全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(5): 698707 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31171509, 30671222)和国家“十二五”循环农业科技工程(2012BAD14B03)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 曾昭海, E-mail: zengzhaohai@cau.edu.cn, Tel: +86-10-62733847
第一作者联系方式: 赵晓萌, E-mail: zgq2091010@163.com; 刘婧娜, E-mail: liujingna199066@126.com
**和#表示同等贡献(** and # indicate contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2014-10-16; Accepted(接受日期): 2015-04-02; Published online(网络出版日期): 2015-04-07.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150407.1048.007.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00698
绿肥还田对双季稻根际土壤产甲烷古菌群落结构的影响
赵晓萌 1,** 刘婧娜 2,** 易丽霞 3 朱 波 3 代红翠 2 胡跃高 2 曾昭海 2,*
1,#北京农学院生物科学与工程学院, 北京 102206; 2,#中国农业大学农学与生物技术学院, 北京 100193; 3长江大学农学院, 湖北荆州
434025
摘 要: 利用 PCR-DGGE技术及克隆文库构建方法研究, 尿素、紫云英鲜草翻压还田、黑麦草鲜草翻压还田和不施
氮肥 4种处理对双季稻不同生育时期(早稻季: 分蘖期, 拔节期, 成熟期; 晚稻季: 分蘖期, 扬花期, 成熟期)稻田根际
土壤中产甲烷群落结构的影响。结果表明, 双季稻不同取样时期和各处理中产甲烷古菌群落结构稳定且相似, 早稻季
和晚稻季的优势群落均为甲烷微菌目(Methanomicrobiales)、Rice Cluster I (RC-I)、甲烷鬃菌科(Methanosaetaceae)、甲
烷杆菌属(Methanobacterium), 但早稻季产甲烷古菌群落的 Shannon-Weiner 指数(H)和丰富度指数(R)整体低于晚稻
季。紫云英和黑麦草鲜草翻压还田处理较尿素处理更为明显地提高了双季稻(一年)稻田根际土壤中产甲烷古菌群落
的 Shannon-Weiner指数和丰富度指数, 但均暂未对产甲烷群落结构产生决定性影响。
关键词: 产甲烷古菌; 群落结构; 双季稻; 紫云英; 黑麦草
Community Structure of Methanogens from Double-rice Rhizosphere Soil as
Affected by Green Manure Incorporation
ZHAO Xiao-Meng1,**, LIU Jing-Na2,**, YI Li-Xia3, ZHU Bo3, DAI Hong-Cui2, HU Yue-Gao2, and ZENG
Zhao-Hai2,*
1 College of Biological Science and Engineering, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China; 2 China Agricultural University, Beijing
100193, China; 3 School of Agronomy, Yangtze University, Jingzhou 434025, China
Abstract: With the potential to prevent nitrogen loss through nitrate leaching and resulted non-point source pollution, green ma-
nure incorporation is widely regarded as an important soil management practice. However, massive input of organic matters from
green manure supplies sufficient substrate for methanogens and may change the methanogenic archaeal community structure. To
investigate the variation of methanogenic archaeal community structure as influenced by green manure incorporation, we designed
four treatments of urea application, Chinese milk vetch (Astragalus sinicus L.) incorporation, ryegrass (Lolium multiflorum Lam.)
incorporation and control (without nitrogen fertilizer). Rhizosphere soil at different double-rice growing periods (tillering stage,
jointing stage and mature stage for early rice; tillering stage, flowering stage and mature stage for late rice) was collected. Poly-
merase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis technology (PCR-DGGE) and clone library method were employed
to analyze methanogenic archaeal community structure. Methanogenic archaeal 16S rRNA gene was amplified using the
1106F/1378R primer set. A GC-clamp was added to the forward primers, 1106F, to enable denaturing gradient gel electrophoresis
analyses. Selected Electrophoresis bands were cloned with pEASY-T3 vectors and sequenced. Relative band intensity and posi-
tions were used for principal component analysis (PCA). Methanotrophic bacterial community diversity was evaluated by the
Richness index (R) and Shannon-Weiner index (H) from DGGE band data. The obtained sequences were analyzed with
DNAMAN software and manually aligned with the sequences from GenBank database using the BLAST search program on
NCBI (National Center for Biotechnology Information) web site. The phylogenetic trees were constructed by 1000-fold bootstrap
analysis using a neighbor-joining method with Mega 4.0. Results indicated that methanogenic community structure was relative
stable with high diversity and had small variations among sampling stages and treatments. Dominant populations were
Methanomicrobiales, RC-I, Methanosaetaceae and Methanobacterium over the entire double-rice season. Methanohalophilus
mahii only showed in early-rice season and fewer methanogens affiliated to Crenarchaeota in late-rice season. Methanogenic
第 5期 赵晓萌等: 绿肥还田对双季稻根际土壤产甲烷古菌群落结构的影响 699


