全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(1): 34−42 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08005-004-002)和江苏省农业科技自主创新基金[CX(11)1201]资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 沈新莲, E-mail: shenxinlian@yahoo.com.cn
第一作者联系方式: E-mail: hunanjf@163.com
Received(收稿日期): 2012-04-18; Accepted(接受日期): 2012-09-05; Published online(网络出版日期): 2012-11-14.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20121114.1641.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00034
棉属野生种旱地棉蛋白激酶基因 GarCIPK8的克隆与功能分析
冯 娟 范昕琦 徐 鹏 张香桂 沈新莲*
江苏省农业科学院经济作物研究所 / 农业部长江下游棉花与油菜重点实验室, 江苏南京 210014
摘 要: CIPK (calcineurin B-like calcium sensor interacting protein kinase)是植物钙感受器钙调磷酸酶 B类似蛋白特定
靶向的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在前期的研究中, 我们将棉属野生种 D亚组旱地棉(Gossypium aridum)盐胁迫前
后 RNA混合样品进行转录组测序, 发现一 CIPK相关基因存在较高的转录丰度。盐胁迫下荧光定量 PCR分析表明该
基因在根部表现诱导上调表达, 推测该基因可能参与植物在高盐胁迫下的生理调控。利用电子克隆及 RT-PCR方法从
旱地棉中克隆了一个 ORF全长为 1350 bp的蛋白激酶基因 GarCIPK8。序列分析表明该基因编码的蛋白含有 449个
氨基酸, 分子量为 51.12 kD, 理论等电点为 8.13, 其 N端催化结构域包含一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域, C端具有植
物 CIPK蛋白家族特有的 24个氨基酸组成的 NAF保守结构域; 与水稻 OsCIPK8蛋白的相似度为 73.95%。为进一步
验证其功能, 利用组成型高效强启动子 CaMV35S和拟南芥逆境胁迫启动子 rd29A构建植物表达载体并转化烟草, 经
PCR 和 RT-PCR 分子检测, 证明 GarCIPK8 基因已经整合到烟草基因组中, 并正常表达。T1代转基因植株耐盐性鉴
定结果表明 GarCIPK8基因对提高转基因植株的耐盐性有较明显的作用, PEG干旱模拟试验也证明 GarCIPK8基因可
增强植株的抗旱性。
关键词: 旱地棉; GarCIPK8; 耐盐性; 耐旱性
Isolation and Functional Analysis of GarCIPK8 Gene from Gossypium aridum
FENG Juan, FAN Xin-Qi, XU Peng, ZHANG Xiang-Gui, and SHEN Xin-Lian*
Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Cotton and Rapeseed, Ministry of Agriculture, Nanjing
210014, China
Abstract: CIPK (calcineurin B-like calcium sensor interacting protein kinase) is a typical group of serine / threonine protein
kinase targeting calcium sensor calcineurin B-like protein-specific. In a previous study, we obtained the transcriptome of Gos-
sypium aridum with a pooled RNA sample from root and leaf of G. aridum under salt stress. From the transcriptome data, we
founded that a CIPK related gene had high level of expression abundance. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis
showed its relative expression level was up-regulated in root induced by salt stress, indicating this CIPK related gene might be
involved in response to salt stress during cotton seedling stage. By in silico cloning and RT-PCR technology, a full-length cDNA
encoding a CIPKs homologue (GarCIPK8) was isolated from G. aridum. The deduced GarCIPK8 protein had 449 amino acids
with a predicted molecular weight of 51.12 kD and a predicted isoelectric point of 8.13. The kinase N-terminal catalytic domain of
GarCIPK8 exhibited a typica1 serine / threonine protein kinase domain. The conserved 24 amino acid motif existed in C-terminal
non-kinase regions of GarCIPK8 protein. Alignment of amino acid sequence showed that GarCIPK8 was 73.95% identical to
Oryza sativa OsCIPK8 protein. In order to characterize its putative function, the GarCIPK8 gene driven by CaMV35S promoter
and stress-specific promoter rd29A respectively were transformed into tobacco by Agrobacterium-mediated transgenic technology.
PCR and RT-PCR detection confirmed that GarCIPK8 gene was integrated into tobacco genome and expressed normally. The
growth of transgenic plants of T1 generation was observed under salinity and drought stresses, showing that transgenic plants en-
hance tolerance to both high salt and osmotic stresses.
Keywords: Gossypium aridum; GarCIPK8; Salt stress; Drought stress
第 1期 冯 娟等: 棉属野生种旱地棉蛋白激酶基因 GarCIPK8的克隆与功能分析 35


