全 文 ：第 35 卷第 20 期
2015年 10月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.20
Oct.,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然基金重点项目(41130527)
收稿日期:2015鄄07鄄09; 摇 摇 修订日期:2015鄄08鄄12
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: luyh@ pku.edu.cn
DOI: 10.5846 / stxb201507091459
张坚超,徐镱钦,陆雅海.陆地生态系统甲烷产生和氧化过程的微生物机理.生态学报,2015,35(20):6592鄄6603.
Zhang J C, Xu Y Q, Lu Y H.Microbial mechanisms of methane production and oxidation in terrestrial ecosystems.Acta Ecologica Sinica,2015,35(20):
6592鄄6603.
陆地生态系统甲烷产生和氧化过程的微生物机理
张坚超,徐镱钦,陆雅海*
北京大学, 城市与环境学院,北京摇 100871
摘要:陆地生态系统存在许多常年性或季节性缺氧环境,如:湿地、水稻土、湖泊沉积物、动物瘤胃、垃圾填埋场和厌氧生物反应
器等。 每年有大量有机物质进入这些环境,在缺氧条件下发生厌氧分解。 甲烷是有机质厌氧分解的最终产物。 产生的甲烷气
体可通过缺氧鄄有氧界面释放到大气,产生温室效应,是重要的温室气体。 产甲烷过程是缺氧环境中有机质分解的核心环节,而
甲烷氧化是缺氧鄄有氧界面的重要微生物过程。 甲烷的产生和氧化过程共同调控大气甲烷浓度,是全球碳循环不可分割的组成
部分。 对陆地生态系统甲烷产生和氧化过程的微生物机理研究进展进行了概要回顾和综述。 主要内容包括:新型产甲烷古菌
即第六和第七目产甲烷古菌和嗜冷嗜酸产甲烷古菌的发现;短链脂肪酸中间产物互营氧化过程与直接种间电子传递机制;新型
甲烷氧化菌包括厌氧甲烷氧化菌和疣微菌属好氧甲烷氧化菌的发现;甲烷氧化菌生理生态与环境适应的新机制。 这些研究进
展显著拓展了人们对陆地生态系统甲烷产生和氧化机理的认识和理解。 随着新一代土壤微生物研究技术的发展与应用,甲烷
产生和氧化微生物研究领域将面临更多机遇和挑战,对未来发展趋势做了展望。
关键词:甲烷产生;甲烷氧化;微生物机理;新型产甲烷古菌; 直接种间电子传递
Microbial mechanisms of methane production and oxidation in terrestrial
ecosystems
ZHANG Jianchao, XU Yiqin, LU Yahai*
College of Urban and Environmental Sciences, Peking University, Beijing 100871, China
Abstract: Terrestrial ecosystems consist of oxic and anoxic environments. Anoxic environments can be permanent or
temporary, and they include natural wetlands, paddy field soils, lake and river sediments, rumens, landfills, and
anaerobic bioreactors. Large amounts of organic matter are released into these environments annually. Under anoxic
conditions, organic matter is decomposed anaerobically, with methane (CH4) as the final product. CH4 can diffuse through
the anoxic鄄oxic interface and enter the atmosphere, and can become a potent greenhouse gas. Methanogenesis appears to be
the core process of organic matter decomposition in anoxic environments. Methane oxidation takes place actively in the
anoxic鄄oxic interface through which CH4 diffuses. Microbial production and oxidation of CH4 in terrestrial ecosystems
together regulate the atmospheric concentration of CH4 and contribute to a crucial part of global carbon cycling. In this
review, we report the recent advances in the mechanistic understanding of microbial CH4 production and oxidation in
terrestrial ecosystems. The major topics include: discovery of novel methanogens, particularly of the psychrophilic and
acidophilic methanogens, and the 6 th and 7 th orders of methanogens; syntrophic interaction and direct interspecies electron
transfer in the methanogenic oxidation of short鄄chain fatty acids; the discovery of novel methanotrophs, including anaerobic
and aerobic verrucomicrobial methanotrophs; and the novel ecophysiological properties of methanotrophs. These advances
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have greatly increased our understanding of microbial CH4 production and oxidation in terrestrial ecosystems, and with the
development of new methods and technologies, more breakthroughs are expected. We also propose a few perspectives for
future studies.