community structure in mature stages of early-rice and late-rice showed slightly low similarity with that in other growth stages of
double-rice, which may caused by the decrease of organic matter content in soil. Higher Shannon-Weiner index (H) and Richness
index (R) were observed in late-rice season by comparison with those in early-rice season. This may due to the improved activity
of soil microbe and methanogens caused by increased average temperature in late-rice season. Additionally, three different fertil-
izer treatments increased Shannon-Weiner index and Richness index of methanogenic community structure by comparison with
control, especially treatments with green manure incorporation. Increasing soil organic matter and ammonium nitrogen content,
development of soil reducing conditions may contribute to this result. Whereas they didn’t have a crucial impact on methanogenic
community structure in this study.
Keywords: Methanogens; Community structure; Double-rice; Chinese milk vetch; Ryegrass
甲烷(CH4)具有很强的红外线吸收潜力, 单位质
量 CH4的 GWP (全球增温潜势)为 CO2的 25 倍(100
年尺度内), 对全球变暖的贡献率达 15%[1]。稻田是
大气 CH4的主要排放源, 年排放量达 30 Tg (20~40
Tg)[2-3]。我国是水稻生产大国, 种植面积居世界第二,
产量居世界第一。双季稻种植区是水稻生产的主体,
种植面积占全国水稻种植面积的 66%, 产量为全国
水稻产量的 61.3%[4]。稻田甲烷由产甲烷古菌在严格
厌氧条件下产生, 土壤中有机质及植物残体、根系
分泌物等作为产甲烷古菌的营养基质, 经过代谢可
产生 CH4和 CO2。稻田中产甲烷古菌种类分布较多,
目前从水稻土壤中分离得到 7 个属, 分别是甲烷杆
菌属 (Methanobacterium)、甲烷八叠球菌属 (Meth-
anosarcina)、甲烷短杆菌(Methanobrevibacter)、甲烷
囊菌属 (Methanoculleus)、产甲烷古菌属 (Methano-
genium)、甲烷髦毛菌属(Methanosaeta)和甲烷螺菌属
(Methanospirillum)[5-7]。
紫云英(Astragalus sinicus L.)和黑麦草(Lolium
multiflorum Lam.)是我国稻区两种主要绿肥, 将其翻
压还田可改善土壤理化性质 , 并可部分替代氮肥 ,
减少过量氮肥投入带来的面源污染等生态问题[8-9]。
紫云英黑麦草翻压还田增加了稻田土壤中有机质含
量, 影响水稻土壤环境, 使甲烷排放有所增加[1,8]。
本文研究紫云英和黑麦草鲜草翻压还田对双季稻不
同生育时期稻田土壤中产甲烷古菌群落结构动态变
化, 了解稻田甲烷排放变化机制, 为减少稻田温室
气体排放提供理论支撑和参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验地概况
湖南省岳阳市华容县万庾镇吴家桥村七组
(29°52′N, 112°55′E)地处洞庭湖平原, 属亚热带季风
湿润气候, 年均气温 17℃, ≥10℃积温 5273℃, 无
霜期 261 d, 年降雨量 1232 mm。试验土壤类型为紫
潮泥。经测定, 试验前土壤 pH 6.0, 含有机质 5.07%,
土壤全氮 0.18%, 碱解氮 125.0 mg kg–1, 有效磷 12.5
mg kg–1, 速效钾 11.6 mg kg–1, 土壤容重 1.18 g cm–3。
1.2 试验设计
设置施用尿素(CF)、紫云英翻压还田(MV)、黑
麦草翻压还田(RG)和不施氮肥(CK) 4个处理。小区
面积 5 m × 6 m=30 m2, 完全随机区组排列, 3次重
复。小区间修筑 0.5 m宽的田埂, 区组间用 1 m宽的
灌水沟隔开。各处理均以早稻和晚稻移栽前施用过
磷酸钙(75 kg hm–2 P2O5)和氯化钾(100 kg hm–2 K2O)
为基肥。CF 施氮量为当地农民惯用施肥量(早晚稻
各施 200 kg N hm–2), MV和 RG为紫云英和黑麦草
按照田间直接生长情况在早稻移栽前 1周翻压还田,
早稻和晚稻两季均不施用其他氮肥。紫云英施用量
21 t hm–2 (鲜重), 含水量 89.5%, C/N 14.5, 总有机碳
含量 514 g kg–1 (干重); 黑麦草施用量 24 t hm–2 (鲜
重), 含水量 79.6%, C/N 62.3, 总有机碳含量 553 g
kg–1 (干重)。水稻移栽后进行喷施除草剂、灌水、中
期晒田等常规管理措施, 晚稻移栽前进行翻耕和整
地。黑麦草供试品种黑麦草特高(播种量 30 kg hm–2),
紫云英供试品种湘肥 3号(播种量 37.5 kg hm–2)。早
稻供试品种株两优 819, 2011年 5月 1日移栽, 移栽
密度每公顷 200 000蔸, 7月 20日收获。晚稻供试品
种丰源优 299, 移栽密度每公顷 200 000 蔸, 7 月 24
日移栽, 10月 26日收获。
分别于早稻分蘖期、拔节期、成熟期及晚稻分
蘖期、扬花期、成熟期取水稻根际土(将水稻从水稻
田中连根拔起, 多次抖动根部去除松散附着于根表
的土壤, 收集仍然黏附于根表的土壤, 约距根为 0~4
mm), 从每个处理取 5株水稻根际土土样, 均匀混合,
后将土壤用锡箔纸包裹, 置液氮罐中迅速冷冻带回
北京中国农业大学农学与生物技术学院, 20℃保存
备用。
1.3 土壤 DNA提取
采用华越洋新型快速土壤 DNA 提取试剂盒(北
京, 华越洋生物科技有限公司), 各处理均称取 0.3 g
700 作 物 学 报 第 41卷