植物在生长发育过程中经常遭遇盐害、干旱、
低温等非生物胁迫, 在长期进化过程中, 植物通过
激活逆境信号, 并识别、转导这种信号, 最终调节胁
迫相关基因的表达等分子网络级联反应, 形成一系
列复杂的逆境信号传递分子机制[1-3]。普遍认为 Ca2+
是参与植物环境适应的第二信使, Ca2+的改变作为
次级信号转导细胞对外界刺激的响应[4-5], 即诱发产
生钙信号, 通过与钙感受器蛋白结合, 传递、放大特
异性的钙信号, 从而引起一系列的生理反应[6-7]。类
钙调磷酸酶 B 类似蛋白(calcineurin B-like protein,
CBL)是近年来发现的植物所特有的一类新型 EF 手
型钙感受器蛋白, 结构非常保守, 当其识别钙信号
后 , 需与下游的 CIPK (CBL interacting protein
kinase, 也称 SnRK3或 PKS)结合发挥效能[7-8]。CIPK
是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 通常具有 N 端激
酶催化结构域和 C端调节结构域。C端调节域内有
一保守的 21~24个氨基酸结构的 NAF结构域, 能有
效结合 CBL 形成 CBL-CIPK 复合体, 同时 NAF 也
能抑制 CIPK本身的激酶活性[9]。目前, 在拟南芥、
水稻中分别发现有 26个和 33个 CIPK基因 , 各有
10 个 CBL 基因[5-6,10]。CIPKs 可分为具有内含子和
不具有内含子两大亚族。转录表达和功能分析表明,
CIPK 基因是否含有内含子与其响应逆境胁迫没有
明显的关系[11]。
CBL与 CIPK形成复合体, 一种 CBL可能与多
个 CIPK相互作用, 而一个 CIPK也可能和几个 CBL
相互作用, 这样可以组成多种信号通路, 为充分应
对各种环境胁迫、机械损伤、植物激素刺激及生长
发育需求提供全方位解密 Ca2+信号、激活下游目标
基因以满足植株生长的 CBL-CIPK信号系统。目前,
已鉴定出部分 CBL-CIPK 信号系统的成员, 并在一
些模式植物的研究中解析了该信号网络在植物应答
逆境胁迫中的功能[5,12]。CIPK 序列保守, 同一物种
不同 CIPKs 间存在功能冗余, 不同个体间高度相似
的 CIPKs 可能介导相同的抗逆反应[13-14], 故必须对
不同物种的 CIPK 功能进行详细的研究, 揭示 CIPK
介导的复杂网络机制, 从而为借助基因工程手段来
改良作物抗逆性提供可能。
棉花是世界上重要的纤维作物和油料作物, 也
是盐碱地的先锋作物, 但棉花中 CBL-CIPK 部分信
号 途 径 的 相 关 研 究 较 少 , 目 前 仅 在 陆 地 棉
(Gossypium hirsutum L.)中报道了一个棉花盐胁迫相
关的蛋白激酶同源基因 GhSOS2 [15]和一个棉纤维发
育相关的 GhCPK1基因[16-17]。本研究根据本实验室
旱地棉转录组测序获得的片段, 拟利用电子克隆及
RT-PCR 技术从棉属野生种旱地棉(G. aridum)中克
隆 GarCIPK8 蛋白磷酸激酶基因的 ORF 全长序列,
分析该基因在非生物胁迫下的功能, 为棉花耐盐性
的改良提供新的基因资源。
1 材料与方法
1.1 试验材料及盐处理方法
棉属野生种旱地棉(G. aridum)种子由中国农业
科学院棉花研究所海南岛野生棉种植园提供。将旱
地棉种子播于盆钵中, 待长至约 20 cm 时将小苗从
土中取出, 洗去根上的泥土, 浸在含 200 mmol L–1
NaCl (其中Na+和 Ca2+含量为 15∶1)的营养液中, 分
别处理 0、1、3、6、12、24、36、48和 72 h后, 取
不同时期的根样, 以液氮速冻后于–80℃保存。
1.2 实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)
提取盐处理不同时期旱地棉根总 RNA, 反转录
合成第一链 cDNA, 以第一链 cDNA为模板, 在 ABI
Prism 7500 (美国 ABI公司)上进行 qRT-PCR分析。
以棉花的泛素蛋白基因 UBQ 作为内参基因 [18-19]
(UBQ7-F: 5′-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC-3′
和 UBQ7-R: 5′-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTT
G-3′); 根据转录组测序结果设计 CIPK 相关基因特
异引物 CIPK-qRT-F: 5′-CGAAAGCGTTGCCATGAA
AGTCCTC-3′, CIPK-qRT-R: 5′-GCTTCCGCTTCAC
TAAGACGACCTT-3′。按照 SYBR Premix Ex Taq
(TaKaRa)反应体系进行 PCR 扩增, 每个样品进行 3
次生物学重复, 相对表达量参照 Kenneth 等[20]提出
的公式计算 2–ΔΔCT, 以表示基因表达丰度的变化 ,
ΔΔCT =(CT,target–CT,UBQ)Time x–(CT,target–CT,UBQ)Time 0(式
中 CT 值是指每个反应管内的荧光信号到达设定的
阈值时所经历的循环数, C为 Cycle, T为 threshold,
Time x 为处理的时间点 , Time 0 为处理的零点 ,
CT,target是指目的基因的 CT值, CT,UBQ为内参基因的
CT值)。用 SPSS软件分析结果。
1.3 GarCIPK8的克隆
以本实验室旱地棉转录组测序获得的 CIPK 相
关基因特异序列为探针, 利用电子克隆的方法, 采
用 PLANT EST BLAST 程序(http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/genomes/PLANTS/PlantESTBLAST.shtml)在
线分析获得一系列同源 EST (NP_851258.2、
BAB11035.1、ABF99892.1、AAB65477.1、AAA-
36 作 物 学 报 第 39卷

