂
解为甘氨酸和乙醛。NCBI CDS程序分析 (图4)显
示GarTHA基因蛋白包含 5′磷酸结合位点及四聚
物结合位点, 这表明该类基因的表达可能受磷酸化
影响。


图 2 旱地棉苏氨酸醛缩酶(GarTHA)氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列多重比对结果
Fig. 2 Alignment of the deduced amino acid sequence of GarTHA with other THAs by DNAMAN program
GarTHA (KC167360); AtTHA (NP_563822.1); PtTHA (Xp_002325334.1): StTHA (ABB72802.1); ZmTHA (ACG33933.1).
1966 作 物 学 报 第 39卷



图 3 旱地棉苏氨酸醛缩酶氨基酸序列与其他物种同源序列的
进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic tree of putative GarTHA and other THAs
by MEGA4.0.2 program


图 4 GarTHA 蛋白结构预测
Fig. 4 Prediction of structure model in GarTHA

2.3 RT-PCR分析
为研究 GarTHA 基因在盐胁迫下的表达量变化,
分别提取不同盐处理时期的叶片 RNA, 并反转录成
cDNA, 进行了半定量 RT-PCR 检测。结果表明, 随
着盐处理时间的增加, GarTHA的表达量也呈递增的
趋势, 24 h达到最大, 48 h后 GarTHA的表达丰度开
始下降(图 5)。


图 5 盐胁迫下 GarTHA 半定量 PCR 分析
Fig. 5 Expression analysis of GarTHA by semi-quantitative
RT-PCR in G.. aridum under salt stress

2.4 转基因拟南芥的筛选与 PCR验证
将收获的 T0代种子播于含 100 mg L–1卡那霉素
的 1/2MS培养基上, 2周后转基因植株长出真叶并呈
绿色, 表型正常, 而非转基因植株生长停留在子叶
期, 并且呈黄色, 叶绿素含量较低。分别采集野生型
植株和卡那霉素抗性的 T1代植株叶片进行 GUS 染
色(图 6)和 PCR检测。获得 GUS染色和 PCR检测均
为阳性的植株, 说明 GarTHA 基因已成功转入拟南
芥基因组中。将 T1代阳性转基因植株的种子播于土
质基质 , 采集叶片进行 RT-PCR 验证。结果显示
GarTHA 基因在 2 个株系(T2-1和 T2-6)中具有较强的
表达(图 7)。因此选取这 2个株系用于进一步的基因
功能研究。

图 6 转 GarTHA 基因拟南芥的 GUS 染色
Fig. 6 GUS staining of GarTHA transgenic Arabidopsis


图 7 转 GarTHA 基因拟南芥 RT-PCR 检测
Fig. 7 RT-PCR detection of GarTHA transgenic Arabidopsis
+: 质粒; –: 非转基因植株; T2-1、T2-2、T2-3、T2-4、T2-5、T2-6;
转基因 T2代株系。
+: plasmid; –: non-transgenic plant; T2-1, T2-2, T2-3, T2-4, T2-5, T2-6:
transgenic lines of T2 generation.

2.5 转基因拟南芥耐盐性鉴定
将野生型和 2个转基因株系(T2-1和 T2-6)的 T3代
种子分别播于含 0, 150 mmol L–1 NaCl 1/2×MS上, 3
次重复。10 d 后, 野生型拟南芥种子平均萌发率分
别为 83%和 35%, 而转 GarTHA 基因株系 T2-1的平
均萌发率分别为 87%和 77%, T2-6平均萌发率分别为
91%和 88% (图 8)。统计分析表明盐胁迫下转基因株
系的发芽率显著高于野生型(图 9-A)。在不含 NaCl
的条件下, 野生型、T2-1 和 T2-6 的平均根长分别为
24.6、25.8和 25.0 mm, 差异不显著。盐胁迫下转基
因株系 T2-1、T2-6的平均根长分别为 7.45 mm和 9.90
mm, 而野生型为 5.05 mm, 差异达显著水平 (图
9-B)。且野生型植株出现的盐胁迫伤害和黄化现象
较转基因植株明显, 侧根较少, 表明 GarTHA 基因
可以增强拟南芥的耐盐性。
3 讨论
苏氨酸醛缩酶在高等植物中普遍存在, 是一类
催化苏氨酸转化为甘氨酸和乙醛的酶, 参与高等植
物的氮素代谢过程。研究表明植物在逆境下氨基酸
的代谢较正常条件下更为活跃, 细胞内可溶性糖和
氨基酸等含量明显提高, 并证明苏氨酸醛缩酶在这
一过程中发挥了重要作用 [32]。甘氨酸可经 3次甲基
第 11期 范昕琦等: 棉属野生种旱地棉苏氨酸醛缩酶基因 GarTHA的克隆及功能验证 1967



