全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(12): 18021809 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31371645), 国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2011CB109305), 教育部长江学者和创新团队
发展计划项目(PCSIRT13073), 教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-12-0891), 农业部大豆生物学与遗传育种创新团队项目和
江苏省双创计划项目资助。
This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31371645), the National Key Basic Research Project
(2011CB109305), Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University of Ministry of Education of China
(PCSIRT13073), Program for New Century Excellent Talents in University of Ministry of Education of China (NCET-12-0891), Program for
Soybean Biology and Genetic Breeding Innovative Research Team of Ministry of Agriculture of China, and Program for High-level Innova-
tive and Entrepreneurial Talents in Jiangsu Province.
* 通讯作者(Corresponding authors): 李艳, E-mail: yanli1@njau.edu.cn; 盖钧镒, E-mail: sir@njau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: cyahui616@163.com, Tel: 13675121345
Received(收稿日期): 2015-04-01; Accepted(接受日期): 2015-07-20; Published online(网络出版日期): 2015-08-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150828.0915.002.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.01802
大豆耐铝毒候选基因 GmSTOP1的克隆与表达分析
丛亚辉 王婷婷 柳聚阁 王 宁 高萌萌 李 艳* 盖钧镒*
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 / 国家大豆改良中心 / 农业部大豆生物学与遗传育种重点实验室 , 江苏南京
210095
摘 要: 酸性土壤中的铝毒害是限制作物生长和产量的主要因素之一。拟南芥中的 AtSTOP1 (Arabidopsis thaliana
sensitive to proton rhizotoxicity 1)是一个调控多种铝毒耐受机制相关基因表达的转录因子, 在拟南芥耐铝毒中发挥重
要作用。为研究大豆中 STOP1-like 基因的表达特性, 本研究利用 RT-PCR 从耐铝毒大豆品种科丰 1 号中克隆了一个
位于第 16 染色体的 STOP1-like 基因, 命名为 GmSTOP1。该基因的编码区(coding DNA sequence, CDS)序列长度为
1566 bp, 编码 521个氨基酸。在 GmSTOP1起始密码子上游 1500 bp的核苷酸序列区间预测到多种顺式作用元件, 包
括与激素、热、逆境响应等相关的应答元件, 如 ABRE、HSE、TC-rich重复序列等。蛋白质结构预测表明 GmSTOP1
不具有跨膜结构和信号肽, 含有 4个保守的 Cys-2-His-2 锌指蛋白结构域。系统进化分析显示 GmSTOP1 与菜豆
(Phaseolus vulgaris)中的 STOP1-like 蛋白亲缘关系较近。亚细胞定位结果显示 GmSTOP1 定位于细胞核 , 说明
GmSTOP1蛋白可能在细胞核中发挥其功能。GmSTOP1基因在种子中的相对表达量最高, 在根、茎尖分生组织、茎、
叶、花、荚等多种组织中也均有表达。用 25 μmol L–1 AlCl3溶液处理大豆幼苗, GmSTOP1基因在根中上调表达, 24 h
达到最高相对表达量, 约为对照(0 μmol L–1 AlCl3)的 9.2倍, 表明该基因的表达受铝离子的诱导。此外, ABA、NaCl
和 PEG 等胁迫也能诱导大豆根和叶中 GmSTOP1 基因的上调表达。由此推测 GmSTOP1 基因可能参与大豆对铝毒、
高盐和渗透等非生物胁迫的应答过程。
关键词: 酸性土壤; 铝毒; 大豆; STOP1; 亚细胞定位; 荧光定量 PCR
Cloning and Expression Analysis of Tolerance to Aluminum-toxicity Candidate
Gene GmSTOP1 in Soybean
CONG Ya-Hui, WANG Ting-Ting, LIU Ju-Ge, WANG Ning, GAO Meng-Meng, LI Yan*, and GAI Jun-Yi*
National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement / National Center for Soybean Improvement / Key Laboratory for Biology
and Genetic Improvement of Soybean (General), Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Aluminum toxicity is one of the major factors that limits the growth and production of crops in acid soils. AtSTOP1
transcription factor can regulate the expression of genes related to aluminum-toxicity tolerance mechanisms, which plays an im-
portant role in aluminum-toxicity tolerance in Arabidopsis. To study the expression features of the STOP1-like gene in soybean,
we cloned a STOP1 gene located on chromosome 16 from the aluminum-toxicity tolerant soybean cultivar (Kefeng-1) using
RT-PCR, and designated as GmSTOP1. The length of GmSTOP1 coding DNA sequence was 1566 bp, which encoded 521 amino
acid residues. Diverse cis-acting promoter elements involved in hormone, heat and stress responses were discovered in the 1500
第 12期 丛亚辉等: 大豆耐铝毒候选基因 GmSTOP1的克隆与表达分析 1803


bp upstream region of GmSTOP1, such as ABRE, HSE, TC-rich repeats, and other elements. Protein structure prediction showed
that it did not have any signal-peptide or transmembrane region, but contained four conservative Cys-2-His-2 zinc-finger domains.