02840.1、AAB65483.1、AAM13129.1、AAM60822.1、
AAP68289.1)。以 CAP3 Sequence Assembly Program
(http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)拼接以上序列 , 经
基因预测 (http://genes.mit.edu/GENSCAN.html), 然
后用软件 ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
gorf/gorf.html)预测完整开放阅读框(ORF)。
在ORF序列两侧设计上游引物 CIPK-F: 5′-GAT
GGTGGTGAGAAAAGTAGGGAAGTA-3′和下游引
物 CIPK-R: 5′-CAGGTCAACGTCTTTTACTCCTAG
A-3′, 用改良的 CTAB 法提取盐处理的旱地棉叶片
总 RNA 进行 RT-PCR。PCR 扩增程序是, 94℃预变
性 5 min; 94℃变性 30 s, 55℃退火 45 s, 72℃延伸 1
min 30 s, 36个循环; 72℃延伸 10 min; 4℃保温。将
扩增产物回收并连接到 pTG19-T载体, 测序。
1.4 GarCIPK8序列生物信息学分析
利用 DNAMAN (Lynnon Biosoft)软件进行系统
进化树分析、激酶域及 NAF结构域的蛋白序列比对;
利 用 Expasy 软 件 (http://www.expasy.ch/) 对
GarCIPK8蛋白进行氨基酸组成、等电点等理化性质
及亲水性 /疏水性分析 ; 利用 PredictProtein-PHD
(http://www.predictprotein.org/)信息库对蛋白质序列
进行二级结构预测 ; 利用软件 NetPhos2.0 Server
(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)进行蛋白磷
酸化预测。
1.5 农杆菌介导转化烟草及基因的功能鉴定
1.5.1 rd29A启动子的分离 根据 GenBank上公
布的由 Yamaguchi-Shinozaki 和 Shinozaki[21]发表的
RD29A 基因(D13044)的 5端序列, 设计克隆 rd29A
启动子的特异引物 rd29A-P-F (5-CCCAAGCTTGA
TGGAGGAGCCATAGATGC-3′)和 rd29A-P-R (5-
GCTCTAGATTTCCAAAGATTTTTTTCTTTCC-3′),
用 CTAB法[22]提取拟南芥总DNA, 以此为模板进行
PCR 扩增。反应程序为 94 5 min, 94 30 s, 52 ℃ ℃ ℃
30 s, 72 40 s, 30℃ 个循环; 72 7 min, 4℃ ℃保存。用
DNA凝胶回收试剂盒回收纯化。
用 Hind III、Xba I酶切 pCAMBIA2301-CaMV-
35S-rbc 质粒, 切去 CaMV35S 启动子, 回收的大片
段与启动子 rd29A 连接 , 用引物 rd29A-P-F 和
rd29A-P-R PCR 扩增检测与预计结果相符 , 获得
pCAMBIA2301-rd29A-rbc载体质粒。
1.5.2 植物表达载体的构建 分别在 GarCIPK8
基因的上游及下游设计 1 对特异引物(GarCIPK8-F-
BamH I: CGCGGATCCGATGGTGGTGAGAAAAG
TAGGGAAGTA; GarCIPK8-R-Kpn I: GGGGTACC
CAGGTCAACGTCTTTTACTCCTAGA), 并在两端
加上 BamH I和 Kpn I酶切位点(引物中下画线部分),
将目的 cDNA 序列克隆到 pCAMBIA2301 载体上,
构建表达载体 pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK8
和 pCAMBIA2301-rd29A-GarCIPK8。所有效应质粒
均经 PCR、酶切鉴定正确。用热激法将质粒转入农
杆菌菌株 EHA105 感受态细胞中, 获得用于植物转
化实验的工程农杆菌 EHA105 (pCAMBIA2301-
CaMV35S-GarCIPK8)和 EHA105 (pCAMBIA2301-
rd29A-GarCIPK8)。
1.5.3 转基因烟草植株的分子检测 提取在 100
mg L–1 Kan筛选培养基上长势较好的烟草叶片 DNA
为模板, 用特异引物 CIPK-F和 CIPK-R进行 PCR扩
增筛选阳性植株。进一步提取 PCR检测呈阳性植株
的 RNA, 以反转录生成的 cDNA为模板, CIPK-F和
CIPK-R为引物, 进行 RT-PCR扩增。
1.5.4 转基因烟草的抗性试验 选取形态长势基
本一致的野生型植株和转基因 T1代阳性植株, 分成
2份, 一份转接到分别含 0、150和 200 mmol L–1 NaCl
的MS固体培养基上, 另一份转接到分别含 0% PEG
(V/V)、10% PEG和 20% PEG的Hoagland营养液中, 于
(25±2) , ℃ 相对湿度 70%, 每天 16 h光照/8 h黑暗的光
照培养箱培养中生长, 每个处理至少 10株苗。继续培
养 10 d后, 观察转基因烟草和野生型烟草幼苗的生长
情况。盐处理生长过程中, MS平板垂直放置[11,23]。
2 结果与分析
2.1 实时荧光定量 PCR 检测旱地棉 CIPK 相关
基因在盐胁迫诱导下的表达
在前期的研究中 , 我们将旱地棉盐胁迫前后
RNA 混合样品进行了转录组测序, 发现一 CIPK 相
关基因存在较高的转录丰度。为明确此基因是否受
盐胁迫诱导表达, 对该基因在盐胁迫不同时期的旱
地棉根中的表达情况进行 qRT-PCR分析。
qRT-PCR 分析表明该 CIPK 相关基因在根中表
现诱导上调表达(图 1), 处理 1 h基因就开始上调表
达, 到 12 h有所下降, 到 24 h又恢复上调并达到最
大, 约为基础表达水平的 5.5倍, 48 h恢复至基础表
达水平。推测该基因可能参与棉花幼苗对高盐逆境
胁迫的应答, 并可能在棉花耐盐机制上发挥一定的
作用。
第 1期 冯 娟等: 棉属野生种旱地棉蛋白激酶基因 GarCIPK8的克隆与功能分析 37