土壤, 按试剂盒的试验步骤提取土壤微生物总 DNA,
以微量紫外分光光度计 ND-1000 (美国)检测其纯度
和浓度。
1.4 产甲烷古菌 16S rRNA基因的 PCR扩增
以提取的土壤总DNA为模板, 利用产甲烷古菌
的 16S rRNA特异性引物 1106F (5′-TTWAGTCAGG
CAACGAGC-3′)和 1378R (5′-TGTGCAAGGAGCAG
GGAC-3′)进行扩增, 其中前引物带 GC-clamp (5′-C
GCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCA
CGGGGGG-3′)。反应程序为 94℃预变性 90 s; 94℃
变性 30 s, 56℃退火 30 s, 72℃延伸 90 s, 33个循环;
72℃延伸 3 min。PCR体系 50 μL, 含 5 μL 10PCR
buffer (含 Mg2+), 4 μL 2.5 mmol L–1 dNTP, 1 μL
20 μmol L–1 1106F-GC clamp, 1 μL 20 μmol L–1
1378R, 0.2 μL 5 U μL–1 Taq DNA聚合酶, 1 μL模板
DNA, 37.8 μL超纯水。用 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测
PCR 300 bp左右的特异性扩增片段。
1.5 变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析
应用 DNA 片段纯化试剂盒(北京三博远志生物
技术有限公司)按其说明书将产甲烷古 16S rRNA 的
PCR产物浓缩至约 200 ng μL–1, 取 10 μL该样品加
入 5 μL loading buffer, 应用 Bio-Rad公司 DCode 突
变检测系统 (Universal Mutation System), 选取 16
cm×16 cm胶板, 分离 PCR产物。采取聚丙烯酰胺和
变性剂双梯度凝胶, 变性梯度设为 32%~62% (7 mol
L–1 ､尿素 40%去离子甲酰胺时的变性浓度为 100%),
聚丙烯酰胺浓度为 6%~12%。60℃, 0.5×TAE (DGGE
专用)、100 V 条件下电泳 12 h。将 DGGE 胶采用
SYBR Green I (1∶10000)染色 30 min后, 用 Alpha
Innotech Chemilmage 5500 CCD成像仪照相。
1.6 变性梯度凝胶电泳(DGGE)条带回收及克隆
测序
分析并标记 DGGE 图谱中主要条带, 回收条带
至 1.5 mL离心管中。每个离心管中加入 400 μL无
水乙醇, 10~15 min待胶变为白色, 真空吸走上清液,
再加入 200 μL diffusion buffer。待胶由白色变为透明
后, 4℃过夜。最后用纯化试剂盒(北京, 华越洋生物
科技有限公司)回收 DNA, 置20℃冰箱待用。
将电泳优势带回收后转化至大肠杆菌 DH5α 感
受态细胞, 连接 pEASY-T3 载体, 筛选蓝白斑, 阳性
克隆菌液送北京三博远志公司测序。
1.7 数据统计与分析
利用 Quantity one-4.6.2 (Bio-Rad)软件分析 DGGE
凝胶, 用得到的条带强度及位置信息做主成分分析
(PCA), 并通过公式(1)､ (2)计算 Shannon-Weiner 指
数、丰富度指数(R):
R S (1)
1
(ln )
s
i i
i
H p p

