全 文 ：武汉植物学研究 1999, 17( 2) : 110～114
Journal of Wuhan Botanical Research
花生幼苗下胚轴质膜 Ca2+ -ATP酶
及其对低温胁迫的反应
李美茹
(中国科学院华南植物研究所 广州 510650)
杜延茹 郭立波
(哈尔滨师范大学生物系 哈尔滨 150080)
提 要 经 6%～12% Dext ran T 70 密度梯度离心, 获得了纯度较高的 7 d 龄花生幼苗下胚
轴质膜制剂。质膜 Ca2+ -ATPase 在反应系统不存在 Mg 2+ 时, 可正常表现水解 AT P 的活性,
但此活性明显低于 M g2+ 激活的 AT Pase。Ca2+ -AT Pase不受 Na3VO 4抑制,不被 K + 激活,而
被 Cl- 抑制。Ca2+ -ATPase 的最适 pH 不同于M g2+ 激活的 AT Pase。低温胁迫显著提高质膜
Ca2+ -AT Pase的活性, 推测 Ca2+ -AT Pase参与胞质中 Ca 2+ 浓度变化的调节。
关键词 花生幼苗下胚轴, 质膜 Ca2+ -AT Pase, 低温胁迫
植物对低温胁迫感受的适应过程中 , Ca2+ 可能起着接受和传递胁迫信号的作用〔1, 2〕。钙信使系统起
作用的中心环节是胞质中 Ca2+ 的变化;而调节胞质中 Ca2+ 浓度的变化依赖于细胞原生质膜和细胞器膜
上 Ca2+ 的主动转运机制。在高等植物质膜上的主动 Ca2+ 转运系统有 Ca 2+ -ATPase〔3, 4〕, 以及 Kasai和
Muto 和 Rasi-Caldogno 等提出的 Ca 2+ / H+ 反向传递体〔5～8〕。目前,对高等植物质膜上 Ca 2+ -ATPase的
特性, 特别是环境因子对它的影响尚缺乏了解。笔者以花生幼苗下胚轴为材料, 研究质膜 Ca2+ -AT Pase
的特性及低温对其活性的影响, 探讨该酶的生理作用。
1 材料与方法
材料的培养: 花生( A rachis hypogaea)幼苗按焦新之等的方法培养〔9〕。
质膜的制备: 参照焦新之等的方法〔10〕, 将 7 d 龄花生幼苗下胚轴切段, 于含有 0. 25 mmo l/ L 甘露
醇, 2 mmol/ L EDTA , 1 mmol/ L DT T 和 25 mmol/ L T ris-MES, pH7. 8 的匀浆液中匀浆,浆液经纱布过
滤后, 13 000×g 离心 10 min,取上清液在 80 000×g 离心 30 min。沉降物用含有 0. 25 mmol/ L 甘露醇,
1 mmol/ L EDTA , 1 mm ol/ L DT T 和 10 mmol/ L T ris-MES, pH7. 5 的悬浮液悬浮后,铺于 6%～12%
( w/ w ) Dex ir an T70密度梯度溶液上 , 105 000×g 离心 2 h。取 6%与 12% Dex ir an T 70 界面处的沉降颗
粒作为质膜制剂试验材料。
蛋白质测定: 按李琳和焦新之介绍的考马斯蓝 G-250 染色法〔11〕。
ATPase 活性的测定: 同焦新之等的方法〔12〕。
2 结果与分析
2. 1 质膜制剂纯度的鉴定
通常采用高等植物原生质膜M g2+ 激活的AT Pase的专一抑制剂Na3VO 4来鉴定质膜制剂的纯
收稿日: 1997-09-25,修回日: 1998-01-25。第一作者:女, 1965年出生,博士,现从事植物逆境生理生化方面的研究。
蔡火石生物科学发展基金资助项目。
表 1 抑制剂对质膜制剂 Mg2+ 激活的 ATPase的影响
Table 1 Effects of inhibit or s on plasma membrane
Mg 2+ -activated ATPase activity
项 目
Item
抑制剂 Inhib itors ( mmol/ L)
C on trol Na3VO 4( 0. 1) NaN 3( 1. 0) NaNO 3( 50. 0)
Mg2+ -act ivated AT Pase act ivity〔mol Pi/ ( mg pr oteinmin)〕 0. 213 3 0. 110 9 0. 213 0 0. 210 5
Percent inhibited ( % ) 100 52. 0 99. 9 98. 7
度〔9, 10〕。实验结果表明
Na3VO4 明显抑制质膜
Mg 2+ 激活的ATPase的
活性; 而线粒体膜的
ATPase 抑制剂 NaN 3
和细胞膜ATPase的抑
制剂NaNO3几乎没有