Key Words: methane production; methane oxidation; microbial mechanisms; novel methanogens; direct interspecies
electron transfer (DIET)
工业革命以来,工农业活动、化石燃料的燃烧及毁林开荒等人类活动造成二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)和
氧化亚氮(N2O)等温室气体大量排放,由此引发的全球变化已经成为当今全人类面临的重要环境问题。 CH4
是重要的温室气体,自工业革命以来,大气 CH4浓度增加了近 2.5倍,已由工业革命前的 715ppb(体积分数)增
加至 2011年的 1803 ppb[1]。 20世纪 90年代经历了一个近 10年的稳定期,但自 2007起大气 CH4再度迅速增
加[1]。 单位质量 CH4的温室效应是 CO2的 21 倍[2]。 目前全球每年的 CH4排放量约为 500—600 Tg[3]。 大气
甲烷来源可分为人为源和自然源,其中人为源约占三分之二,主要包括畜牧、稻田、采煤、油气工业、垃圾填埋
以及生物质燃烧等;湿地是甲烷排放最主要的自然源。 在所有 CH4排放源中,约 69%的 CH4来源于产甲烷古
菌的新陈代谢活动[4]。 因此,产甲烷古菌是甲烷产生的最重要生物源。
图 1摇 湿地及水稻土系统的甲烷产生及氧化过程
摇 Fig.1摇 The production and oxidation of methane from wetlands
and paddy soils
尽管产甲烷古菌是大气甲烷排放的重要生物源,但
陆地生态系统还存在另一类微生物,即甲烷氧化菌,可
将甲烷彻底氧化为 CO2。 甲烷氧化菌在陆地生态系统
中广泛分布。 在森林、草原等甲烷浓度较低的环境,甲
烷氧化菌每年氧化约 3千万吨甲烷,是大气甲烷主要的
生物汇[5]。 而在湿地、水稻土、垃圾填埋场等甲烷浓度
较高的环境,甲烷氧化菌每年氧化约相当于这些环境中
甲烷产生总量的一半[5]。 陆地生态系统向大气排放甲
烷取决于土壤中产甲烷古菌和甲烷氧化菌活动的平衡
结果(图 1)。 本文对近年来陆地生态系统中甲烷产生
和甲烷氧化研究的若干进展进行综述,并抛砖引玉提出
未来研究发展的建议和思考。
1摇 陆地生态系统甲烷产生的微生物机制
1.1摇 产甲烷古菌的研究进展
陆地生态系统包括许多自然和人为缺氧环境,如:湿地、水稻田、动物瘤胃、垃圾填埋场、厌氧生物反应器
等。 进入缺氧环境的有机物质一般经以下步骤进行分解:(1)水解作用,复杂有机物质转变成单糖类物质,并
进一步发酵成脂肪酸、CO2和 H2;(2)脂肪酸在互营氧化细菌(Syntrophs)的作用下氧化生成乙酸、CO2和 H2;
(3)乙酸、H2和 CO2分别被乙酸型和氢型产甲烷古菌利用产生甲烷[6]。 同型产乙酸细菌也可将 H2 / CO2转变
成乙酸,并由乙酸型产甲烷古菌转变成甲烷。 由此可见, 有机质厌氧降解由上述的厌氧食物链协同进行,甲
烷是厌氧食物链的最终产物,而产甲烷古菌是有机质厌氧降解食物链的末端成员。
产甲烷古菌分布十分广泛,从土壤到湖泊沉积物,从陆地到海洋,从零下低温环境到 100益以上的高温环
境[7],遍布地球大部分的缺氧环境,即使在氧气充足的沙漠区域,其土壤生物结皮中也存在活跃产甲烷古
菌[8],它们在地球碳素循环中扮演着重要角色。 近 10多年来,国内外针对产甲烷古菌的多样性和生态功能开
展了大量研究,取得了重要进展。
1.1.1摇 嗜冷嗜酸产甲烷古菌
地球约 75%的环境常年平均温度低于 5益 [9]。 低温产甲烷环境包括高纬度和高海拔的湿地、高山、湖泊
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沉积物、冰川、永久冻土以及深海沉积物等。 在陆地高寒生态系统,由于漫长时期的生物固碳(植物光合固