Phylogenetic analysis demonstrated that GmSTOP1 was similar to the putative STOP1-like protein from Phaseolus vulgaris. Re-
sults of subcellular localization showed that GmSTOP1 protein is located in the cell nucleus. The transcripts of GmSTOP1 were
detected in all organs tested including root, shoot apical meristem, stem, leaf, flower, pod and seed, with the highest level in seed.
GmSTOP1 was up-regulated in soybean roots by 25 μmol L–1 AlCl3 treatment, and reached the highest relative expression level at
24 hours, which was about 9.2 times of the level in control (0 μmol L–1 AlCl3). In addition, Real-time PCR analysis showed that
the expression of GmSTOP1 in soybean leaf and root was also up-regulated by ABA, NaCl, and PEG, respectively. These results
indicated that GmSTOP1 might participate in soybean response to abiotic stresses including aluminum-toxicity, high salinity and
osmosis stress, which provides the basis for further studying the functions of GmSTOP1.
Keywords: Acid soil; Aluminum toxicity; Soybean; STOP1; Subcellular location; Real-time PCR
大豆作为优质蛋白质食品和植物油的重要来源,
一直是世界各国不容忽视的作物之一[1]。中国是大
豆的发源地, 我国南方大豆产区地域辽阔, 自然条
件优越, 是我国大豆的主要产区之一。我国长江以
南热带、亚热带地区主要为红色或黄色的酸性土壤,
总面积达 1.28 亿公顷, 占全国土地总面积的 22.7%,
占全国耕地面积的 28%[2]。酸性土壤中活性 A13+产
生的铝毒害会显著抑制植物的根系生长, 进而抑制
地上部分的生长, 是限制作物生长和产量的主要因
素之一[3-4]。近年来随着酸雨发生频率变高及酸性和
生理酸性肥料的大量施用, 使得土壤酸度进一步加
剧 [5], 铝毒害已经成为南方酸性土壤中大豆生长发
育的重要限制因素[6-7]。因此, 在降低土壤酸度的同
时, 挖掘大豆自身的耐铝毒潜力和耐铝毒基因, 获
得耐铝毒能力强的大豆品种是解决酸性土壤中铝毒
害最有效的方法[4]。
随着基因组学、蛋白质组学和生物信息学的发
展, 人们进行了大量关于植物抵御铝毒害的生理机
制研究, 并且逐渐向分子水平深入。Iuchi等[8-9]发现
对根际 H+毒害敏感的拟南芥 stop1突变体对 Al3+也
极敏感 , 这一现象是一个含有4个锌指蛋白结构域
的 C2H2型锌指蛋白转录因子 STOP1 (sensitive to
proton rhizotoxicity 1)的功能受到抑制所致。在拟南
芥 stop1突变体中 , 编码铝诱导的苹果酸通道蛋白
AtALMT1 (aluminum-activated malate transporter
1)[10]的基因表达及苹果酸分泌受到抑制[8]。在拟南
芥 STOP1-KO 突变体中, 不仅与耐铝毒相关的柠檬
酸分泌通道蛋白 AtMATE (multidrug and toxic com-
pound extrusion)[11]基因和 ABC 通道蛋白 ALS3[12]
(aluminum sensitive 3)基因的表达受到抑制, 而且与
H+毒害耐受机制相关基因的表达和柠檬酸的分泌也
会被抑制[13-14]。由此可见, STOP1基因是通过调控铝
毒耐受机制和 H+毒害耐受机制相关基因的表达, 使