抑制作用〔12〕。因 此,
6%～12% Dext ran T 70 密度梯度离心法所获得的质膜纯度很高。该方法快速、简便而且有效〔9, 10〕。
表 2 Na3VO4, KCl 和 K2SO4对质膜 Mg2+ 激活的
ATPase和 Ca2+ -ATPase活性的影响
Table 2 Na3VO4, KCl and K 2SO 4 on plasma membrane
M g2+ -activ ated AT Pase and Ca2+ -ATPase activities
项 目
Item
处 理 T reatments ( mmol/ L)
Cont rol Na3VO 4( 0. 1) KCl ( 50) K 2SO 4( 25)
Mg2+ -act ivated AT Pase〔mol Pi/ ( mg proteinm in)〕 0. 213 3 0. 110 9 0. 251 9 0. 253 1
Percent in hibited ( % ) 100 52. 0 118. 1 117. 8
Ca2+ -AT Pase act ivit ies〔mol Pi/ ( mg proteinm in)〕 0. 145 0 0. 145 4 0. 114 9 0. 144 8
Percent in hibited ( % ) 100 100. 2 79. 2 99. 9
2. 2 质膜 Ca2+ -ATPase 酶
学特性
向反应系统中单独加入
Ca2+ 或 Mg 2+ , 质膜制剂均表现
出 ATPase 的水解活性; Ca 2+ -
AT Pase的活性显著低于 Mg 2+
激活的 ATPase活性。Mg 2+ 激
活的 ATPase 受 K + 激活 (表
2) , 但被加入反应系统的 Ca2+
所抑制 (图 1 )。相反, Ca 2+ -
AT Pase不为 K + 激活, 也不受
Na3VO 4 抑制, 但被 C1- 抑制
(表 2) ;并且其活性随着反应系统中 Mg2+ 浓度的增高而略有提高(图 1)。
图 1 Ca2+ 、Mg2+ 分别对质膜 Mg2+ 激活的
ATPase和 Ca2+ -ATPase 活性的影响
Fig. 1 Ef fect s of Ca2+ and Mg 2+ on plasma
membrane M g2+ -act ivated AT Pase and
Ca2+ -AT Pase act ivities respect ively
我们比较了质膜 Mg 2+ 激活的 ATPase 和
Ca2+ -AT Pase的动力学特征,发现 Ca 2+ -ATPase
的 K m 值为 0. 87 mmo l/ L , V max 为 10. 75 mol
Pi/ ( mg pro tein·h ) , 最适反应底物浓度为 4
mmo l/ L (图 2) ; 最适 pH 值是 7. 0; 最适温度为
48℃(图 3)。而 Mg 2+ 激活的 ATPase 的 K m 值为
0. 56 mmol/ L , V max为 20. 83 mol Pi/ ( mg pro-
tein ·h ) , 最适反应底物浓度为 4 mmo l/ L (图
2) ;最适 pH 值是 8. 0; 最适温度为 48℃(图 3)。
可见, Ca 2+ -ATPase 和 Mg 2+ 激活的 ATPase 催
化的反应特性有差异。
2. 3 低温对质膜 Ca2+ -ATPase 活性的影
响
10℃低温处理花生幼苗 1 d, 明显提高了质
膜 Ca2+ -AT Pase 的活性(图 4)
进一步分析低温对质膜 Ca2+ -AT Pase 活性的酶学特性的影响,发现经过 10℃低温处理后, Ca 2+ -
ATPase 的 K m 值、最适底物浓度和反应温度均与对照同; 但其 V max为 12. 82 m ol Pi/ ( mg pro tein·h) ,
最适 pH 是 7. 0;而对照的 V max为 10. 75 mol Pi/ ( mg protein·h ) , 最适 pH 是 8. 0(图 4, 图 5)。可以看
出, 低温胁迫影响了 Ca2+ -AT Pase催化反应的 V max和最适 pH。
111 第 2期 李美茹等:花生幼苗下胚轴质膜 Ca2+ -ATP 酶及其对低温胁迫的反应
图 2 质膜Ca2+ -ATPas和 Mg2+激活的 ATPase
的动力学双倒数图
Fig . 2 T he L inew eaver-Burk plot of plasma m emb-