图 8 盐胁迫下野生型和转基因拟南芥的生长情况
Fig. 8 Phenotype analysis of salt tolerance of GarTHA transgenic Arabidopsis


图 9 NaCl 处理的野生型和转基因株系发芽率和根长统计分析
Fig. 9 Statistical analysis of germination rate and root length in wild type and transgenic plants under salt stress
图柱上方不同大写和小写字母分别表示在 P<0.01和 P<0.05水平上的差异显著性。
Bars with different capitals or lowercases are significantly different at P<0.01 and P<0.05, respectively. Data are means±SE of three
experiments.

化而合成甜菜碱, 而乙酰辅酶 A 则参与了多种脂类
的合成, 从而提高植物耐逆性[25,33-36]。Waditee等[25]
研究表明在拟南芥中, 除胆碱两步氧化反应可生成
耐逆物质甜菜碱外, 由甘氨酸经两种 N-端甲基化转
移酶的作用, 也可以产生甜菜碱。而甜菜碱是植物
抗非生物胁迫中一类重要的渗透保护性物质。研究
表明盐胁迫下植物体内甜菜碱的含量迅速上升, 这
种积累是一种有利于植物在胁迫下生长的重要生理
现象, 其含量与植物耐盐性呈正相关[20-23]。本研究
通过 cDNA-AFLP 和电子克隆技术从野生种旱地棉
中克隆了 GarTHA 基因, 其结构与催化特性表明该
基因编码苏氨酸醛缩酶。半定量 PCR 表明 GarTHA
基因受盐胁迫诱导表达。转 GarTHA 基因拟南芥发
芽率和根长测定表明 GarTHA 基因能够提高植株的
耐盐能力。另外, 我们利用 GarTHA 基因在拟南芥
基因组中的同源基因 AtTHA1 (At1g08630)在 ATTED
(http://atted.jp/data/locus/At1g08630.shtml)中分析结
果也表明该基因与脂类代谢酶类的共表达值最高 ,
且与逆境转录因子 MYB 家族中的 MYB13 (At1g
06180)基因有关联(数据未显示), 乔孟等 [37]研究表
明 MYB13基因受高盐胁迫诱导反应。虽然目前有关
THA 基因在植物中的功能报道不多, 但本研究中对
GarTHA 基因的结构与功能分析均表明该基因编码
的蛋白可能参与逆境胁迫下的生理生化反应, 从而
提高植物抗逆性。
在植物抗逆基因工程研究中, 大多使用组成型
启动子来驱动目的基因的表达, 但Kasuga等[38]报道
组成型启动子 CaMV35S 驱动 DREB 基因在拟南芥
中表达, 虽提高了抗逆性, 但植株矮化、生长畸形,
而由诱导型启动子 rd29A 启动的 DREB 基因在拟南
芥中的表达不仅提高了植株的抗逆性, 而且避免了
对生长的负面影响。朱丽萍等[39]报道用组成型启动
子CaMV35S驱动 BADH基因在烟草中表达, 转基因
烟草的耐盐性提高了 , 但生长延迟。Pellegrineschi
等[40]用诱导型启动子 rd29A驱动 DREBA/CBF3的表
达, 提高了转基因小麦的耐旱性, 而且没有引起明
1968 作 物 学 报 第 39卷