碳)、有机物沉积及其缓慢的生物降解, 土壤中储存了大量有机碳, 在全球碳平衡中起举足轻重的作用。 但
高寒生态系统对全球变化特别敏感。 一方面,全球气候变暖存在区域性差异,高寒区域的气候变暖速度高于
全球平均水平,最近 2012年的北极变暖速度约是全球平均水平的 2 倍[10]。 另一方面,甲烷排放通量的测定
表明,高寒生态系统存在活跃的产甲烷过程,例如:北半球西伯利亚苔原冻土平均每年排放大量甲烷。 而我国
青藏高原的若尔盖湿地,平均海拔 3500m,年平均气温约 1益,年平均甲烷排放量为 0.65 —1.0 Tg[11]。
自然环境的产甲烷途径可分为三种,即:利用氢气还原 CO2的氢型途径,通过乙酸裂解的乙酸型途径和利
用甲基类化合物的甲基型途径。 Kotsyurbenko等[12]研究发现, 在低温和底物浓度较高条件下,甲烷主要来源
于乙酸裂解途径。 Gro覻Kopf等[13]证明低温和高温条件下主要产甲烷古菌类型和产甲烷途径发生明显变化:
低温条件下以乙酸型的甲烷鬃菌占主导,而高温下则以能利用 H2 / CO2的甲烷胞菌和甲烷八叠球菌为主。 这
表明,温度在一定程度上影响产甲烷古菌的群落结构和代谢途径。 其原因可能与低温条件下氢气积累促进了
同型产乙酸菌生长,同型产乙酸菌与氢型产甲烷古菌竞争,将 H2 / CO2转变成乙酸;而在高温或中温条件下,氢
型产甲烷古菌比同型产乙酸菌具有更大的热力学优势,使氢型产甲烷途径渐渐占主导地位[3]。
根据产甲烷古菌的最适生长温度,产甲烷古菌可分为嗜热菌(最适温度 55益左右)、极端嗜热菌(最适温
度高于 80益)、嗜温菌(最适温度在 35益左右)和嗜冷菌(最适温度低于 25益)。 目前产甲烷古菌纯培养的研
究多数集中在中温和高温菌,对嗜冷产甲烷古菌的研究十分稀少[3]。 但近年来国内外学者已从南极和高寒
湿地等区域分离培养了若干嗜冷产甲烷古菌。 如美国学者从南极冰湖分离获得两株嗜冷产甲烷古菌,其中
Methanogenium frigidum的最适生长温度在 15益,倍增时间为 2.9d,超过 20益不能生长[14],而 Methanococcoides
burtonii的最适生长温度为 23益,高于 28益不能生长[15]。 我国学者从青藏高原若尔盖湿地分离获得了 1株嗜
冷产甲烷古菌 Methanolobus psychrophilus,其最适生长温度为 18益,在此条件下,甲醇转化的 Km 和 Vmax值可达
(87.5依0.4) 滋mol / L和(0.39依0.04) Mm / h,转化效率非常高,但高于 25益不能生长[16]。 为了理解嗜冷产甲烷
古菌对环境的适应机理,上述菌株的基因组和转录组都已进行了测序分析。 M. burtonii 的比较转录组分析表
明,在冷胁迫条件下,其 RNA结合蛋白呈现上调,使 RNA 数量能维持在适合翻译的水平,另有一些基因的转
录发生变化,预计可导致细胞表面发生重构,有助于适应冷胁迫条件[17]。 有意思的是 M. burtonii 对冷胁迫响
应最强烈的 10个转录子中有 7个为未知功能的编码基因[18]。 这暗示 M. burtonii可能利用新的冷适应机制。
高纬度和高海拔的沼泽和泥炭湿地,不仅常年低温,而且由于有机质的积累,其土壤多呈酸性条件。 大多
数产甲烷古菌生长的 pH 范围比较窄,接近中性,在 pH6.0—8.0 之间。 但也有一些嗜酸产甲烷古菌,例如
Kuzneceorii在早期的研究中发现一株产甲烷古菌,可在 pH4.0 条件下生长[19]。 Maestrojuan 和 Boone[20]发现
一些甲烷八叠球菌可在 pH4.5生长。 而 Patel等[21]获得一株甲烷杆菌纯培养(Methanobacterium espanolae)其
最适 pH为 5.5—6.0。 美国学者从酸性泥炭沼泽分离获得了 Methanoregula boonei(菌株 6A8T),其生长的最适