植物具有对铝毒和 H+毒害的耐性。随后, Yamaji等[15]
通过突变体分析在水稻中发现一个与 STOP1类似的
锌指蛋白基因 OsART1 (Oryza sativa aluminum re-
sistance transcription factor 1), 它可调控30多种耐
铝毒基因的表达, 增强水稻对铝毒的抗性。Ohyama
等 [16]利用 RNAi 技术沉默 NtSTOP1基因后发现烟草
(Nicotiana tabacum)根对铝毒和 H+毒害的耐性、铝胁
迫下的根部柠檬酸分泌量、ALS3等耐铝毒相关基因
的表达均受到抑制; 将百脉根(Lotus japonicas)、小
立碗藓 (Physcomitrella patens)、野茶树 (Camellia
sinensis)、黑杨(Populus nigra)中的 STOP1-like基因
分别转入拟南芥突变体 stop1中过表达 , 都能激活
AtALMT1、AtMATE 和 ALS3等基因恢复表达, 但不
同物种 STOP1同源基因的激活能力有很大差别。
Sawaki 等[17]在桉树(Eucalyptus robusta)中也克隆了
调控耐铝相关基因的 STOP1-like蛋白基因。
综上所述, 多个物种中与 AtSTOP1 同源的基因
都可通过调控耐铝毒基因的表达提高植物对铝毒害
的耐性, 而在大豆中还未见有关 STOP1-like 基因的
克隆和表达分析的报道。本研究根据已经报道的拟
南芥 AtSTOP1 序列, 通过 RT-PCR 从耐铝毒大豆品
种科丰 1号中克隆到一个位于第 16染色体的 STOP1-
like基因(Glyma16g27280), 命名为 GmSTOP1。利用生
物信息学分析该基因及其上游启动子序列, 并通过
实时定量 PCR分析其在不同组织、铝胁迫及几种常
见的非生物胁迫下的表达特性, 以期为进一步揭示
GmSTOP1基因的功能、利用大豆耐铝毒基因来提高
大豆耐铝毒的能力提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料及胁迫处理
耐铝毒大豆品种科丰 1 号由南京农业大学国家
大豆改良中心种质库提供。将种子播于洁净河沙内,
置于人工气候箱(16 h光/8 h暗, 28℃白天/25℃夜间,
相对湿度为 70%)内, 待萌发后子叶刚刚变绿(4 d),
1804 作 物 学 报 第 41卷

移栽至 1/2 Hoagland 营养液(pH 5.8)的水培体系中,
10 d后将幼苗转移至添加 100 μmol L–1 ABA、200
mmol L–1 NaCl或 20% PEG-6000的营养液中进行处
理。分别于 0、3、6、12、24、48和 72 h对叶和根
取样。将沙培 3 d后幼苗转移至 0.5 mmol L–1 CaCl2
溶液(pH 4.3)适应 24 h, 以 25 μmol L–1 AlCl3 (pH 4.3)
处理 6、12、24、48 和 72 h, 取根尖作为样品。以
未经处理正常生长的幼苗作为对照。样品迅速保存
于液氮备用。每个处理 3次生物学重复。
1.2 总 RNA提取和 cDNA合成
参照离心柱型植物总 RNA 快速提取试剂盒
(TIANGEN, 北京)说明书提取叶片和根的总 RNA。
使用 TaKaRa 公司的 PrimeScript 1st Strand cDNA
Synthesis Kit试剂盒, 参照说明书反转录合成 cDNA
第 1链。
1.3 GmSTOP1全长 cDNA克隆与生物信息学分析
1.3.1 大豆 GmSTOP1 基因的克隆 利用已报道
的拟南芥 AtSTOP1蛋白序列, 在 Phytozome大豆基
因组数据库中进行 BlastP 搜索, 获得大豆同源基因
Glyma16g27280的 cDNA及氨基酸序列。根据 cDNA
序列用 Premier 5.0设计引物(表 1)并合成。用高保真
酶 PrimeSRAR HS DNA Polymerase 进行基因扩增,
切胶回收目的条带 (琼脂糖凝胶回收试剂盒购自
Axygen 公司), 与 pMD19-T Vector 连接, 转化大肠
杆菌感受态细胞, 挑取阳性克隆由上海英潍捷基生
物技术公司测序。

表 1 试验所用引物
Table 1 Primers used in this study
名称
Name
引物序列
Primer sequence (5–3)
用途
Function
GmSTOP1-F ATGGATTCAAATGGGAGCCTAC GmSTOP1基因克隆 Gene cloning of GmSTOP1