显的畸形。表明组成型启动子在驱动外源基因表达
的同时, 对植物的一些生理代谢活动却有抑制作用,
而 rd29A 启动子由于只在逆境诱导下表达, 对植株
生长的影响较小。为了降低外源基因的表达对植株
正常生长的影响, 提高该基因在植物耐盐性改良中
的应用价值 , 我们构建了逆境胁迫特异启动子
rd29A 的表达载体并将 GarTHA 成熟的蛋白编码区
转入拟南芥进行功能验证。研究结果表明, 由 rd29A
启动的 GarTHA 基因能在盐胁迫下正常表达, 并表
现了一定的耐盐功能, 为下一步该基因在棉花耐盐
性改良中的应用提供了理论与实践依据。
本试验通过对转基因拟南芥植株的表型观察研
究了GarTHA在高盐胁迫下的抗逆性, 证明GarTHA
基因在逆境胁迫下可能参与一系列生理生化反应 ,
从而提高植物的耐盐抗逆性。而在逆境胁迫下 ,
GarTHA基因如何参与转基因植株的生理、生化反应
以及这些生理、生化特性与抗逆性的关系及该基因
所编码的蛋白在旱地棉逆境胁迫信号转导途径中的
作用还需进一步研究。
4 结论
获得了旱地棉苏氨酸醛缩酶基因 GarTHA, 该
基因包含一个 822 bp 完整的开放阅读框, 编码 273
个氨基酸残基。GarTHA基因受盐胁迫诱导表达量迅
速上调, 该基因能提高植物的耐盐性。
References
[1] Zhao K-F(赵可夫), Feng L-T(冯立田). Halophytes Resources of
China. Beijing: Science Press, 2001. pp 32–43 (in Chinese)
[2] Guo Y H, Yu Y P, Wang D, Wu C A, Yang G D, Huang J G, Zheng
C C. GhZFP1, a novel CCCH-type zinc finger protein from
cotton, enhances salt stress tolerance and fungal disease
resistance in transgenic tobacco by interacting with GZIRD21A
and GZIPR5. New Phytol, 2009, 183: 62–75
[3] Huang B, Jin L, Liu J Y. Identification and characterization of the
novel gene GhDBP2 encoding a DRE-binding protein from
cotton (Gossypium hirsutum). J Plant Physiol, 2008, 165:
214–223
[4] Yang Y-W(杨郁文), Ni W-C(倪万潮), Zhang B-L(张保龙), Shen
X-L(沈新莲), Zhang X-G(张香桂), Xu Y-J(徐英俊), Yao S(姚
姝). Molecular cloning and expression analysis of a serine/
threonine protein kinase gene in upland cotton. Cotton Sci (棉花
学报), 2006, 18(3): 140–144 (in Chinese with English abstract)
[5] Haake V, Cook D, Riechmann J, Pineda O, Thomashow M F,
Zhang J Z. Transcription factor CBF4 is a regulator of drought
adaptation in Arabidopsis. Plant Physiol, 2002, 130: 639–648
[6] Zhu J K. Salt and drought stress signal transduction in plants.
Annu Rev Plant Biol, 2002, 53: 247–273
[7] Hu H H, You J, Fang Y J, Zhu X Y, Qi Z Y, Xiong L Z.
Characterization of transcription factor gene SNAC2 conferring
cold and salt tolerance in rice. Plant Mol Biol, 2008, 67: 169–181
[8] Shi H Z, Lee B H, Wu S J, Zhu J K. Overexpression of a plasma
membrane Na+/H+ antiporter gene improves salt tolerance in
Arabidopsis thaliana. Nat Biotechnol, 2003, 21: 81–85
[9] Wu C A, Yang G D, Meng Q W, Zheng C C. The cotton GhNHX1
gene encoding a novel putative tonoplast Na+/H+ antiporter plays
an important role in salt stress. Plant Cell Physiol, 2004, 45:
600–607
[10] Kopka J, Pical C, Gray J E, Rober M B. Molecular and enzymatic