pH为 4.0—4.5 之间[22]。 这为研究理解酸性泥炭沼泽的中嗜酸产甲烷的机理提供重要生物材料。
1.1.2摇 第六产甲烷古菌目的发现
产甲烷古菌在分类上属于广域古菌门,在 1998年之前,学术界确认由 5 个分类目组成,分别为甲烷火球
菌目 (Methanopyrales )、甲烷球菌目 ( Methanococcales )、甲烷杆菌目 ( Methanobacteriales )、甲烷微菌目
(Methanomicrobiales)和甲烷八叠球菌目(Methanosarcinales)。 关于产甲烷古菌目的介绍可见表 1。 1998 年,德
国科学家通过 16S rRNA基因片段分析,首次在意大利水稻土中发现了一类新的产甲烷古菌[23],并将其命名
为 RC鄄I古菌。 通过系统发育和亲缘关系分析,发现 RC鄄I古菌是位于甲烷八叠球菌目和甲烷微菌目之间的深
度分枝[13]。 随后进一步研究发现 RC鄄I含有产甲烷途径中起关键作用的甲基辅酶 M 还原酶基因(mcrA) [24]。
基于 16S rRNA和 mcrA基因的大量研究表明 RC鄄I在环境中广泛分布,遍布全球不同陆地和沿海的生态系统。
尤其是世界各地的水稻田是 RC鄄I的主要栖居地之一。 对水稻土中古菌群落的分子分析表明,每克水稻土中
(干重)约有 106—107个 RC鄄I细胞,占总产甲烷古菌数量的 20%—50%[25]。 研究发现,与其他产甲烷古菌相
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比,RC鄄I更能适应低氢浓度条件[26];在 45—50益的高温条件下,RC鄄I 往往占据绝对优势[27]。 应用元基因组
学(Metagenomics)方法的研究发现 RC鄄I 还含有一系列编码抗氧化胁迫的基因,以及利用碳水化合物的基
因[28]。 对 mcrA基因在稻麦轮作土壤中的表达进行动态跟踪后,发现 RC鄄I 在排水、低温、有氧的条件下能够
保持相对较高的基因表达水平[29]。 RC鄄I古菌适应低氢、抗氧化以及利用有机物的特性使 RC鄄I在水稻土中具
备独特的选择性优势。
基于稳定同位探针技术(SIP)的研究证实水稻根际的 RC鄄I在甲烷形成过程中起关键作用[30]。 进一步研
究发现在水稻根际土壤,RC鄄I比其他氢型甲烷菌具有更高的细胞密度和甲烷产量[31]。 脂肪酸的互营氧化是
厌氧有机质降解的关键步骤,利用稳定同位素探针技术研究发现,RC鄄I 在水稻土中乙酸、丙酸和丁酸的互营
降解中都起关键作用,证实 RC鄄I 具有适应低氢条件的能力[27,32]。 通过研究氧气和硝酸盐对水稻土产甲烷菌
群落的胁迫影响,证实了 RC鄄I在水稻田中具有抗氧优势[27,33鄄34]。 这一系列研究表明 RC鄄I在水稻土甲烷产生
过程中可能起关键作用。
但是,尽管分子生态学的研究极大的丰富了人们对 RC鄄I 的认识,由于一直缺乏纯培养物,使研究人员无
法对 RC鄄I进行更为直接和深入的生理生态机制研究。 直到 2007年,日本研究人员通过利用互营共培养的方
法,从水稻土获得了首个 RC鄄I 的纯培养物,即菌株 SANAE[35]。 他们采用不同指标对 SANAE 进行鉴定,确定
其为产甲烷古菌的新种,命名为 Methanocella paludicola,并进一步确定其代表一个新目,即:甲烷胞菌目
(Methanocellales)。 2010年第二株纯菌 Methanocella arvoryzae MRE50被成功分离[36]。 经过数年努力,本文作
者的实验室于 2012年从中国水稻土获得了第三株纯菌,命名为 Methanocella conradii HZ254[37]。 与前两株纯
菌相比,HZ254菌株具有生长快速、易培养的特性,为深入研究甲烷胞菌的生理生化机制提供了良好的实验材
料。 至此,三株纯菌的分离培养确认了第六目产甲烷古菌的分类地位。 目前,三个甲烷胞菌菌株的基因组已
全部测序[38],其基因组、转录组和一系列生理生化的研究为深入理解甲烷胞菌目的生态功能提供了理论