GmSTOP1-R TTATAAAAGATTGTCAGAACTAGATTCTCC GmSTOP1基因克隆 Gene cloning of GmSTOP1
qRT-GmSTOP1-F CCTTGCTCCTCATACCCATTTCTG GmSTOP1荧光定量 qRT-PCR of GmSTOP1
qRT-GmSTOP1-R CCTCTTGATAGGCTTTGGTGATGC GmSTOP1荧光定量 qRT-PCR of GmSTOP1
qRT-ACT11-F CGGTGGTTCTATCTTGGCATC 荧光定量内参基因 Reference gene in qRT-PCR
qRT-ACT11-R GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA 荧光定量内参基因 Reference gene in qRT-PCR
qRT-60s-F AAAGTGGACCAAGGCATATCGTCG 荧光定量内参基因 Reference gene in qRT-PCR
qRT-60s-R TCAGGACATTCTCCGCAAGATTCC 荧光定量内参基因 Reference gene in qRT-PCR
GmSTOP1-GFP-F ACGCGTCGACATGGATTCAAATGGGAGCCTAC 亚细胞定位 Subcellular localization
GmSTOP1-GFP-R CGCGGATCCTAAAAGATTGTCAGAACTAGATTCTCCTC 亚细胞定位 Subcellular localization
下画线部分表示酶切位点。Restriction sites are underlined.

1.3.2 GmSTOP1 生物信息学分析 用 ProtParam
(http://web.expasy.org/protparam/)预测蛋白质分子量
和理论等电点 ; 用 TMHMM (http://www.cbs.dtu.
dk/services/TMHMM-2.0/)分析蛋白跨膜结构域 ; 运
用 SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)
进行信号肽分析; 利用 SOPMA 软件预测其二级结
构; 利用 SoyKB搜索 GmSTOP1基因的启动子序列,
并通过 PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.
be/webtools/plantcare/html/)在线网站进行启动子元
件分析; 用 SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/
smart/show_motifs.pl/) 进 行 保 守 域 分 析 ; 用
DNAMAN进行多序列氨基酸比对; 用MEGA 5.0软
件中的邻近相连法构建系统进化树 ; 用 WOLF
PSORT (http://wolfpsort.org/)进行亚细胞定位预测。
1.4 GmSTOP1蛋白的亚细胞定位
1.4.1 载体的构建 以 GmSTOP1-GFP-F/GmSTOP1-
GFP-R 为引物(表 1), 扩增 GmSTOP1 基因, 切胶回
收扩增产物, 用 Sal I 和 BamH I 酶切扩增产物和
pJIT166-GFP 质粒(国家大豆改良中心保存); 最后,
把酶切回收的 PCR 产物和质粒酶切片段连接, 构建
载体 pJIT166-GmSTOP1-GFP, 转入大肠杆菌 DH5α,
然后进行菌液 PCR、酶切筛选阳性克隆, 并对阳性
克隆进行测序验证。
1.4.2 拟南芥原生质体制备和 pJIT166-GmSTOP1-
GFP转化 根据 Yoo等[18]方法制备和转化拟南芥
原生质体。使用 Axygen无内毒素大提质粒试剂盒制
备质粒。在 23℃培养转化后原生质体 15 h, 用激光
共聚焦显微镜(Leica TCS SP2)检测 GFP信号。GFP
第 12期 丛亚辉等: 大豆耐铝毒候选基因 GmSTOP1的克隆与表达分析 1805


的激发波长 488 nm。为观测叶绿体荧光, 同时使用
488 nm激发波长进行双通道观测, 检测的发射波长
分别为 514 nm和 633 nm。
1.5 GmSTOP1的荧光定量 PCR表达分析
参照 SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real-time)
的操作说明书进行荧光定量 PCR 分析(引物序列如
表 1)。以大豆 ACT11基因作为内参基因, 对 GmSTOP1
基因在不同组织和铝毒胁迫下的表达进行荧光定量