characterization of three phosphoinositide-specific phospholipase
C isoforms from potato. Plant Physiol, 1998, 116: 239–250
[11] Babu R C, Zhang J X, Blum A, David-Ho T H, Wu R, Nguyen H
T. HVA1, a LEA gene from barley confers dehydration tolerance
in transgenic rice (Oryza sativa L.) via cell membrane protection.
Plant Sci, 2004, 166: 855–862
[12] Imai R, Chang L, Ohta A, Bray E, Takagi M. A lea-class gene of
tomato confers salt and freezing tolerance when expressed in
Saccharomyces cerevisiae. Gene, 1996, 170: 243–248
[13] Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki
K. Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene
transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nat
Biotechnol, 1999, 17: 287–291
[14] Xu D, Duan X, Wang B, Hong B, Ho T H D, Wu R. Expression
of a late embryogenesis abundant protein gene, HVA1, from
barley confers tolerance to water deficit and salt stress in
transgenic rice. Plant Physiol, 1996, 110: 249–257
[15] Guan L M, Zhao J, Scadalios J G. Cis-elements and transfactors
that regulate expression of the maize Cat1 antioxidant gene in
response to ABA and osmotic stress: H2O2 is the likely
intermediary signaling molecule for the response. Plant, 2000, 22:
87–95
[16] Prasad T K, Anderson M D, Martin B A, Steward C R. Evidence
for chilling-induced oxidative stress in maize seedlings and a
regulatory role for hydrogen peroxide. Plant Cell, 1994, 6: 65–74
[17] Zhang X, Zhang L, Dong F, Gao J, Galbraith D W, Song C P.
Hydrogen peroxide is involved in abscisic acid-induced stomatal
closure in Vicia faba. Plant Physiol, 2001, 126: 1438–1448
[18] Zhao Z, Chen G, Zhang C. Interaction between reactive oxygen
species and nitric oxide in drought-induced abscisic acid
synthesis in root tips of wheat seedlings. Plant Physiol, 2001, 28:
1055–1061
[19] Zheng X, Pontes O, Zhu J, Miki D, Zhang F, Li W X, Iida K,
Kapoor A, Pikaard C S, Zhu J K. ROS3 is an RNA-binding
protein required for DNA demethylation in Arabidopsis. Nature,
2008, 455: 1259–1262
[20] Hanson A D, May A M, Grumet R, Bode J, Jamieson G C,
Rhodes D. Betaine synthesis in chenopods: localization in
chloroplasts. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82: 3678–3682
[21] McCue K F, Hanson A D. Drought and salt tolerance: towards
第 11期 范昕琦等: 棉属野生种旱地棉苏氨酸醛缩酶基因 GarTHA的克隆及功能验证 1969