图 1 以实时荧光定量 PCR法分析盐处理不同时期旱地棉根中
CIPK基因的表达
Fig. 1 Expression of CIPK gene from G. aridum root with
real-time quantitative PCR under NaCl treatment

2.2 GarCIPK8基因的克隆、序列分析及进化分析
根据本实验室旱地棉转录组测序结果获得的与
蛋白激酶相关基因的序列(576 bp)为探针, 利用电
子克隆方法, 在 NCBI中 PLANT EST BLAST软件
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/Plan
t ESTBLAST.shtml)分析后获得一系列同源 EST
(NP_851258.2、BAB11035.1、ABF99892.1、AAB-
65477.1、AAA02840.1、AAB65483.1、AAM13129.1、
AAM60822.1、AAP68289.1), 用 CAP3 Sequence
Assembly Program (http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)
软件将上述序列拼接后, 获得的序列先经基因预测
(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html),然后用软件
ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/
gorf.html)预测, 该序列包含一个 1350 bp 的完整
ORF, 编码 449 个氨基酸。在 ORF 两端设计一对引
物 CIPK-5和 CIPK-3, 以旱地棉 cDNA为模板, 通过
RT-PCR 得到包含整个编码框的 CIPK cDNA 克隆,
全长 1350 bp (图 2)。回收该片段, 克隆至 T-载体中

图 2 GarCIPK8基因 ORF全长的 PCR扩增
Fig. 2 PCR amplification of the full length ORF of GarCIPK8
M: DNA marker; 1: 目的片段。
M: DNA marker; 1: target fragment.
鉴定、测序。测序结果经 BLAST比对, 证明所扩序
列正确 , 与电子克隆序列相比 , 序列相似度为
97.34%。将得到的序列与拟南芥、水稻中所有已知
的 CIPKs 进行氨基酸序列比对和系统进化树分析,
结果显示与该 CIPK 基因亲缘关系最近的是水稻的
OsCIPK8、OsCIPK24组成的分支(图3), 氨基酸序列
相似度最高的是水稻的 OsCIPK8, 为 73.95%。因此
将该基因命名为 GarCIPK8。提交至 GenBank, 获得
登录号为 JX110982。

图 3 旱地棉 GarCIPK8和水稻中部分已知 CIPKs相关蛋白序
列的进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic tree of GarCIPK8 and OsCIPKs based on
amino acid sequence

利用 DNAStar 等软件分析推导, 其编码蛋白大
小为 51.12 kD, 包含 62 个强碱性氨基酸(K 和 R)、
60个强酸性氨基酸(D和 E)、156个疏水氨基酸(A、
I、L、F、W和 V)和 102个极性氨基酸(N、C、Q、
S、T和 Y), 理论等电点为 8.13。NCBI CDS (http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.Cgi)蛋白
保守结构域分析表明, 其 N 端 9~262 位为一个丝氨
酸/苏氨酸激酶结构域, C 端含有一个激酶家族所共
有的保守 NAF结构域(图 4), NAF结构域是 CIPK基
因中特有的与 CBL 互作的结构域, 该结构域位于
CIPK 基因的 C 端 , 含有 24 个氨基酸。利用
DNAMAN等软件, 将 GarCIPK8和已报道的其他植
物中具有逆境胁迫响应功能的 CIPKs进行同源性分
析, 发现保守功能域保守性很强(图 5), 这说明克隆
得到的 GarCIPK8为已报道 CIPK的同源基因。
通过 ProtScale (http://expasy.org/tools/protscale.
html)软件分析氨基酸序列的疏水性, 在 N端及 C端
呈现疏水性 , 中部也呈现较强的疏水性。用
ScanProsite (http//www.expasy.org/cgi.bin)对 GarCIPK8
蛋白序列在数据库中比对进行结构预测, 并结合软
件 NetPhos2.0 Server对 GarCIPK8磷酸化位点进行
预测 , 得出基因的激酶区和调控区有大量的丝氨
酸、苏氨酸和酪氨酸位点, 这是大多数 Ser/Thr/Tyr
蛋白激酶所具有的特征。
2.3 转基因烟草的筛选及 PCR验证
用 Hind III、Xba I 酶切 pCAMBIA2301-
38 作 物 学 报 第 39卷


图 4 GarCIPK8激酶结构示意图
Fig. 4 Schematic diagram of the domain structure of
GarCIPK8

图 5 GarCIPK8和已报道的具有典型逆境胁迫响应功能的
CIPKs的 2个保守功能域
Fig. 5 Two conserved functional domains of GarCIPK8,
OsCIPKs, AtCIPKs and other CIPKs in stress response