基础。
1.1.3摇 第七产甲烷古菌目的发现
土壤生态系统栖息着不同类型的动物,包括小型动物如白蚁、蚯蚓等,它们在土壤有机物质分解和转化过
程中起非常重要的作用。 白蚁属于节肢动物,主要分布在热带和亚热带地区,以木材或纤维素为食。 大量基
于 16S rRNA 和 mcrA 分析的研究表明,白蚁肠道存在一类新型古菌,其系统发育关系与热原体目
(Thermoplasmatales)比较接近[39]。 追溯 Genebank 中相关的 16S rRNA 基因发现,这类古菌可能在深海沉积
物、水稻土、湖泊水体和沉积物、垃圾填埋场和厌氧反应器等中广泛存在。 不仅如此,这类古菌在瘤胃和哺乳
动物肠道中经常表现为优势菌群。 Mihajlovski 等[40]最早在人类肠道排泄物中探测到这类古菌,确定为产甲
烷古菌,并指出它们代表产甲烷古菌的一个新目。 Wright 等[41]也发现它们是牛瘤胃的主要产甲烷古菌。 这
些研究一定程度上反映了这类新型产甲烷古菌的广泛分布及潜在功能。
2012年,Dridi等[42]从人类粪便中分离获得了第一个纯培养物,命名为 Methanomassiliicoccus luminyensis,
并正式提出第七产甲烷古菌目,即:Methanomassiliicoccales。 目前,除这株纯菌外,研究人员还从白蚁[39],人类
肠道[43]及厌氧反应器[44]中获得了高度富集的第七产甲烷古菌目的培养物。 纯菌及这些富集培养物的基因
组和生理生化实验表明,它们属于甲基型产甲烷古菌,但拥有着独特的代谢特性。 和一般的专性甲基型产甲
烷古菌不同,它们缺少将 CO2还原为甲基辅酶 M的完整路径[45],因此这类菌需要额外添加氢气才能生长。 基
因组分析表明,它们含有一些基因,可利用 H2还原甲醇、甲胺、二甲胺等底物。 生理实验[46]进一步证实 M.
luminyensis在 H2存在条件下才能利用甲胺类物质(甲胺,二甲胺,三甲胺)进行生长。
因此,从营养角度看,第七产甲烷古菌目既不是典型甲基型产甲烷古菌,也不是氢型产甲烷古菌,属于两
者的混合营养型。
尽管在水稻土、湿地和湖泊沉积物等自然环境中经常探测到与第七产甲烷古菌目十分相似的 16S rRNA
基因片段,但它们是否在这些环境的甲烷产生和排放中起重要作用,目前尚不清楚。 但在草原反刍动物和热
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带亚热带森林土壤的白蚁肠道,这类产甲烷古菌的功能已越来越受到人们的关注。
表 1摇 产甲烷古菌目特征介绍
Table 1摇 Some characteristics of the methanogens orders
产甲烷菌目
Orders
甲烷火球菌目
Methanopyrales
甲烷球菌目
Methanococcales
甲烷杆菌目
Methanobacteriales
甲烷微菌目
Methanomicrobiales
甲烷八叠球菌目
Methanosarcinales
甲烷胞菌目
Methanocellales
第七产甲烷古菌目
Methanomassiliicoccales
代表性菌株
Representatives
Methanopyrus
Kandleri
Methanococcus
vannielii
Methanotorris
igneus
Methanobacterium
bryantii,
Methanobrevibacter
wolfeii,
Methanosphaera
stadtmanae
Methanoculleus
bourgensis,
Methanogenium
cariaci
Methanosarcina
barkeri,
Methanosaeta
concilii
Methanocella
paludicola,
Methanocella
arvoryzae,
Methanocella
conradii