ran e Ca2+ -ATPase and Mg2+ -act ivated AT Pase
图 3 温度和反应系统 pH对质膜 Ca2+ -ATPase
和 Mg2+激活的 ATPase的影响
Fig. 3 Inf luence of temperature and pH on
plasm a membrane Ca2+ -ATPase
an d M g2+ -act ivated AT Pase
图 4 低温胁迫对质膜 Ca2+ -ATPase 的活性及其
最适 pH和反应温度的影响
Fig . 4 Inf lu ence of low temperature st res s on
plasma m emb rane Ca2+ -AT Pase act ivity
and it s opt imum pH and tem perature
图 5 低温胁迫对质膜 Ca2+ -ATPase的
反应动力学的影响
Fig. 5 In fluence of low temperatu re st ress
on plasma membrane Ca2+ -AT Pase kinet ics
3 讨论
一般认为, 高等植物细胞膜上 Ca2+ -ATPase 水解活性的表现必须有 Mg 2+ 存在〔13〕。而 Cadwell和
Haug〔14〕在研究植物质膜 AT Pase水解活性对二价阳离子的依赖性时, 发现二价阳离子对酶激活能力的
顺序是 Ca2+ > M g2+ > M n2+ = Zn2+ > Co2+ > Ni2+ ; 说明不同二价阳离子对酶作用的能力不同, 并且各种
阳离子是可以单独起作用的。郝鲁宁和余叔文〔15〕在以大麦根细胞质膜为材料时发现单独向反应系统中
加入 Ca2+ , 质膜也表现 ATPase 水解活性, Ca2+ -ATPase 活性显著高于 M g2+ 激活的 AT Pase; 并指出
Mg 2+ 激活的 ATPase 几乎不受系统中的 Ca 2+ 的影响。我们发现花生幼苗下胚轴质膜 Ca2+ -AT Pase在反
应系统中不加 M g2+ 时可正常表现活性;而酶活性比 M g2+ 激活的 AT Pase小(表 2)。一些二价阳离子对
酶激活能力的顺序是: Mg 2+ > Ca2+ > Zn2+ (结果未列出)。这与 Cadw ell和 Haug〔14〕以及郝鲁宁和余叔
文〔15〕的实验结果不同。我们还发现反应系统中 Ca 2+ 的浓度影响 Mg 2+ 激活的 ATPase 的活性;而反应系
统中 Mg 2+虽然不是表现活性所必需的,但增加 Mg 2+ 的浓度可促进 Ca2+ -AT Pase活性(图 1)。令人不解
的是, Ca 2+ -ATPase的水解 ATP 反应的 K m、最适底物浓度、反应温度与 Mg 2+ 激活的 AT Pase的相同;
但是, 两者的 V max和最适 pH 却有差异(图 3)。而郝鲁宁和余叔文〔15〕的实验表明, Ca2+ -ATPase K m 值显
著小于 Mg 2+激活的AT Pase, 指出M g2+ 激活的 AT Pase和 Ca2+ -ATPase 具有不同的酶学特征。我们的
112 武汉 植 物学 研究 第 17卷
实验结果还表明质膜质子泵的专一抑制剂 Na3VO 4对 Ca2+ -ATPase没有抑制效应(表 2) ; 这与 Carnel-
li13的结果不同;相反 Cl- 对 Ca2+ -AT Pase的水解 ATP 活性有抑制作用(表 2) ; K + 不影响 Ca2+ -AT Pase
的活性(表 2)。
现在已经证明质膜 Ca2+ -ATPase 是由钙调蛋白( CaM )所调节的〔8, 15〕。Kasai和 Muto〔6〕指出质膜上
存在有依赖 CaM 和不依赖CaM 的 Ca2+ -AT Pase,在不同的植物组织中它们所占的比例不同。外界刺激
可引起细胞质中 Ca2+ 浓度升高, Ca2+和 CaM 结合Ca2+ -CaM 复合物, 由 Ca 2+ -CaM 激活,将 Ca2+泵出细
胞外, 从而使细胞中的 Ca2+ 维持在一定的水平, 保证细胞活动的正常运行;因此 Ca2+ -ATPase 与钙信使
系统的运转密切相关。我们以 10℃处理幼苗 24 h 后,置于常温, 花生幼苗生长比对照稍缓慢。测定质膜
Ca2+ -AT Pase活性发现低温胁迫后其活性显著提高(图 4)。郝鲁宁和余叔文〔15〕认为盐胁迫造成伤害的
主要原因之一是质膜 Ca2+转运系统泵出 Ca 2+ 的能力降低。我们推测, 低温处理引起 Ca2+ -AT Pase活性