CaMV35S-rbc 质粒 , 回收的载体大片段与启动子
rd29A连接, 用引物 rd29A-P-F和 rd29A-P-R PCR扩
增检测与预计结果相符 , 获得 pCAMBIA2301-
rd29A-rbc载体质粒。
将 GarCIPK8目的片段经 Kpn I、BamH I双酶
切后分别与经同样处理的载体质粒 pCAMBIA2301-
CaMV35S-rbc和 pCAMBIA2301-rd29A-rbc连接、转
化, 对转化后经筛选得到的重组质粒 pCAMBIA2301-
CaMV35S-GarCIPK8 和 pCAMBIA2301-rd29A-Gar-
CIPK8用引物 CIPK-F和 CIPK-R进行 PCR扩增, 分
别扩增出 1350 bp的片段, 与预计大小相符; 经测序
分析后, 选出构建正确的表达载体 pCAMBIA2301-
CaMV35S-GarCIPK8 和 pCAMBIA2301-rd29A-Gar-
CIPK8, 用于下一步烟草转化。
经 100 mg L–1Kan的MS培养基上筛选后得到的
T0代转基因烟草, 提取基因组DNA, 进行 PCR验证,
分别获得 19株 pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK8
(图 6)和 11株 pCAMBIA2301-rd29A-GarCIPK8阳性
植株(图 7)。提取 PCR 检测呈阳性的转基因植株的
RNA, 以总 RNA 反转录成的 cDNA 为模板 , 用
GarCIPK8 基因特异性引物 CIPK-F和 CIPK-R 扩增
转基因植株, 获得 7 株转 pCAMBIA2301-CaMV35S-
GarCIPK8阳性植株(图 8)。
rd29A 为逆境胁迫的诱导型启动子, 理论上正
常生长条件下不能启动下游基因的表达。本研究中
我们同样用 GarCIPK8 基因特异性引物 CIPK-F 和
CIPK-R 扩增正常生长条件下的 PCR 阳性的转
pCAMBIA2301-rd29A-GarCIPK8 基因植株, 获得了
4株在 mRNA水平上表达的转基因植株(图 9)。可能
的原因是我们采用的生长条件不能完全排除非逆境
胁迫, 从而导致部分植株正常表达。

图 6 转 pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK8基因烟草的 PCR扩增
Fig. 6 PCR analysis of pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK8 transgenic tobacco plants
M: DNA marker; 1~22: 转基因烟草; –:非转基因烟草; +: 阳性对照 pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK8质粒。
M: DNA marker; 1–22: transgenic tobacco; –: non-transgenic tobacco; +: plasmid pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK8.


图 7 转 pCAMBIA2301-rd29A-GarCIPK8基因的 PCR扩增
Fig. 7 PCR analysis of pCAMBIA2301-rd29A-GarCIPK8
transgenic tobacco plants
M: DNA marker: 1~9: 转基因烟草; –: 非转基因烟草; +: 阳性对
照 pCAMBIA2301-rd29A-GarCIPK8质粒。
M: DNA marker; 1–9: transgenic tobacco; –: non-transgenic
tobacco; +: plasmid pCAMBIA2301-rd29A-GarCIPK8.




图 8 转 pCAMBIA2301-CaMV35S-GarCIPK8基因烟草的
RT-PCR扩增
Fig. 8 RT-PCR analysis of pCAMBIA2301-CaMV35S-
GarCIPK8 transgenic tobacco plants
1~8: 转基因烟草; –: 非转基因烟草。
1–8: transgenic tobacco; –: non-transgenic tobacco plant.
第 1期 冯 娟等: 棉属野生种旱地棉蛋白激酶基因 GarCIPK8的克隆与功能分析 39



图 9 转 pCAMBIA2301-rd29A-GarCIPK8基因的
RT-PCR扩增
Fig. 9 RT-PCR analysis of pCAMBIA2301-rd29A-GarCIPK8
transgenic tobacco plants
1~8: 转基因烟草; –: 非转基因烟草。
1–8: transgenic tobacco; –: non-transgenic tobacco plant.

2.4 转基因烟草的抗性鉴定
将 RT-PCR阳性的 T0代植株的种子及野生型种
子分别播种在 1/2 MS (25 mg L–1 Kan)和 1/2 MS培
养基上。选取卡那抗性的 T1代转基因植株及野生型
植株进行盐胁迫处理, 调查其生长情况及根长, 结
果发现在 MS 培养基上, T1代转基因株系与野生型
的主根长没有显著差异, 在含 150 mmol L–1 NaCl和
200 mmol L–1 NaCl的 MS培养基上, 野生型植株表
现出盐胁迫伤害且较转基因植株明显黄化, 主根长
明显比转基因幼苗短 , 侧根也较稀少(图 10)。统计
分析表明, 转基因株系的主根长显著高于野生型的主
根长(图 11), 而且 rd29A-GarCIPK8 转基因植株和
CaMV35S-GarCIPK8转基因植株主根长无明显差异。
PEG6000 模拟干旱处理条件下, 转基因株系与
野生型对照在含 10%PEG的营养液中生长均受到抑
制, 但转基因植株与野生型植株没有显著差异; 在
含 20%PEG的营养液中野生型植株叶片出现严重萎
焉、皱缩, rd29A-GarCIPK8转基因植株也出现萎焉,
而 CaMV35S-GarCIPK8 转基因植株生长较正常(图
12)。

图 10 盐胁迫下野生型和转基因烟草幼苗表型
Fig. 10 Phenotype of GarCIPK8 transgenic tobacco plants under salt stress



图 11 不同浓度 NaCl处理的野生型和转基因株系主根长统计
分析
Fig. 11 The statistic analysis of root length in wild type and
transgenic plants under different concentrations of NaCl
图柱上方不同大写和小写字母分别表示在 P<0.01和 P<0.05水平
上的差异显著性。
Bars with different capitals or lowercases are significantly different
at P<0.01 and P<0.05, respectively.
3 讨论
CIPK 蛋白激酶广泛存在于植物中, 在植物应
答逆境胁迫途径中起着重要作用, 它可以与其上游
的一个或多个 CBL蛋白互作形成 CBL-CIPK途径转
导特异的钙信号, 参与多条 CBL-CIPK 信号途径,
是一个信号途径交叉点, 在植物特定的生长发育和
响应多种逆境胁迫中起重要作用[24-25]。自 1998年拟
南芥中首次报道 CBL-CIPK 途径以来, 目前已在多
种作物中报道, 在拟南芥、水稻、玉米等植物中的
研究已证明 CIPK 类基因在抗逆性等非生物胁迫中
有重要作用[26-29], 且报道了在拟南芥、水稻等作物
中 CBL-CIPK 信号途径应答盐逆境胁迫[30-31]。在拟
南芥中 SOS2 (AtCIPK24)与 SOS3 (CBL)相互作用激
活 SOS1 (一种 Na+/H+逆转运体)来调控作物的耐盐
能力[32]。拟南芥的AtCIPK3蛋白激酶基因与AtCBL1/
AtCBL9互作能够提高钾离子的吸收, 在耐低钾胁迫
上起重要作用[33]。水稻的 OsCIPK24 和 OsCBL4 协
调互作, 在酵母细胞中激活 OsSOS1, 以形成异源
40 作 物 学 报 第 39卷