Methanomassiliicoccus
luminyensis
底物
Substrates
H2+CO2 H2+CO2,甲酸
H2+CO2
(甲酸,CO,乙醇,
甲醇)
H2+CO2,甲酸
(乙醇)
甲醇,甲胺,
乙酸(H2+CO2)
H2+CO2,甲酸 H2+甲胺类物质(甲醇)
温度范围 / 益
Temperature
range
84—110 18—94 15—97 0—60 2—70 25—55 37
1.2摇 互营产甲烷过程研究进展
在水稻土和湿地环境,有机物质的厌氧降解主要包括水解、产酸和产甲烷三个过程,涉及初级发酵菌,次
级发酵菌,同型产乙酸菌,氢型和乙酸型产甲烷古菌五类功能微生物[47]。 互营产甲烷是整个过程中非常关键
的环节。 互营是一种特殊的共生关系,能够使两种不同代谢类型的微生物所释放的有限能量得到最大限度的
利用,有着重要的微生物生态学意义。 互营关系的建立及相互作用方式一直是国内外研究关注的焦点,尤其
体现在种间电子的传递机制上[48]。 它不仅决定了有机物质降解产甲烷过程的效率,还是产甲烷古菌与互营
菌克服热力学壁垒维持生长的关键环节[48鄄49]。
摇 图 2摇 互营产甲烷过程 H2载体电子传递及直接种间电子传递示
意图
Fig.2摇 Schematic diagrams of H2 mediated electron transfer and
direct interspecies electron transfer in syntrophic鄄methanogenic
associations摇
1.2.1摇 种间氢 /甲酸传递
在大多数互营产甲烷环境中,H2扮演了非常重要
的角色。 不仅分子量小、容易扩散,而且产甲烷古菌和
细菌体内还富含各种氢酶和脱氢酶,H2的形成和氧化
需要这些酶的作用[50鄄51]。 互营产甲烷过程的种间 H2转
移电子传递过程如图 2a所示。 胞内常见的氧化还原介
质有 NADH、FADH2和 Ferredoxins(Fd)等。 这些介质的
氧化和质子还原的能量问题是互营产甲烷途径的关
键[52]。 H+ / H2氧化还原电位较低(E0忆 = -414mV),NAD
+ / NADH 和 FADH / FADH2 的氧化还原电位分别为
-320mV和-220mV,而 Fd(ox) / Fd( red)维持在-398mV
或更低。 在标准状态下,上述氧化还原介质难以作为电
子供体还原 H+形成 H2,但如果能降低 H2分压直至低于
1Pa时,各反应的自由能可发生显著变化,有的从吸热
反应转变为放热反应。 这就表明,在互营产甲烷过程中,必须使 H2分压维持在很低的水平。 在产甲烷古菌与
互营氧化菌的互营体系中,互营氧化菌能够通过膜结合的甲酸脱氢酶将甲酸裂解产生 H2,而产甲烷古菌不断
消耗 H2维持自身生长,H2能够依赖氧化还原介质在种间发生传递从而降低整个反应体系的 H2分压,最终使
反应自发进行实现质子的还原和能量的转化。 产甲烷古菌大多利用 H2还原 CO2,菌体内细胞色素的存在与
否,对临界 H2分压有一定的影响[53],例如,不含细胞色素的产甲烷古菌能够使 H2维持在更低的水平,在互营
作用中起关键作用。
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然而 H2并非是电子传递的唯一载体,甲酸已被预测为是另一种电子穿梭体[54]。 甲酸不仅可以产生 H2,
直接参与 CH4的生成,而且甲酸 / CO2的氧化还原电位(- 432 mV)与 H
+ / H2的(-432 mV)相同。 目前种间 H2
或甲酸转移两种途径谁占主导并没有定论。 在不同自然或人工环境中,它们对互营产甲烷过程的相对贡献可
能有所不同,迅速发展的基因组和转录组学技术将有利于开展这方面的深入研究。
1.2.2摇 直接种间电子传递
直接种间电子传递(DIET)是近年来研究发现互营产甲烷过程中存在的新型电子传递机制。 早在 20 世