分析。对 ABA、NaCl 和 PEG 胁迫下 GmSTOP1 基
因的表达 , 以大豆 60S[19]作为内参基因进行
qRT-PCR。所有样品均进行 3 次技术重复。反应结
束后分析荧光值变化曲线和熔解曲线, 采用 2–ΔΔCT
法[20]计算相对表达量, 绘图并计算 3 次生物学重复
数据的标准误。
2 结果与分析
2.1 GmSTOP1基因的克隆及生物信息学分析
2.1.1 GmSTOP1全长 cDNA 克隆与序列分析 克
隆得到的 GmSTOP1序列与数据库中 Glyma16 g27280
的 CDS序列完全一致。序列分析表明, GmSTOP1基
因的 ORF (open reading frame)全长1566 bp, 编码
521个氨基酸残基 , 预测分子量为57.5 kD, 理论等
电点为5.82。以 TMHMM 软件预测 GmSTOP1不具
有跨膜结构, SignalP 预测结果显示 GmSTOP1没有
信号肽。二级结构预测结果显示 α-螺旋占18.04%, β-
转角占 9.98%, 延伸链占 15.36%, 无规则卷曲占
56.62%。
2.1.2 GmSTOP1 基因的上游启动子分析 对位
于 GmSTOP1基因起始密码子 ATG的 5区上游 1500
bp 的启动子核苷酸序列进行分析, 预测到多种顺式
作用元件(表 2), 包括与光响应、激素响应、热响应、
逆境响应、细胞周期、代谢调节及器官发育等相关
的元件。
2.1.3 GmSTOP1 蛋白的结构域分析和系统进化分
析 将 GmSTOP1 蛋白序列与已报道的几个物种
的 STOP1-like 蛋白进行多重序列比对, 发现含有 4
个与 AtSTOP1 等 STOP-like 蛋白高度同源的
Cys-2-His-2 锌指蛋白结构域(图 1), 说明 STOP1 蛋
白在进化中具有保守性。系统进化树 (图 2)表明 ,
GmSTOP1与菜豆中预测的 STOP1-like蛋白(Pv:XP_
007151889.1)亲缘关系最近, 同源性达到 87%。
2.2 GmSTOP1编码蛋白的亚细胞定位
用WoLF PSORT软件进行亚细胞定位预测显示,
GmSTOP1主要定位在细胞核内。利用拟南芥原生质
体瞬时表达体系对GmSTOP1进行亚细胞定位试验的
结果也显示融合蛋白的绿色荧光信号都集中在细胞
核内(图3), 因此, 该蛋白可能在细胞核内发挥作用。
2.3 GmSTOP1在不同组织中的荧光定量 PCR分
析
以耐铝毒大豆品种科丰 1号萌发 3 d后的根尖、
14 d苗龄(V2)的茎尖分生组织、18 d苗龄(V2)的茎
和第一复叶、盛花期(R2)的花、鼓粒盛期(R6)的荚和
成熟种子[21]的 RNA 反转录的 cDNA 为模板, 分析
GmSTOP1 基因的组织表达特异性。荧光定量 PCR
结果表明(图 4), GmSTOP1基因在上述生育期均有表
达 , 但表达量存在差异 , 以根中的表达量作对照 ,
GmSTOP1 在种子(SE)中表达量最高, 其次是第一复
叶(L)、荚(P)、花(F)、茎(S)、茎尖分生组织(SAM)
和根(R)。
2.4 GmSTOP1在 AlCl3、ABA、NaCl和 PEG胁
迫处理下的荧光定量分析
从图 5 可以看出, 分别以各时间点的未处理样
品为对照, GmSTOP1基因对 4种胁迫均有不同程度
的响应。在 AlCl3溶液处理的根中, GmSTOP1 基因

表 2 GmSTOP1基因上游调控区顺式作用元件
Table 2 cis-elements in the upstream regulation region of GmSTOP1 gene
相关预测功能
Associated putative function
启动子顺式作用元件
cis-elements in the promoter region
光响应 Light response AAAC-motif, AE-box, AT1-motif, Box 4, Box I, CATT-motif, G-Box, G-box, GA-motif,
GAG-motif, GT1-motif, I-box, MRE, Sp1, chs-Unit 1 m1
激素响应 Hormone response ABRE, TCA-element
热响应 Heat response HSE
逆境响应 Stress response TC-rich repeats
细胞周期 Cell cycle MSA-like, circadian
代谢调节 Metabolic regulation O2-site
器官发育 Organ development Skn-1_motif