understanding and application. Trends Biotechnol, 1990, 8:
358–362
[22] Alloing G, Travers I, Sagot B, Le Rudulier D, Dupont L. Proline
betaine uptake in Sinorhizobium meliloti: characterization of Prb,
an Opp-like ABC transporter regulated by both proline betaine
and salinity stress. J Bacteriol, 2006, 188: 6308–6317
[23] Ashraf M, Foolad M. Roles of glycine betaine and proline in
improving plant abiotic stress resistance. Environ Exp Bot, 2007,
59: 206–216
[24] Li Q L, Gao X R, Yu X H, Wang X Z, An L J. Molecular cloning
and characterization of betaine aldehyde dehydrogenase gene
from Suaeda liaotungensis and its use in improved tolerance to
salinity in transgenic tobacco. Biotechnol Lett, 2003, 25:
1431–1436
[25] Waditee R, Bhuiyan M N H, Rai V, Aoki K, Tanaka Y, Hibino T,
Suzuki S, Takano J, Jagendorf A T, Takabe T. Genes for direct
methylation of glycine provide high levels of glycinebetaine and
abiotic-stress tolerance in Synechococcus and Arabidopsis. Proc
Natl Acad Sci USA, 2005, 102: 1318–1323
[26] Luo X-L(罗晓丽), Xiao J-L(肖娟丽), Wang Z-A(王志安), Zhang
A-H(张安红 ), Tian Y-C(田颖 川 ), Wu J-H(吴家和 ).
Overexpression of Spinacia oleracea betaine aldehyde
dehydrogenase (SoBADH) gene confers the salt and cold tolerant
in Gossypium hirsutum L. Chin J Biotech (生物工程学报), 2008,
24(8): 1464–1469 (in Chinese with English abstract)
[27] Liu J Q, Dairi T, Itoh N, Kataoka M, Shimizu S, Yamada H. Gene
cloning, biochemical characterization and physiological role of a
thermostable low-specificity L-threonine aldolase from
Escherichia coli. Eur J Biochem, 1998, 255: 220–226
[28] Liu Z W, Feng J, Fan X Q, Xu P, Zhang X G, Shen X L.
cDNA-AFLP analysis of differentially-expressed gene in resp-
onse to salt stress in Gossypium airdum. Cotton Sci, 2012, 24:
435–443
[29] Harrison S J, Mott E K, Parsley K, Aspinall S, Gray J C, Cottage
A. A rapid and robust method of identifying transformed
Arabidopsis thaliana seedlings following floral dip transfor-
mation. Plant Methods, 2006, 2: 19
[30] Hu G-H(胡根海), Yu S-X(喻树迅). Extraction of high-quality
total RNA in cotton leaf with improved CTAB method. Cotton
Sci (棉花学报), 2007, 19(1): 69–70 (in Chinese with English
abstract)
[31] Feng J(冯娟), Fan X-Q(范昕琦) Xu P(徐鹏), Zhang X-G(张香
桂), Shen X-L(沈新莲). Isolation and functional analysis of
GarCIPK8 gene from Gossypium aridum. Acta Agron Sin (作物
学报), 2013, 39(1): 1–9 (in Chinese with English abstract)
[32] Luo Z-Y(罗宗雅), Tang Y-Z(汤玉璋). Nitrogen metabolism in
higher plants. Biochem Biophys (生物化学与生物物理学报),
1964, 4(5): 391–454 (in Chinese)
[33] Herbert D, Walker K A, Price L J, Cole D J, Pallett K E, Ridley S
M, Harwood J L. Acetyl-CoA carboxylase—a graminicide target
site. Pesticide Sci, 1997, 50: 67–71
[34] Nikolau B J, Ohlrogge J B, Wurtele E S. Plant biotin-containing
carboxylases. Arch Biochem Biophy, 2003, 414: 211–222
[35] Gronwald J W. Lipid biosynthesis inhibitors. Weed Sci, 1991, 39:
435–449
[36] Turner J A, Pernich D J. Origin of enantiomeric selectivity in the
aryloxyphenoxypropionic acid class of herbicidal acetyl
coenzyme A carboxylase (ACCase) inhibitors. J Agric Food
Chem, 2002, 50: 4554–4566
[37] Qiao M(乔孟), Yu Y-C(于延冲), Xiang F-N(向凤宁). The roles
of the Arabidopsis R2R3-MYB transcription factors in the stress
responses. Chin Bull Life Sci (生命科学), 2009, 21(1): 145–150
(in Chinese with English abstract)
[38] Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki
K. Improving plant drought, salt and freezing tolerance by gene
transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nat
Biotechnol, 1999, 17: 287–291
[39] Zhu L-P(朱丽萍), Yu Z(于壮), Zou C-X(邹翠霞), Li Q-L(李秋
莉 ). Plant stress-inducible promotors and their function.
Hereditas (遗传), 2010, 32(3): 229–234 (in Chinese with English
abstract)
[40] Pellegrineschi A, Reynolds M, Pacheco M, Brito R M, Almeraya
R, Yamaguchi-Shinozaki K, Hoisington D. Stress induced
expression in wheat of the Arabidopsis thaliana DREB1A gene
delays water stress symptoms under greenhouse conditions.
Genome, 2004, 47: 493–500