全 文 ：　　
第28卷 第2期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 2
2002 年3月　 227～ 229页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 227～ 229　M ar. , 2002
2℃低温下抗寒冬小麦与冷敏感春小麦幼苗细胞质膜Ca2+ -ATPase 活性
比较Ξ
刘　炜1, 2　孙德兰1, 3 　王　红1　简令成1　赵可夫2
(1中国科学院植物研究所 北京 100093; 2 山东师范大学逆境植物研究所 山东济南 250014)
摘　要　通过氯化铈 (CeC l3) 沉淀的电镜细胞化学法, 对比观察了抗寒冬小麦幼苗和冷敏感春小麦幼苗质膜 Ca2+ 2
A T Pase 活性的变化, 结果显示: 20℃下生长的冬小麦幼苗, Ca2+ 2A T Pase 活性主要定位于质膜上。2℃下, 随处理时间的
延长 (3 h、12 h) , 质膜Ca2+ 2A T Pase 活性反应逐步增强。2℃下处理3d, 质膜上仍存在酶反应产物, 质膜Ca2+ 2A T Pase 活
性高于对照。20℃下生长的春小麦幼苗, 其质膜Ca2+ 2A T Pase 活性水平高于同样条件处理下的冬小麦幼苗的酶活性水
平。2℃处理3 h, 春小麦幼苗质膜上酶活性反应明显增强。2℃处理12 h, 酶活性反应迅速降低。2℃下处理3 d, 春小麦幼苗
质膜上酶反应产物明显少于对照, 质膜Ca2+ 2A T Pase 已接近失活。结果表明, 低温逆境下质膜Ca2+ 2A T Pase 活性的大小
及其稳定性, 是决定植株本身抗寒能力大小的关键。
关键词　小麦; 质膜Ca2+ 2A T Pase 活性; 抗寒性
中图分类号: S512　　　文献标识码: A
Compar ison of Ca2+ -ATPa se Activ ity in Seedl ing Pla smolemma of Cold-resistan t
W in ter W hea t vs. Cold- sen sitive Spr ing W hea t under 2℃ L ow Tempera ture3
L IU W ei1, 2　SUN D e2L an1, 3 　WAN G Hong1　J IAN L ing2Cheng1　ZHAO Ke2Fu2
(1 Institu te of B otany , Chinese A cad em y of S ciences, B eij ing 100093, China; 2 Institu te of P lant S tress, S hand ong N orm al U niversity , J inan
250014, S hand ong , China)
Abstract 　U sing cerium trich lo ride p recip itation m ethod w ith electrom icroscop ic2cytochem ical assay, the
difference of Ca2+ 2A T Pase activity in p lasmolemm a betw een seedlings of co ld2resistan t w in ter w heat and co ld2
sensitive sp ring w heat w as compared. Grow n under 20℃, the Ca2+ 2A T Pase activity of w in ter w heat seedlings
w as m ain ly localized in p lasmolemm a. T reated at 2℃ fo r a period of tim es (3 h、12 h) , the Ca2+ 2A T Pase
activity increased gradually, and w hen the sam e treatm en t lasted fo r 3d, the enzym e activity still rem ained
active and w as h igher than the con tro l. Fo r sp ring w heat seedlings grow n under 20℃, the level of Ca2+ 2
A T Pase activity in p lasmolemm a w as sim ilar w ith that of w in ter w heat seedlings in the sam e treatm en t. W hen
treated at 2℃fo r 3 h, the enzym e activity in p lasmolemm a of sp ring w heat seedlings increased considerably, and
w hen treated at 2℃ fo r 12 h, a sharp decrease in the enzym e activity w as observed and the p roduct of the
enzym e activity w as less than that of w in ter w heat seedlings. W hen the treatm en t lasted fo r 3 d, the p roduct of
the enzym e activity w as less than the con tro l and the enzym e w as almost inactivated. It is concluded that
activity and stability of Ca2+ 2A T Pase under 2℃low temperature are the key facto rs in the developm en t of co ld
resistance of w in ter w heat.