1806 作 物 学 报 第 41卷


图 1 GmSTOP1与其他植物 STOP1的锌指结构域序列比对
Fig. 1 Alignment of zinc finger domains of GmSTOP1 and STOP1-like proteins from other plant species
黑色表示严格保守氨基酸, 灰色表示部分保守氨基酸; *表示 C2H2中的半胱氨酸和组氨酸; GmSTOP1 (大豆 GenBank: XP_006598713),
AtSTOP1 (拟南芥 GenBank: AB300237.1), CsSTOP1 (野茶树 GenBank: AB811780.1), LjSTOP1 (百脉根 GenBank: AB811782.1),
EguSTOP1 (桉树 GenBank: AB826006.1), PpSTOP1 (小立碗藓 GenBank: AB811779.1), PnSTOP1 (黑杨 GenBank: AB811778.1), NtSTOP1
(烟草 GenBank: AB811781.1), OsART1 (水稻 GenBank: AB379846.1)。
Strictly conserved amino acids are highlighted with black, while the amino acids belong to the same amino acid group are shown with gray.
Asterisks indicate Cys and His of C2H2 motifs. GmSTOP1 (Glycine max GenBank: XP_006598713), AtSTOP1 (Arabidopsis thaliana
GenBank: AB300237.1), CsSTOP1 (Camellia sinensis GenBank: AB811780.1), LjSTOP1 (Lotus japonicas GenBank: AB811782.1),
EguSTOP1 (Eucalyptus robusta GenBank: AB826006.1), PpSTOP1 (Physcomitrella patens GenBank: AB811779.1), PnSTOP1(Populus
nigra GenBank: AB811778.1), NtSTOP1 (Nicotiana tabacum GenBank: AB811781.1), OsART1 (Oryza sativa GenBank: AB379846.1).

图 2 GmSTOP1与其他植物 STOP1的系统进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree of GmSTOP1 and STOP1-like proteins from other plant species
节点上的数字表示 1000次 BootStrap值。The numbers at the nodes indicate the 1000 BootStrap values.
第 12期 丛亚辉等: 大豆耐铝毒候选基因 GmSTOP1的克隆与表达分析 1807



图 3 GmSTOP1的亚细胞定位
Fig. 3 Subcellular localization of GmSTOP1

图 4 GmSTOP1在大豆品种科丰 1号不同组织中的相对表达量
Fig. 4 Relative expression level of GmSTOP1 gene in different
organs of soybean cultivar KF-1
R: 根; SAM: 茎尖分生组织; S: 茎; L: 叶; F: 花; P: 荚; SE: 种子。
误差线表示 3次重复的标准误。误差线上方的不同字母表示在最
短显著极差法检验中 5%水平上存在显著性差异。
R: root; SAM: shoot apical meristem; S: stem; L: first trifoliolate leaf;
F: flower; P: pod; SE: seed. Error bars represent the standard errors
of three replicates. The different letters above the error bars repre-
sent significant difference at the level of 5% by the shortest sig-
nificant ranges test.