图 12 转基因植株和野生型植株在 PEG干旱胁迫下的表型特征
Fig. 12 Phenotypic characteristics of wild type and transgenic plants under PEG drought stress

蛋白激酶模块激活 OsSOS1 和 AtSOS1, 抑制 SOS2
和 SOS3 拟南芥突变体的盐敏感性[14]。本研究克隆
到的 GarCIPK8 基因经系统进化分析表明与水稻
OsCIPK8 和 OsCIPK24 亲缘关系最近, 推测为其同
源基因。OsCIPK8 在盐胁迫下, 叶片中的表达量增
加, 而 OsCIPK24分别在盐、干旱及 ABA处理的叶
片中表达量均增加, 说明 OsCIPK24 受多种非生物
胁迫诱导[11,34]。本研究克隆的 GarCIPK8 基因受盐
胁迫诱导表达, 转基因试验表明 GarCIPK8 基因可
明显提高烟草的耐盐、耐旱性, 推测 GarCIPK8基因
与 OsCIPK8、OsCIPK24 基因在非生物胁迫中可能
存在相同的抗逆机制。
棉花中有关 CIPK 基因报道较少, 李付振等[15]
在陆地棉中报道了一个盐胁迫蛋白激酶基因
GhSOS2, 该基因成熟 mRNA 由于选择性剪接而存
在 2 种相差一个外显子的剪接体 GhSOS2a 和
GhSOS2b, 分别编码 445 个和 421 个氨基酸残基 ,
GhSOS2b在盐胁迫条件下的根茎组织、叶组织表达,
且表达量远高于 GhSOS2a, GhSOS2b 参与棉花的质
膜 Na＋/H＋逆向转运蛋白途径并发挥一定作用; Gao
等[16]和Huang等[17]鉴定了与棉纤维发育相关的基因
GarCIPK1。本研究克隆的 GarCIPK8基因的氨基酸
序列分析表明是一个 Ser/Thr/Tyr 蛋白激酶基因, 与
GhSOS2 两种剪接体 GhSOS2a 和 GhSOS2b 及
GhCPK1 的核苷酸序列相似性分别为 66.00%、
62.32%和 36.20%, 氨基酸序列相似性为 64.30%、
59.42% 和 18.54%, 且 不 存 在 内 含 子 , 因 此
GarCIPK8为一新基因。
为了研究 GarCIPK8 基因在植物逆境胁迫中的
作用, 将 GarCIPK8 完整的 ORF 序列分别与组成型
启动子 CaMV35S 及拟南芥逆境诱导型启动子
rd29A构建成 2个植物表达载体, 利用农杆菌介导的
叶盘法转化烟草, 获得了 PCR 和 RT-PCR 阳性的转
基因烟草。CaMV35S启动子应用很广, 但它使外源
基因产物在植物生长发育的不同时期以及不同器官
中都表达, 造成植物生长发育的不利影响, 会产生
转基因植物比野生型生长缓慢、植株变小、产量下
降等不良农艺性状[35-36]。rd29A 属胁迫诱导型启动
子 , 转基因植物在正常情况下不表达或表达较弱 ,
而在逆境胁迫下 rd29A 启动子能强烈启动下游目的
基因的表达, 且不会对转基因植株的生长发育产生
大的影响[37-38]。Kasuga 等[39]用 rd29A 启动子代替
CaMV35S 来启动 DREB1A 基因在拟南芥中表达的
研究, 发现转基因植株生长发育受到的影响十分轻
微, 种子产量与野生型对照植株相似。本研究同样
发现, 转 rd29A-GarCIPK8 T0代烟草与非转基因植
株相比对生长发育的抑制较轻 , 而 CaMV35S-
GarCIPK8 T0代烟草植株矮小, 发育延迟(数据未显
示)。rd29A 启动子驱动拟南芥 AtNHX1 基因在烟草
中表达的研究表明 , 非盐逆境下转基因植株
AtNHX1 基因的 mRNA 转录量非常微弱, 而在盐逆
境下 , 该启动子即可驱动 AtNHX1 基因大量转录 ,
且转基因植株抗盐能力明显增强[40]。本研究对正常
生长条件下的 T0代转基因植株的 RT-PCR检测发现
两种不同启动子驱动下的转基因植株都能表达, 可
能的原因是植株的生长环境不能完全控制在非胁迫
条件下。T1 代转基因植株的耐盐试验表明, 在盐胁
迫下 rd29A-GarCIPK8 转基因植株和 CaMV35S-
GarCIPK8 转基因植株均表现出了一定的耐盐性 ,
且二者的主根长无明显差异。高浓度 PEG 处理下
CaMV35S-GarCIPK8 转基因植株生长正常, 野生型
植株出现严重的萎焉, 而 rd29A-GarCIPK8 转基因
植株也表现一定程度的萎焉, 说明本研究中 rd29A
与 CaMV35S启动下游基因的表达量存在差异。
本试验通过对转基因烟草植株的表型观察初步
研究了 GarCIPK8 在高盐和干旱胁迫下的抗逆性,
第 1期 冯 娟等: 棉属野生种旱地棉蛋白激酶基因 GarCIPK8的克隆与功能分析 41