  (2)
i ip n /N (3)
其中, S为某一泳道的条带总数, ni为第 i条条带的强
度, N为所有条带总强度, pi为泳道中某一条带的强
度与同泳道中所有条带强度的比值。
测序结果先经过 DNAMAN 软件编辑, 再登陆
NCBI, 利用 Blast搜索GenBank, 获取公开的相近菌
株的 16S rRNA基因序列, 利用 Mega 4.0软件中 N-J
算法(Neighbor-Joining)建立系统发育树。
2 结果与分析
2.1 双季稻不同生育时期产甲烷古菌 16S rRNA
基因的 PCR-DGGE图谱分析
在早稻季, 产甲烷古菌 16S rRNA基因DGGE图
谱见图 1-a, 不同处理不同时期的泳道中条带数相近
(表 1), 代表其菌种丰富程度相近。处理 MV 和 RG
在各时期的条带数略大于 CF和 CK。不同处理不同
时期条带分离程度相似 , 如 ER-B16、ER-B12 和
ER-B22在所有处理及时期中均占优势, 说明该类产
甲烷古菌受环境变化影响较小, 分布广泛; 个别条
带为某时期所特有, 如 ER-B5仅在早稻拔节期出现,
而 ER-B20仅在早稻拔节期末出现。
晚稻三生育期产甲烷古菌 DGGE图谱如图 1-b。
在不同时期各处理间均存在优势条带 (LR-B6、
LR-B7、LR-B12、LR-B15、LR-B17、LR-B20、LR-B23),
但其强度差异微小。比较早稻晚稻相同生育期(分蘖
期和成熟期), 晚稻各处理泳道的条带数明显多于早
稻各处理, 表明晚稻季产甲烷古菌种的丰富度高于
早稻季。
2.2 PCR-DGGE图谱的主成分分析(PCA)
图2-a 表明 , 主成分因子1 (PC1)的贡献率为
42.4%, 主成分因子2 (PC2)的贡献率为19.1%。PC1
将样品分为2个部分 , 早稻分蘖期和早稻拔节期的
样品主要分布在图的左边, 早稻成熟期的样品主要
分布在图的右边。在早稻分蘖期样品中, PC2将 CK、
CF处理的样品和 MV、RG处理的样品分开; 早稻拔
节期4个处理的样品分布非常接近 ; 早稻成熟期样
品中, PC2将 CF、RG 处理的样品和 MV、CK 处理
的样品分开。
第 5期 赵晓萌等: 绿肥还田对双季稻根际土壤产甲烷古菌群落结构的影响 701



图 1 早稻(a)和晚稻(b)不同生育时期稻田根际土壤中产甲烷古菌 16S rRNA基因的 DGGE图谱
Fig. 1 DGGE profiles of amplified methanogenic archaeal 16S rRNA gene obtained from the rhizosphere soil of double-rice at
different growing stages
CK: 不施氮肥; CF: 施用尿素; MV: 紫云英鲜草翻压还田; RG: 黑麦草鲜草翻压还田。ER-TS: 早稻分蘖期; ER-JS: 早稻拔节期;
ER-MS: 早稻成熟期。LR-TS: 晚稻分蘖期; LR-FS: 晚稻扬花期; LR-MS: 晚稻成熟期。
CK: without nitrogen fertilizer; CF: with urea application; MV: with Chinese milk vetch incorporation; RG: with ryegrass incorporation;
ER-TS: early-rice tillering stage; ER-JS: early-rice jointing stage; ER-MS: early-rice mature stage; LR-TS: late-rice tillering stage; LR-FS:
late-rice flowering stage; LR-MS: late-rice mature stage.