的提高是对钙信使调节的反馈, 使细胞进行正常生命活动以维持胞质中一定的 Ca2+ 水平。我们的结果
还表明低温对质膜 Ca2+ -AT Pase的 K m, 最适底物浓度和反应温度没有影响,但影响了酶反应的 V max和
最适 pH 值(图 4, 图 5)。根据酶反应速度公式: V 0= K cat〔E〕〔S〕/ (K m+ 〔S〕)〔式中 V 0: 反应的初速度;
K ca t:酶催化常数( Catalytic constant)〕; 〔E〕:酶浓度; 〔S〕: 底物浓度) 〔16〕。由于低温胁迫不影响质膜 Ca 2+ -
ATPase 的 K m。因此推测低温胁迫是通过提高质膜 Ca2+ -ATPase 的 K ca t而促进酶活性(酶促反应速度)
的。实验结果还表明, 低温胁迫使质膜 Ca2+ -AT Pase的 V max提高了 19. 26% (图 5) , 即当酶被底物 AT P
饱和时,上述公式变为 V 0= V max = K cat〔E〕tota l(〔E〕to ta l:酶初始反应速度)。由此可见,低温处理使 Ca 2+ -
ATPase 的 K ca t增大。所以, 低温胁迫促进了质膜 Ca2+ -AT Pase 和底物 AT P 复合物的解离、形成产物的
速度, 而对 Ca2+ -ATPase与底物的亲和力没有影响。低温胁迫通过何种方式影响质膜 Ca2+ -AT Pase活
性的机理尚需要进一步探讨。
参 考 文 献
1 Min orsky P V. An heuris tic hypothesis of ch illin g in p lan ts : A role for calcium as the primary p hysiological t rans-
ducer of injur y.P lant Cell Env ir on, 1985, 8: 75～79
2 王洪春.植物对低温逆境的反应.见:余叔文,汤章城编.植物生理与分子生物学.北京:科学出版社, 1992. 395
3 Wil liam L E , S chn eler S B,Briskin D P. Further characterizat ion of the red beet plasma membrane Ca2+ -AT Pase
usin g GT P as an altern at ive su bst rate. P lant P hy siol , 1990, 92: 747～754
4 Evans D E , Br iars S A, W ill iam s L E .A ct ive calcium transport by plant cell mem bran es l. J Exp B ot, 1991, 42: 285
～303
5 Kasai M , Muto S . Ca2+ pum p and Ca2+ / H+ ant iporter in plasma membrane ves icles isolated b y aqueous tw o ph ase
part ition ing f rom corn leaves. J Membr B iol, 1990, 114: 133～142
6 Kasai M , Mu to S. Solubilizat ion and r ecou st itut ion of Ca2+ pump from corn leaf plasma m emb rane. Plant Physiol,
1991, 96: 565～570
7 Rasi-C aldog no F, Pugl iarello M C, De Michelis M I. T he Ca2+ -transport AT Pase of plant plasma membrane cata-
lys es an H+ / Ca2+ ex change. Plant Physiol , 1987, 83: 994～1 000
8 Rasi-C ald ogn o F, Carnel li A , De Michili s M I. Plasma membrane Ca2+ -ATPase of radish seedlin gs.Ⅱ. Regulat ion
by calmodul in. Plant P hysiol, 1992, 98: 1 202～1 206
9 焦新之,李琳,黄丽萍等.花生下胚轴组织 H+ 分泌与氧化还原系统的某些特性.植物生理学报, 1991, 17: 49～55