证明 GarCIPK8 基因可能参与高盐和干旱在内的多
种逆境胁迫信号途径, 而 GarCIPK8 基因对转基因
植株生理、生化特性的改变以及这些生理、生化指
标与抗逆性的关系及 GarCIPK8 编码蛋白在胁迫信
号转导途径中的作用还需进一步研究。
4 结论
从旱地棉中分离得到一个 CIPK 新基因
GarCIPK8, 为典型的 Ser/Thr/Tyr蛋白激酶基因, 氨
基酸序列与水稻的 OsCIPK8存在 73.95%的同源性。
表达受NaCl诱导, 参与植物对盐、干旱胁迫的应答。
References
[1] Zhu J K. Salt and drought stress signal transduction in plants.
Annu Rev Plant Biol, 2002, 53: 247–273
[2] Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Transcriptional regula-
tory networks in cellular responses and tolerance to dehydration
and cold stresses. Annu Rev Plant Biol, 2006, 57: 781–803
[3] Albrecht V, Weinl S, Blazevic D, D’Angelo C, Batistic O, Kolu-
kisaoglu U, Bock R, Schulz B, Harter K, Kudla J. The calcium
sensor CBL1 integrates plant responses to abiotic stresses. Plant
J, 2003, 36: 457–470
[4] Sanders D, Brownlee C, Harper J F. Communicating with cal-
cium. Plant Cell, 1999, 11: 691–70
[5] Kolukisaoglu U, Weinl S, Blazevie D, Batistie O, Kudla J.
Caleium sensors and their interacting protein kinases: genomics
of the Arabidopsis and rice CBL-CIPK signaling networks. Plant
Physiol, 2004, 134: 43–58
[6] Batistic O, Kudla J. Plant calcineurin B-like proteins and their
interacting protein kinases. Biochim Biophy Acta, 2009, 1793:
985–992
[7] Luan S. The CBL-CIPK network in plant calcium signaling.
Trends Plant Sci, 2009, 14: 37–42
[8] Batistic O, Kudla J. Intergration and channeling of calcium sig-
naling through the CBL calcium sensor/CIPK protein kinase
network. Planta, 2004, 219: 915–924
[9] Albrecht V, Ritz O, Linder S, Harter K, Kudla J. The NAF domain
defines a novel protein-protein interaction module conserved in
Ca2+-regulated kinases. EMBO J, 2001, 20: 1051–1063
[10] Yu Y, Xia X, Yin W, Zhang H. Comparative genomic analysis of
CIPK gene family in Arabidopsis and Populus. Plant Growth
Regul, 2007, 52: 101–110
[11] Xiang Y, Huang Y, Xiong L. Characterization of stress-respon-
sive CIPK genes in rice for stress tolerance improvement. Plant
Physiol, 2007, 144: 1416–1428
[12] Li L, Kim B G, Cheong Y H, Pandey G K, Luan S. A Ca2+ sig-
naling pathway regulates a K+ channel for low-K response in
Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2006, 103: 12625–12630
[13] Mahajan S, Sopory S, Tuteja N. Cloning and characterization of
CBL-CIPK signaling components from a legume (Pisum sati-
vum). FEBS J, 2006, 273: 907–925
[14] Martinez-Atienza J, Jiang X Y, Garciadeblas B, Mendoza I, Zhu
J K, Pardo J M, Quintero F J. Conservation of the salt overly
sensitive pathway in rice. Plant Physiol, 2007, 143: 1001–1012
[15] Li F-Z(李付振), Qiu X-M(邱新棉), Wang M-X(王美兴), Liu
C-L(刘传亮). Molecular cloning and expression analysis of two
splice forms of the protein phosphorylation homologous gene
(GhSOS2) during the salt stress pathway in cotton. Sci Agric Sin
(中国农业科学), 2010, 43(21): 4341–4348 (in Chinese with
English abstract)
[16] Gao P, Zhao P M, Wang J, Wang H Y, Wu X M, Xia G X. Iden-
tification of genes preferentially expressed in cotton fibers: a
possible role of calcium signaling in cotton fiber elongation.
Plant Sci, 2007, 173: 61–69
[17] Huang Q S, Wang H Y, Gao P, Wang G Y, Xia G X. Cloning
and characterization of a calcium dependent protein kinase gene
associated with cotton fiber development. Plant Cell Rep, 2008,
27: 1869–1875
[18] Tu Y-L(涂礼莉), Zhang X-L(张献龙), Liu D-Q(刘迪秋), Jin
S-X(金双侠), Cao J-L(曹景林), Zhu L-F(朱龙付), Deng F-L(邓
锋林), Tan J-F(谭家富), Zhang C-B(张存斌). Reference gene
selection in cotton fiber development and somatic embryogenesis
process in real-time quantitative reverse transcription PCR. Chin
Sci Bull (科学通报), 2007, 52(20): 2379–2380 (in Chinese)
[19] Hu R-B(胡瑞波), Fan C-M(范成明), Fu Y-F(傅永福). Reference
gene selection in plant real-time quantitative reverse transcription
PCR (qRT-PCR). J Agric Sci Technol (中国农业科技导报),
2009, 11(6): 30–36 (in Chinese with English abstract)
[20] Kenneth J, Thomas D. Analysis of relative gene expression data
using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCT method. Methods,
2001, 25: 402–408
[21] Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K. Characterization of the
expression of a desiccation responsive rd29A gene of Arabidop-
sis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants. Mol
Genet Genom, 1993, 236: 331–340
[22] Wang G-L(王关林), Fang H-J(方宏筠). Plant Genetic Engineer-
ing Principle and Technique (植物基因工程原理). Beijing: Sci-
ence Press, 2002. pp 428–432 (in Chinese)
[23] Zhao J F, Sun Z F, Zheng J, Dong X Y, Huai J L, Gou M Y, He J
42 作 物 学 报 第 39卷