表 1 双季稻不同生育期产甲烷古菌 Shannon-Weiner指数和丰富度指数
Table 1 Shannon-Weiner (H) and Richness (R) indexes of methanogens derived from the rhizosphere soil of double-rice at different
growing periods
产甲烷古菌 Methanogens 水稻生育期
Rice growth stage
处理
Treatment 丰富度指数 R index Shannon-Weiner指数 H index
不施氮肥 CK 31 3.00
施用尿素 CF 31 3.04
紫云英鲜草翻压还田 MV 36 3.10
分蘖期
Tillering stage
黑麦草鲜草翻压还田 RG 33 3.06
不施氮肥 CK 29 3.00
施用尿素 CF 33 3.07
紫云英鲜草翻压还田 MV 36 3.13
拔节期
Jointing stage
黑麦草鲜草翻压还田 RG 34 3.12
不施氮肥 CK 30 2.96
施用尿素 CF 32 3.12
紫云英鲜草翻压还田 MV 34 3.22
早稻
Early-rice
成熟期
Mature stage
黑麦草鲜草翻压还田 RG 33 3.20
不施氮肥 CK 36 3.19
施用尿素 CF 41 3.20
紫云英鲜草翻压还田 MV 42 3.43
分蘖期
Tillering stage
黑麦草鲜草翻压还田 RG 41 3.29
不施氮肥 CK 37 3.30
施用尿素 CF 40 3.17
紫云英鲜草翻压还田 MV 40 3.24
扬花期
Flowering stage
黑麦草鲜草翻压还田 RG 40 3.17
不施氮肥 CK 40 3.11
施用尿素 CF 41 3.26
紫云英鲜草翻压还田 MV 44 3.21
晚稻
Late-rice
成熟期
Mature stage
黑麦草鲜草翻压还田 RG 42 3.25
缩写同图 1。Abbreviations are the same as those given in Figure 1.
702 作 物 学 报 第 41卷

图 2-b 表明, 主成分因子 1 (PC1)的贡献率为
40.0%, 主成分因子 2 (PC2)的贡献率为 12.9%。PC1
将样品分为 2个部分, 晚稻分蘖期和晚稻扬花期的
样品主要分布在图的左边, 晚稻成熟期的样品主要
分布在图的右边。晚稻分蘖期 4 个处理的样品分布
非常接近, 晚稻扬花期样品中, PC2 将 CK、MV 和
CF 处理的样品同 RG 处理的样品分开; 晚稻成熟期
样品中, PC2将 CF、RG处理的样品和 MV、CK处
理的样品分开。
2.3 双季稻不同生育时期产甲烷古菌 DGGE 条
带序列分析
将早稻不同生育期产甲烷古菌 DGGE 图谱(图
1-a)中所标示的条带切割 , 回收测序 , 序列经
NCBI-Blast 比对后 , 得到最相近的菌种相关信息 ,
如表 2 所示。ER-B3 序列比对得到最相近的菌为
Uncultured clone SS033 (EU329770.1), 相似性仅为
88%, ER-B22与 Methanohalophilus mahii DSM 5219
(马氏甲烷嗜盐菌)菌种相似度为 91%, 其他所有条
带序列与 NCBI数据库中菌种相似度均高于 94%。
根据克隆测序和序列比对结果构建 16S rRNA
基因序列系统发育树, 如图 3-a所示。早稻不同生育
期各处理根际土中产甲烷古菌有甲烷微菌目
(Methanomicrobiales)、Rice Cluster I (RC-I)、甲烷鬃
菌科 (Methanosaetaceae)、甲烷杆菌属 (Methanoba-
cterium), 还有较特殊的一类菌群是马氏甲烷嗜盐菌。
晚稻不同生育期产甲烷古菌 DGGE凝胶条带回
收、克隆测序结果经 NCBI 数据库 Blast 比对(表 3)
表明 11条带测序结果比对后得到的是未能培养的菌
种, 仅个别条带序列与已鉴定出的菌种有着高相似
度, LR-B2、LR-B10、LR-B1序列比对后得到的结果
均与 Candidatus Methanoregula boonei strain SN19
(EU887826.1)相似度高, 分别为 98%、99%和 100%;