Key words　W heat; P lasmolemm a Ca2+ 2A T Pase activity; Co ld2resistance
　　所有真核生物体, 在其受到刺激而发生反应
时, Ca2+ 都起到了关键性的作用[ 1 ]。W illiam son 等
用水母蛋显微注射方法对轮藻细胞[Ca2+ ]浓度进行
了测定, 指出轮藻细胞内自由Ca2+ 浓度低与动物细Ξ 基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39870371, 60005003)
作者简介: 刘　炜, 女, 山东人, 硕士, 研究方向: Ca2+ 作为第二信使在植物寒害及抗寒中的作用。　　3 通信作者: 孙德兰
Received on (收稿日期) : 2000208229, A ccep ted on (接受日期) : 2001204226

胞, 过量的Ca2+ 浓度会抑制细胞质流动[ 2 ]。低温胁
迫下, 由于动作电位引发的膜迅速去极化, 激活液
胞膜及质膜上的电压依赖性离子通道, 导致通道开
启增加, 选择性地允许 Ca2+ 进入细胞[ 3, 4 ]。前人对
植物生长、物质运输、水分吸收、膜蛋白和细胞运
动的研究证实, 短暂、瞬息的 [Ca2+ ]cyt增加, 是植
物在低温胁迫下所表现出的众多生理反应之一[ 5 ]。
但如果[Ca2+ ]cyt浓度过高, 或过高的[Ca2+ ]cyt持续时
间过长, 则会影响细胞能量代谢和许多生理功能,
导致 Ca2+ 中毒[ 6 ]。因此, 及时使受刺激后升高的
[Ca2+ ]cyt回落到静息态水平, 维持胞内 Ca2+ 稳态平
衡, 对细胞及整个生物体本身都有重要意义。现已
证实, 植物细胞质膜及液泡膜上存在多种Ca2+ 自动
调节与外界刺激相偶联的Ca2+ 转运系统, 其中质膜
Ca2+ 2A T Pase 能及时反馈各种刺激引起的 [Ca2+ ]cyt
升高, 相应改变自身活性, 将增加的Ca2+ 泵回到胞
外或钙库中, 迅速精细地调节 Ca2+ 水平, 是胞内
Ca2+ 稳态的主要维持者[ 6, 7 ]。鉴于前人对不同抗寒
性植物在同一低温条件下 Ca2+ 稳态平衡能力的差
异研究得较少, 本文欲通过细胞化学的方法, 利用
抗寒性不同的小麦品种, 比较它们在2℃低温下细
胞质膜Ca2+ 2A T Pase 活性变化的异同, 探讨植物不
同抗寒性形成的机理。
1　材料和方法
1. 1　材料的培养及处理
实验材料为冷敏感的春小麦品种“8131”及抗寒
性强的冬小麦品种“京冬1号”。将干净的小麦种浸
泡12 h 后, 播在培养皿内的湿润滤纸上, 20℃下萌
发, 待幼芽长约1 cm 时置于2℃低温下, 分别处理3
h、12 h 和3 d, 处理3 d 的材料先放于低温下, 之后
依次放入, 以保证幼苗大小基本一致。以未经低温
处理的材料为对照。
1. 2　酶的细胞化学方法
1. 2. 1　取材　　从小麦幼苗的基部切断幼芽, 剥
去外面的胚芽鞘, 将内部的幼叶切成0. 5 mm ×0. 5
mm 的小组织块。
1. 2. 2　初固定　　将切好的组织块迅速投入用50
mmolöL 二甲砷酸钠缓冲液 (pH 7. 4) (缓冲液A ) 配
制的4% 多聚甲醛与1% 戊二醛的混合固定液中, 室
温下初固定2 h。然后用缓冲液A 洗2次, 再用50
mmolöL T ris2M aleate 缓冲液 (pH 7. 5) (缓冲液B ) 洗
2次, 以上均在4℃进行, 每次约0. 5 h。
1. 2. 3　酶育反应　　将洗涤过的叶片小组织块放
入酶育液中, 26℃下培育2. 5 h。酶育液的成分为:
缓冲液B 中含2 mmolöL A T P、3 mmolöL CeC l3、2.