10 焦新之,李琳,倪晋山.花生幼苗下胚轴质膜氧化还原系统.植物生理学报, 1992, 18: 63～70
11 李琳,焦新之.应用蛋白质染色剂考马斯蓝 G-250测定蛋白质的方法.植物生理学通讯, 1980, 6: 52～54
12 焦新之,倪晋山,李琳等. 水稻及燕麦根细胞的原生质膜、线粒体内膜与液泡膜 ATPase 的比较研究.实验生物学
报, 1988, 21: 410～416
113 第 2期 李美茹等:花生幼苗下胚轴质膜 Ca2+ -ATP 酶及其对低温胁迫的反应
13 Carnel li A , De M ichelis M I, Rasi-C ald ogn o F. Plasma m emb rane C a2+ -AT Pase of radish seedl ings . I. Bilchemical
character izat ion us ing AT P as a subst rate. P lant P hy siol , 1992, 98: 1 196～1 201
14 Caldw el l C R, Huang A .C almodulin st imu lation of th e barley ( H ord eum vu lg are cul tivar Conquest ) root plasm a
membrane-bound ( calcium ,m agn esium) -dependent AT Pase. P lant P hy siol , 1981, 67( 4suppl . ) : 136
15 郝鲁宁,余叔文.大麦根细胞质膜 Ca2+ -AT P 酶和Ca2+转运系统的特性,植物生理学报, 1992, 19: 172～180
16 Moran L A. Bioch em, Ch apt 6. New Jersey: Neil Pat terson Pub. Pren tice Hall, 1994. 8
PLASMALEMMA ATPase OF HYPOCOTYL OF
PEANUT SEEDLING AND ITS REACTION
TO LOW TEMPERATUER STRESS
Li M eir u
( S outh China Insti tut e of B otany ,T he Chinese
A cad emy of S ciences Guangzhou 510650)
Du Yanru Guo Libo
(Dep artm ent of Biology, H arbin Normal
Univ er si ty Harbin 150080)
Abstract P lasma membrane were obtained from 7-day old peanut seedling hypocoty l by 6%～12%
Dex tr an T 70 density g radient cent rifug ation, w ith high qua lit y and purit y. P lasmalemma ATPase acts
normally as hydrolyzing ATP w it hout Mg 2+ in reaction system, but t he act ivity was low er than Mg 2+ -
activ ated AT Pase. Ca2+ -AT Pase w asn′t inhibited by Na3VO 4 and wasn′t activit ied by K + , w hereas it is
inhibited by Cl- . The optimum pH o f Ca2+ -ATPase is differ ent fr om that of Mg2+ -activ ated ATPase.
Plasma m embrane Ca2+ -ATPase activ ity incr eased no tably under low tempera tur e st ress. It is suggest
that the possible ro le o f Ca2+ -AT Pase is adjusting Ca2+ concent ration on cyt oplasms.
Key words Hypoco ty l o f peanut seedling , P lasmalemma ATPase, Low temperature str ess
114 武汉 植 物学 研究 第 17卷