表 2 早稻不同生育期产甲烷古菌 DGGE条带序列比对结果
Table 2 Result of sequence alignment of methanogenic archaea at different growth stages of early rice
条带
Band No.
NCBI中最相近序列
Closest relatives found in NCBI database
登录号
Accession No.
同源性
Similarity (%)
ER-B1 Methanosaeta sp. AMPB-Z AJ276397.1 98
ER-B2 Methanobacterium sp. SA-12 AY695843.1 99
ER-B3 Uncultured archaeon clone SS033 EU329770.1 88
ER-B4 Uncultured archaeon clone SCA76 EU735565.1 97
ER-B5 Uncultured archaeon gene AB199856.1 96
ER-B6 Uncultured crenarchaeote gene AB691305.1 99
ER-B7 Uncultured archaeon RC-I AM114193.2 96
ER-B8 Candidatus Methanoregula boonei EU887826.1 99
ER-B20 Candidatus Methanoregula boonei EU887826.1 100
ER-B9 Uncultured methanogenic archaeon gene AB630343.1 100
ER-B11 Methanolinea sp. TNR gene AB447467.1 97
ER-B12 Methanosaeta concilii gene AB679168.1 98
ER-B13 Methanosaeta sp. AMPB-Zg gene AJ276397.1 99
ER-B14 Uncultured Euryarchaeote DGGE band 26 AB570346.1 100
ER-B15 Uncultured archaeon clone Thp_A_139 EF444656.1 94
ER-B16 Uncultured isolate DGGE gel band 1 JQ036332.1 100
ER-B17 Methanobacterium sp. 17A1 HQ110085.1 100
ER-B18 Uncultured Methanomicrobiales F5OHPNU07IDO7Z HQ076489.1 99
ER-B19 Uncultured Methanosaeta sp. HQ082780.1 95
ER-B21 Anaerobic methanogenic archaeon SN22 EU887811.1 99
ER-B22 Methanohalophilus mahii DSM 5219 CP001994.1 91
ER-B23 Uncultured archaeon gene AB546672.1 99
ER-B24 Methanosphaerula palustris E1-9c NR_044422.1 98
ER-B25 Uncultured archaeon gene AB546665.1 99
ER-B26 Uncultured euryarchaeote AB570369.1 100

第 5期 赵晓萌等: 绿肥还田对双季稻根际土壤产甲烷古菌群落结构的影响 703



图 2 早稻(a)和晚稻(b)PCR-DGGE图谱的主成分分析
Fig. 2 Principal component analysis of DGGE profiles (a: early-rice, b: late rice)
缩写同图 1。Abbreviations are the same as those given in Figure 1.

(图 3)
704 作 物 学 报 第 41卷


图 3 早稻(a)和晚稻(b)不同生育时期产甲烷古菌 16S rRNA基因序列系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree analysis based on methanogenic 16S rRNA gene sequences at different growth stages of early rice (a) and
late rice (b)

LR-B6和 LR-B7为 Methanocella (RC-I)属, LR-B13
与 Methanosaeta concilii GP-6 (甲烷鬃菌属)相似度为
99%, LR-B19与 Methanobacterium sp. MC-20 (甲烷
杆菌属)相似度为 98%, LR-B22与 Methanosphaerula
palustris strain E1-9c相似度为 98%。早稻和晚稻大
部分条带序列比对得到较多相同菌种, 唯有相似度
有些差异(表 2和表 3)。
如图 3-b 所示, 晚稻不同生育期根际土中主要
群落与早稻相似, 优势群落主要有甲烷微菌、Rice
Cluster I、甲烷鬃毛菌、甲烷杆菌属。晚稻季属于泉
古菌门的古菌类群明显少于早稻季, 但因晚稻季有
11 条序列对比结果为不可培养的菌种, 未可确定其
是否属于泉古菌门。
2.4 双季稻产甲烷古菌群落多样性分析
如表 1 所示, CK 和 CF 在早稻季不同生育期
Shannon-Weiner 指数变化不大 , MV 和 RG 的
Shannon-Weiner 指数在各时期都较接近; 在早稻季
3个时期 Shannon-Weiner指数为 MV>RG>CF>CK。
第 5期 赵晓萌等: 绿肥还田对双季稻根际土壤产甲烷古菌群落结构的影响 705