的表达量在 24 h时出现峰值(AlCl3溶液处理根尖中
的相对表达量约是对照的 9.2倍), 48 h和 72 h的表
达量又恢复到 6 h和 12 h的表达水平。在 ABA溶液
处理的叶和根中, GmSTOP1基因的表达量分别在 12
h 和 24 h 达到高峰。在 NaCl 溶液胁迫的根中 ,
GmSTOP1 基因表达量在 3 h 出现一个小高峰后在
24~48 h 达到最大值 ; 在 NaCl 溶液胁迫的叶中 ,
GmSTOP1 基因的表达模式是先快速上升后急剧下
降并保持在较低的表达水平。GmSTOP1基因在 PEG
溶液处理的根中表达模式与 NaCl 溶液胁迫比较相
似, 而在叶中受 PEG诱导后的相对表达量在 3~12 h
快速增加并达到最大值。上述结果表明 GmSTOP1
受铝毒、ABA、高盐、PEG 等多种非生物胁迫的诱
导表达。
3 讨论
酸性(pH<5)土壤中的铝主要以可溶性铝(Al3+)
形式存在, 对大多数植物产生毒害作用。铝毒首先
抑制植物根的正常生长和发育, 影响植物根系对水
分和养分的吸收 , 最终影响植物的生长和作物产
量。因此酸性土壤中的铝毒害是限制农业生产中作
物生长和产量的主要因素之一。挖掘耐铝毒基因、
提高作物自身的耐铝毒能力, 是解决酸性土壤地区
铝毒害最有效的方法。STOP1-like 蛋白是一类含有
C2H2 型锌指结构域的转录因子, 在多种植物中可
调控耐铝毒基因的表达提高植物对铝毒的耐性。拟
南芥中与铝毒耐受机制相关的基因 AtALMT1、ALS3
和 AtMATE均受到锌指蛋白转录因子 AtSTOP1的调
控[8,13-14]。水稻中的 OsART1 (STOP1同源基因)也可
调控 OsSTAR1/2、OsMATE、Nrat1等 30多种耐铝毒
基因的表达[15]; 在烟草[16]、桉树[17]中 STOP1-like蛋
白也可以调控各自物种相应的耐铝毒基因 MATE 和
ALS3。这些研究为我们探究大豆 STOP1-like基因提
供了参考依据和理论基础。
本研究克隆获得了大豆中一个 STOP1-like 基因,
命名为 GmSTOP1。氨基酸序列分析表明, GmSTOP1
含有 4个与 AtSTOP1和其他已报道的 STOP-like蛋
白高度同源的 Cys-2-His-2锌指蛋白结构域。进化分
析表明大豆 GmSTOP1 与菜豆 STOP1-like蛋白亲缘
关系最近, 同源性达到 87%, 与已有文献报道中的
LjSTOP1 (百脉根)、PnSTOP1 (黑杨)、CsSTOP1 (野
茶树)、EguSTOP1 (桉树)等 STOP-like蛋白在进化上
属于同一个分支, 与亲缘关系较远的 PpSTOP1的同
源性也有 65%, 说明 STOP1在不同物种间具有较高
的保守性。拟南芥原生质体亚细胞定位试验结果显
示GmSTOP1定位在细胞核, 说明GmSTOP1可能在
细胞核中发挥作用, 与 AtSTOP1[14]、OsART1[15]、
EguSTOP1[17]的亚细胞定位结果相一致。由于铝毒首
先抑制植物根尖的生长, 因此, 本研究选取铝处理
后的大豆根尖进行荧光定量分析, 研究 GmSTOP1
基因在铝胁迫后的表达变化。结果表明 GmSTOP1
基因在 AlCl3 (pH 4.3)处理后上调表达, 在 24 h表达
量达到最大值(铝处理的相对表达量约是对照的 9.2
倍), 与 AtSTOP1的表达模式相似。Iuchi等[8]研究表
明, H+和 Al3+处理可以激活拟南芥根中 AtSTOP1 基
因的表达。水稻中与 AtSTOP1 同源的 OsART1 基因
1808 作 物 学 报 第 41卷


图 5 GmSTOP1在 AlCl3、ABA、NaCl和 PEG处理下的相对表达量
Fig. 5 Relative expression level of GmSTOP1 in soybean under AlCl3, ABA, NaCl, and PEG treatments
AlCl3、ABA、NaCl和 PEG处理浓度分别是 25 μmol L–1、100 μmol L–1、200 mmol L–1和 20% (m/v)。误差线表示 3次重复的标准误。
误差线上方的不同字母表示在最短显著极差法检验中 5%水平上存在显著性差异。
The concentrations of AlCl3, ABA, NaCl, and PEG treatment are 25 μmol L–1, 100 μmol L–1, 200 mmol L–1, and 20% (m/v), respectively.