5 mmolöL CaC l2。设两个对照反应 (均由缓冲液B
配制) , a. 2 mmolöL A T P、3 mmolöL CeC l3、2. 5
mmolöL CaC l2、3 mmolöL M gSO 4、2 mmolöL 衣红
B (ergth rosin B ) ; b. 2 mmolöL A T P、3 mmolöL
CeC l3、5 mmolöL EGTA。酶育反应后, 先用缓冲液
B 洗2次, 再用缓冲液A 洗2次, 4℃下每次约0. 5h。
1. 2. 4　再固定　　洗涤后, 将叶片小组织块在缓
冲液A 配制的3% 戊二醛固定液中4℃冰箱内过夜,
然后用缓冲液A 洗涤4次, 每次约0. 5 h。
1. 2. 5　后固定　　叶片小组织块在缓冲液A 配制
的1. 5% 锇酸中固定7. 5 h, 4℃进行。
1. 2. 6　洗涤　　先用缓冲液A 洗2次, 再用重蒸水
洗2次, 4℃每次约0. 5 h。最后按常规的乙醇系列脱
水, 丙酮过渡, 环氧树脂 Epon812包埋, 在 L eica
R eichert 超薄切片机上切片, H 2800型透射电镜下
观察、照相。
2　结果
2. 1　冬小麦幼苗2℃低温处理后质膜 Ca2+ -ATPa se
活性变化
常温下 (20℃) 生长的冬小麦幼苗, 经氯化铈沉
淀反应后电镜下观察, 可见细胞质膜上分布有沉淀
颗粒 (图版É , 1, 2) , 显示此时Ca2+ 2A T Pase 活性主
要定位于质膜上。酶育液中加入 EGTA 和衣红B
(质膜Ca2+ 2A T Pase 抑制剂)的对照反应切片中, 均
未观察到Ca2+ 2A T Pase 活性反应产物 (图版É , 6) ,
表明反应切片中磷酸铈黑色沉淀是质膜 Ca2+ 2
A T Pase 活性的真实反映。当小麦幼苗2℃低温处理
3 h 后, 沉淀反应明显增多, 且沉淀颗粒增大 (图版É , 3)。2℃下12 h, 细胞质膜两侧存在密集的反应
产物 (图版É , 4) , 显示有很强的Ca2+ 2A T Pase 活性
反应。延长低温处理到3 d, 质膜上仍存在较多沉淀
颗粒, 其数量高于常温下生长的冬小麦幼苗质膜上
的沉淀颗粒 (图版É , 5; 1, 2) , 表明质膜 Ca2+ 2
A T Pase 活性得以维持。
2. 2　春小麦幼苗2℃低温下质膜Ca2+ -ATPa se 活性
变化
常温 (20℃) 下生长的春小麦幼苗, 其 Ca2+ 2
A T Pase 活性仍主要定位于质膜上, 其酶活性反应
产物 (磷酸铈黑色沉淀)数量多于同样处理下的冬小
822　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　28卷

麦幼苗 (图版Ê , 7, 图版É , 1, 2) , 显示了较强的质膜
Ca2+ 2A T Pase 反应活性。将EGTA 与衣红B 加入酶
育液的对照反应, 未有黑色沉淀颗粒生成, 显示了
正反应切片中酶活性反应的真实性 (图版Ê , 11,
12)。2℃处理3 h, 春小麦幼苗质膜上磷酸铈黑色沉
淀多于同样处理下的冬小麦幼苗 (图版Ê , 8, 图版É , 3) , 显示了强的质膜 Ca2+ 2A T Pase 活性反应。
低温处理到12 h, 春小麦幼苗质膜上酶反应产物明
显减少, 质膜Ca2+ 2A T Pase 活性降低, 低于同样条
件处理下的冬小麦幼苗 (图版Ê , 9, 图版É , 4)。当
低温处理延长至3 d, 质膜上散布的酶活性反应产
物已明显少于20℃下生长的春小麦幼苗质膜上的酶
反应产物 (图版Ê , 10, 7) , 即质膜 Ca2+ 2A T Pase 已
接近失活, 与同样处理下的冬小麦幼苗稳定的质膜
Ca2+ 2A T Pase 活性形成了鲜明的对比 (图版Ê , 10,
图版É , 5)。
3　讨论
Ca2+ 作为第二信使, 在植物的信号转导中起重
要作用。当植物遭受冷害并由此诱导对低温的适应
时, 钙是低温信号的主要传导者[ 6 ]。K retsinger
(1981) 提出, 现在还没有发现外界信号刺激导致
[Ca2+ ]cyt下降的[ 8 ]。短暂迅速的[Ca2+ ]cyt增加, 是植
物体适应逆境, 对外界作出响应的关键环节。A rora
和 Palta 认为, 冰冻胁迫下胞内自由 Ca2+ 浓度的升
高和膜上结合Ca2+ 的丧失, 都会导致植物不可逆的
伤害[ 9 ]。质膜Ca2+ 2A T Pase 作为细胞排Ca2+ 的主动
运输体系之一, 对维持胞内 Ca2+ 稳态有关键性作
用。同时已知, 低温 (2～ 4℃) 引起细胞 Ca2+ 水平短
暂性的升高是诱发抗寒植物苜蓿和冬小麦冷驯化基
因的表达和抗冻性的提高所必需的[ 10, 11 ]。故我们以
2℃低温处理材料。从实验结果看出, 抗寒性强的
冬小麦及冷敏感的春小麦幼苗, 在2℃低温逆境下
3h, 质膜Ca2+ 2A T Pase 活性都有所上升。但在延长
低温处理时间后, 质膜Ca2+ 2A T Pase 活性的动态变
化在两个品种间表现出了差异。冷敏感的品种, 其
质膜Ca2+ 2A T Pase 迅速失活, 很少看到它们的活性
反应产物。而抗寒性强的品种, 其质膜 Ca2+ 2