表 3 晚稻不同生育期产甲烷古菌 DGGE条带序列比对结果
Table 3 Result of sequence alignment of methanogenic archaea at different growth stages of late rice
条带
Band No.
NCBI中最相近序列
Closest relatives found in NCBI database
登录号
Accession No.
同源性
Similarity (%)
LR-B1 Uncultured archaeon DGGE band: Ich-28 AB546712.1 99
LR-B2 Uncultured archaeon DGGE band: Ich-28 AB546712.1 98
LR-B3 Uncultured archaeon clone Thp_A_139 EF444656.1 94
LR-B4 Uncultured archaeon DGGE gel band 1 JQ036332.1 100
LR-B5 Uncultured Methanomicrobiales HQ081146.1 100
LR-B6 Methanocella conradii HZ254 CP003243.1 94
LR-B7 Methanocella paludicola SANAE DNA AP011532.1 99
LR-B9 Uncultured Methanomicrobiales HM973860.1 100
LR-B10 Candidatus Methanoregula boonei EU887826.1 99
LR-B18 Candidatus Methanoregula boonei EU887826.1 100
LR-B23 Candidatus Methanoregula boonei EU887826.1 100
LR-B11 Uncultured archaeon clone MH1492_B10B EU155957.1 100
LR-B12 Uncultured archaeon clone SWA0101-02 JN398031.1 100
LR-B13 Methanosaeta concilii GP-6 CP002565.1 99
LR-B15 Uncultured archaeon clone 1(9) JF304130.1 100
LR-B16 Uncultured bacterium clone EBL21 GU591513.1 100
LR-B19 Methanobacterium sp. MC-20 JF812256.1 98
LR-B20 Uncultured archaeon clone SWA0101-10 JN398039.1 100
LR-B21 Uncultured archaeon clone SSA0103-11 JN397869.1 99
LR-B22 Methanosphaerula palustris strain E1-9c NR_044422.1 98

晚稻季中, MV的 Shannon-Weiner指数变化比较
有规律, 趋势是分蘖期>扬花期>成熟期; 同时期不
同处理间差异较大, 分蘖期 MV>RG>CK、CF; 扬花
期 CK 的 Shannon-Weiner 指数较高, 成熟期除 CK
外, 其他处理 Shannon-Weiner 指数较接近。总体来
讲, 晚稻季的 Shannon-Weiner指数高于早稻季。
3 讨论
3.1 取样时期对双季稻根际土壤中产甲烷古菌
群落的影响
产甲烷古菌群落受取样时间变化小, 多数生育
时期双季稻根际土中菌群落结构相似度高 , 这与
Krüger 等[10]对意大利水稻田中产甲烷古菌群落研究
结果类似。Watanabe 等[11]利用 DGGE 技术, 对稻-
麦轮作体系产甲烷古菌研究中, 同样发现产甲烷古
菌群落结构较稳定。但不论是早稻季还是晚稻季 ,
PCA 分析都将成熟期产甲烷古菌群落结构与其他时
期分开, 可能原因在于成熟期稻田有机质含量低于
其他时期。稻田土壤中有机质分解后产物可作为产
甲烷的前体。紫云英和黑麦草还田后有机质迅速腐
解 , 早稻成熟期稻田有机质含量降至较低水平 [12],
晚稻季中, 早稻根系和残茬为稻田中主要有机质来
源, 其在晚稻成熟期也会降至较低水平[1]。并且, 水
稻成熟期光合作用减弱, 根际分泌物减少[13]。总体
来看, 成熟期稻田土壤中有机物质含量降低, 产甲
烷前体减少, 可能使成熟期产甲烷古菌群落结构异
于其他时期。晚稻季产甲烷古菌的 Shannon-Weiner
指数(H)和丰富度指数(R)均略高于早稻季 , 可能原
因在于晚稻季土壤温度较高, 刺激产甲烷古菌、土
壤高分子水解菌和发酵菌的活性, 加剧稻田中有机
物的分解[14-15]。
此外, RC-I 产甲烷古菌较丰富且稳定分布于双
季稻各个生育时期, 很多研究结果已表明 RC-I在根
际微区中较其他类型产甲烷古菌活跃[4,6,17]。
3.2 施肥对双季稻根际土壤中产甲烷古菌群落
的影响
与 CK相比, 3个施肥的处理在双季稻不同生育
期提高了产甲烷古菌的丰富度和多样性指数, 在施
放有机肥的 MV和 RG中表现更明显。
产甲烷古菌的繁殖与生长需要充足的底物 [17],
紫云英或黑麦草还田从两方面增加土壤中产甲烷古
菌的底物, 一是其本身为稻田注入大量有机质, Zhu
706 作 物 学 报 第 41卷