Error bars represent the standard errors of three replicates. The different letters above the error bars represent significant difference at the
level of 5% by the shortest significant ranges test.

的表达模式有所不同, Yamaji 等[15]试验发现 Al3+处
理后水稻的根尖(0~10 mm)、根基部(10~20 mm)和茎
中 OsART1基因的相对表达量没有显著(Tukey’s test
P < 0.05)变化, 说明该基因的表达不受铝离子调节,
呈组成型表达的模式。AtSTOP1、OsART1、NtSTOP1、
EguSTOP1 等基因都是通过调控各自物种中相应耐
铝毒基因的上调表达提高植物对铝毒害的耐性。本
文结果表明 AlCl3处理可以激活 GmSTOP1基因的表
达, 但 GmSTOP1 基因是否能提高大豆的耐铝毒能
力还需进一步分析, 如构建植物表达载体转化拟南
芥和大豆, 获得过表达或沉默 GmSTOP1 基因的植物
并进行耐铝毒的表型鉴定, 以及铝处理下与耐铝毒
相关基因(如 ALMT1、MATE、ALS3等)的表达分析。
虽然目前还没有关于其他逆境胁迫下 STOP1-
like基因表达模式的研究报道, 但在 GmSTOP1基因
上游启动子区域发现多种与响应逆境胁迫和代谢调
节等相关的顺式作用元件, 据此我们推测 GmSTOP1
基因可能不仅与大豆耐铝毒相关, 还可能参与大豆
对其他逆境胁迫的应答反应。为验证此观点, 我们
进一步对 GmSTOP1 基因在其他非生物胁迫下的表
达模式进行分析。结果表明在 ABA、NaCl 和 PEG
等 3种胁迫处理下, 大豆叶和根中的GmSTOP1基因
都上调表达, 叶中 GmSTOP1 基因在 12 h 的相对表
达量达到最大值(相对表达量均大于对照的 10 倍),
根中 GmSTOP1 基因的表达量峰值出现在 24 h 或
48 h (相对表达量是对照的 4~9倍), 推测 GmSTOP1
基因很可能与大豆响应高盐和渗透胁迫相关。
4 结论
在耐铝毒大豆品种科丰 1 号中克隆了耐铝毒候
选基因 GmSTOP1, 该基因编码 521 个氨基酸, 预测
分子量为 57.5 kD, 理论等电点为 5.82, 含有 4个高
度同源保守的 Cys-2-His-2 锌指蛋白结构域。
GmSTOP1 与菜豆中的 STOP1-like 蛋白亲缘关系较
近。GmSTOP1 蛋白被定位在细胞核。GmSTOP1 在
大豆多种组织中均有表达, 在 AlCl3、ABA、NaCl和
PEG等 4种胁迫处理后大豆根和叶中的GmSTOP1基
因均上调表达。
第 12期 丛亚辉等: 大豆耐铝毒候选基因 GmSTOP1的克隆与表达分析 1809


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