A T Pase 不仅未失活, 活性反而增强, 并能维持在
一定水平。这两个品种间质膜Ca2+ 2A T Pase 活性在
延长低温处理下的变化的差异, 决定了两品种抗寒
能力的不同。植物细胞具稳定的酶活性, 能在
[Ca2+ ]cyt短暂升高后将其运出胞外, 维持细胞生理
代谢和信息传递的正常进行。而酶的失活, 将导致
胞内异常增加的Ca2+ 不能迅速外排, 从而影响离子
平衡、细胞分裂及分泌等一系列功能的正常进行,
造成细胞伤害和植株死亡[ 12～ 14 ]。我们认为, 质膜
Ca2+ 2A T Pase 活性的丧失, 可能是植物受寒害的先
兆, 能否维持稳定的质膜 Ca2+ 2A T Pase 活性, 对决
定植物不同的特性起到关键性的作用。通过一定手
段来提高质膜Ca2+ 2A T Pase 对低温的耐受性, 对于
改良植物特性, 增强抗寒、抗逆能力, 具有一定的
实践意义。
References
[ 1 ] 　Bush D S. Calcium regulation in p lant cells and its ro le in
signaling. A nnu R ev P lant P hy siol P lantM ol B iol, 1995, 46:
95～ 122
[ 2 ]　W illiam son R E , A shley C C. F ree Ca2+ and cytop lasm ic
stream ing in the alga Chara. N ature, 1982, 296: 647～ 651
[ 3 ]　L unevsky V Z, Zherlova O M , Vostrikov L Y. Excitation of
Characeae cell m em branes as a result of the activation of
calcium and chloride channels. J ournal of M em brane B iology.
1983, 72: 43～ 58
[ 4 ]　Renter H. Calcium channel modulation by neuro trans m itters,
enzym es and drugs. N ature, 1983, 301: 569
[ 5 ]　M inorsky P V. Temperature sensing by p lants: A review and
hypothesis. P lant Cell E nv ironm ent. 1989, 12: 119～ 135
[ 6 ] 　M inorsky P V. A n heuristic hypothesis of ch illing injury in
p lants: a ro le for calcium as the p rim ary physio logical
transducer of injury. P lant Cell E nv ironm ent, 1985, 8: 75～ 94
[ 7 ]　M arim e D , D ieter P. Role of Ca2+ and CaM in p lants. Calcium
and Cell Function, 1983, 4: 26
[ 8 ]　Kretsinger R H. M echanism of selective signaling by Ca2+ .
N eurosci R es P rog ram B ull, 1981. 19: 217
[ 9 ]　A rora R , Palta J P. Perturbation of m em brane calcium as a
molecular m echanism if freezing injury. In: Cherry J H ed.
Environm ental stress in p lants. H eid elberg: S p ringer2V erlag.
1989, 281
[ 10 ]　Ketchum K A , Poole R J. Cytoso lic calcium regulates a
potassium current in corn (Z ea m ay s) p ro top lasts. J M em ber
B iol. 1991, 119: 277～ 288
[ 11 ]　B rauer M , Sanders D , Stitt M. Regulation of photosynthetic
sucrose synthesis: a ro le for calcium ? P lanta. 1990, 182: 236
～ 243
[ 12 ]　Zorec R , Tester M. Cytop lasm ic calcium stim ulates exocytosis
in a p lant secretary cell. B iophy s. 1992, 63: 864～ 867
9222期　　　　　　刘　炜等: 2℃低温下抗寒冬小麦与冷敏感春小麦幼苗细胞质膜Ca2+ 2A T Pase 活性比较