等[12]研究表明, 80%的有机干物质将在还田后的 1个
月内迅速腐解, 为产甲烷古菌提供大量产甲烷前体;
二是紫云英和黑麦草还田可促进水稻植株的生长 ,
水稻根系脱落物、分泌物及植株残体增加[8,13], 进而
增加土壤产甲烷前体数量。普通施放氮肥处理也可
通过促进水稻植株的生长来实现产甲烷古菌底物的
增加, 但无大量有机质注入, 对产甲烷古菌的影响
不如紫云英或黑麦草还田。
产甲烷古菌需要严格的厌氧环境, 在氧气或其
他氧化态无机化合物存在的情况下, 产甲烷古菌将
会丧失活性, 逐渐死亡 [17]; 而在严格厌氧和还原条
件下(氧化还原电位 Eh ≤ 200 mV), 产甲烷古菌将
保持活性, 将产甲烷前体转化为甲烷[18]。紫云英和
黑麦草有机质分解时, 土壤兼性细菌和厌氧细菌将
消耗土壤中大量氧气和氧化态无机化合物(NO3、
Mn4+、Fe3+、SO42)并产生还原物质, 使得稻田氧化
还原电位快速下降, 为产甲烷古菌活动提供必要环
境[13,19]。
除了必备的碳源(有机质分解产生的产甲烷前
体)和土壤还原条件外, 产甲烷古菌的生存还需氮源,
而所有产甲烷古菌都可将 NH4+作为氮源, 即使肽和
氨基酸存在, NH4+仍为产甲烷古菌所必需[17]。紫云
英或黑麦草还田、施放铵态氮肥尿素, 均可为产甲烷
古菌的生长提供必需的 NH4+。Zhu等[12]研究表明, 紫
云英或黑麦草还田对产甲烷古菌群落影响期较施用尿
素处理长, 可能更有利于产甲烷古菌的繁殖生长。
紫云英或黑麦草还田不论是在碳源、氮源供给,
土壤环境等方面均明显比施用尿素更有利于产甲烷
古菌的生长, 但文中结果显示其暂未对产甲烷古菌
群落结构产生决定性影响, 表明仍需长期定位试验
来进一步明确紫云英或黑麦草还田对产甲烷古菌群
落的影响。
4 结论
早稻季和晚稻季各取样时期, 产甲烷古菌种类
变化不大, 优势条带类似, 优势群落主要有广古菌
门的甲烷微菌、Rice Cluster I、甲烷鬃菌、甲烷杆菌
属。早稻季中还存在特殊的一类菌群, 马氏甲烷嗜
盐菌。双季稻季节内取样时期和处理对产甲烷古菌
群落结构总体影响不大, 早稻分蘖期和拔节期根际
土中菌群落结构相似度较高, 晚稻分蘖期和扬花期
群落相似度较高, 早稻和晚稻成熟期产甲烷古菌群
落结构与其他时期相似度较低。晚稻季产甲烷古菌
群落的 Shannon-Weiner 指数(H)和丰富度指数(R)均
略高于早稻季。施肥处理(施用尿素、紫云英鲜草翻
压还田和黑麦草鲜草翻压还田提高了双季稻不同生
育时期稻田根际土壤中产甲烷古菌群落的丰富度和
多样性指数, 紫云英和黑麦草还田的处理较尿素处
理提高的更为明显。
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