G, Jin Y S, Wang J H. Cloning and characterization of a novel
CBL-interacting protein kinase from maize. Plant Mol Biol, 2009,
69: 661–674
[24] Quintero F J, Ohta M, Shi H, Zhu J K, Pardo J M. Reconstitution
in yeast of the Arabidopsis SOS signaling pathway for Na+ ho-
meostasis. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99: 9061–9066
[25] Li R, Zhang J, Wei J, Wang H, Wang Y, Ma R. Functions and
mechanisms of the CBL-CIPK signaling system in plant response
to abiotic stress. Prog Nat Sci, 2009, 19: 667–676
[26] Sanders D, Pelloux J, Brownlee C, Harper J F. Calcium at the
cross-roads of signaling. Plant Cell, 2002 , 14: 401–417
[27] Kudla J, Xu Q, Harter K, Gruissem W, Luan S. Genes for cal-
eineurin B-like proteins in Arabidopsis are differentially regulated
by stress signals. Proc Natl Acad Sci USA, 1999, 96: 4718–4723
[28] Kim B G, Waadt R, Cheong Y H, Pandey G K, Jose R, Doming-
guez-Solis, Schultke S, Lee S C, Kudla J, Luan S. The caleium-
sensor CBL10 mediates salt tolerance by regulating ion homeo-
stasis in Arabidopsis. Plant J, 2007, 52: 473–484
[29] Pandey G K, Cheong Y H, Kim K N, Grant J J, Li L, Hung W,
D’Angelo C, Weinl S, Kudla J, Luan S. The Calcium sensor
calcineurin B-Like 9 modulates abscisic acid aensitivity and
biosynthesis in Arabidopsis. Plant Cell, 2004, 16: 1912–1924
[30] Cheng N H, Pittman J K, Zhu J K, Hirschi K D. The protein
kinase SOS2 activates the Arabidopsis H+/Ca2+ antiporter CAX1
to integrate calcium transport and salt tolerance. J Biol Chem,
2004, 279: 2922–2926
[31] Guo Y, Halfter U, Ishitani M, Zhu J K. Molecular characteriza-
tion of functional domains in the protein kinase SOS2 that is re-
quired for plant salt tolerance. Plant Cell, 2001, 1383–1400
[32] Qiu Q S, Guo Y, Dietrich M A, Schumaker K S, Zhu J K. Regu-
lation of SOS1, a plasma membrane Na+/H+ exchanger in Arabi-
dopsis thaliana by SOS2 and SOS3. Proc Natl Acad Sci USA,
2002, 99: 8436–8441
[33] Xu J, Li H D, Chen L Q, Wang Y, Liu L L, He L, Wu W H. A
protein kinase, interacting with two calcineurin B-like proteins,
regulates K+ transporter AKT1 in Arabidopsis. Cell, 2006, 125:
1347–1360
[34] Chen X-F(陈析丰), Gu Z-M(顾志敏), Liu F(刘峰), Ma B-J(马伯
军), Zhang H-S(张红生). Molecular analysis of rice CIPKs in-
volved in biotic and abiotic stress responses. Chin J Rice Sci,
2010, 24: 567–574 (in Chinese with English abstract)
[35] Gilmour S J, Sebolt A M, Salazar M P, Everard J D, Thomashow
M F. Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcriptional ac-
tivator mimics multiple biochemical changes associated with
cold acclimation. Plant Physiol, 2000, 124: 1854–1865
[36] Jaglo-Ottosen K R, Gilmour S J, Zarka D G, Schabenberger O,
Thomashow M F. Arabidopsis CBF1 overexpression induces
COR genes and enhances freezing tolerance. Science, 1998, 280:
104–106
[37] Li X-L(李新玲), Yang C-P(杨传平), Qu M(曲敏), Xu X-L(徐香
玲). Study on cloning of rd29A promoter and enhancing stress
tolerance of tobacco. Mol Plant Breed, 2007, 5: 37–42 (in Chi-
nese with English abstract)
[38] Bai B(白斌), Zhang J-W(张金文), Guo Z-H(郭志鸿), Chen
Z-H(陈正华). Cloning cold-induced promoter rd29A and its re-
sponsibility to low temperature. J Gansu Agric Univ (甘肃农业
大学学报), 2004, 39(3): 249–254 (in Chinese with English ab-
stract)
[39] Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki
K. Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene
transfer of a single stress inducible transcription factor. Nat Bio-
tech, 1999, 17: 287–291
[40] Zhang J-L(张俊莲), Wang L(王丽), Qin S-H(秦舒浩), Si H-J(司
怀军), Liu Y-H(刘玉汇), Wang D(王蒂). The AtNHX1 Gene
driven by stress-inducible rd29A promoter from Arabidopsis
thaliana can increase tobacco saline tolerance. J Agric Biotech-
nol (农业生物技术学报), 2011, 9(4): 669–676 (in Chinese with
English abstract)