纪 80年代,Lovley等[55鄄56]证明了电子受体 Fe(芋)能够接受微生物释放至胞外的电子并产生超细粒磁铁矿,
开启了研究胞外直接电子转移(Direct extracellular electron transfer, DEET)的先河。 此后,有大量文献对
DEET的形成机制进行报道[57]。 DEET 指微生物将胞内产生的电子转移到胞外供电子受体接受发生反应。
常见的电子受体包括 Fe(芋)、Mn(郁)、腐殖质等不可溶物质,部分微生物可利用电极或另一类微生物细胞。
我们把以微生物为电子受体的胞外直接电子转移(DEET)称为直接种间电子传递(DIET)。 DIET 和 DEET 最
大的不同之处在于电子受体为微生物体内存在或分泌的细胞物质[55]。 DIET 如图 2b 所示。 有关 DIET 的证
据最早在地杆菌的共培养中发现[58]。 两株地杆菌在以乙醇为底物的共培养条件下能够形成直径 1—2 mm、
导电的二菌团聚体(dual鄄species aggregates),在排除种间氢转移的情况下,研究者推测二菌团聚体发生了种间
直接电子传递。 Morita等[59]在生物反应器的产甲烷过程中发现了类似现象,发现从上流式厌氧污泥床反应
器提取的微生物团聚体导电性是上述地杆菌团聚体的三倍,并且该体系无法实现氢转移途径,表明 DIET 是
互营产甲烷过程的另一种重要机制。
目前,DIET的机制主要包括以下几种。 一是通过细胞膜上的细胞色素 c 介导将电子传递给受体,
Summers等[58]证实地杆菌之间具有导电性的团聚体是依靠地杆菌细胞膜上的细胞色素 c 形成的。 而且通过
基因敲除的方法发现[57],地杆菌在细胞色素 c含量较低时无法进行胞外电子传递,进一步说明细胞色素 c 的
重要性。 二是通过菌毛(Pili)等细胞附属物[60]实现胞外电子传递,菌毛具有很强的导电性。 Malvankar 等[61]
发现菌毛蛋白能够作为分子导线实现电子传递。 三是主要借助自身所分泌的吩嗪类色素(Phenazine) [62]、核
黄素(Flavin) [63]和醌类(Quinones) [64]等氧化还原电子穿梭体实现电子传递。 此外,研究表明粒状活性炭[65]、
(半)导体铁氧化物[66]、生物炭[67]等材料对 DIET有极大的促进作用。
最近,本文作者的实验室利用富集培养的方法对水稻土壤中丁酸互营氧化产甲烷过程进行了研究[68]。
结果发现在富集培养体系中添加纳米磁铁矿显著促进了产甲烷过程,而如果使磁铁矿外表包裹一层 SiO2进行
绝缘处理,其对产甲烷过程的促进作用随即消失,这表明纳米磁铁矿的导电性起了重要作用。 进一步用纳米
石墨颗粒替代纳米磁铁矿,发现同样能对产甲烷过程起促进作用。 扫描电镜观察显示纳米颗粒紧密附着在不
同形态的细胞表面,将不同细胞联接起来。 这些结果首次表明种间直接电子传递可能在丁酸互营氧化过程中
起重要作用。 该发现具有重要实际意义,因为在土壤和沉积物等自然环境广泛分布着导电性纳米矿物,如磁
铁矿和黄铁矿等。 过去很多这些环境的研究忽略了无机矿物可能引起的特殊生态作用。
2摇 陆地生态系统甲烷氧化的微生物机理
甲烷氧化菌是一类独特的微生物,广泛分布在不同环境,它们能将甲烷彻底氧化成 CO2和水,是地球系统
甲烷排放的天然消减器。 最近 20年来,针对不同生态系统甲烷氧化菌的研究取得了显著进展。
好氧甲烷氧化菌传统上都属于变形细菌门(Proteobacteria),根据细胞的内膜结构、磷脂脂肪酸成分和碳
同化途径等可将好氧甲烷氧化菌分成玉型菌和域型菌。 玉型菌属 酌鄄变形细菌,利用 5鄄磷酸核酮糖同化途径
(RuMP),包括甲基杆菌(Methylobacter)、甲基球菌(Methylococcus)、甲基单胞菌(Methylomonas)、甲基微菌
(Methylomicrobium)和甲基八叠球菌(Methylosarcina)等 12属;域型菌属 琢鄄变形细菌,利用丝氨酸(Serine)同化
途径,包括甲基弯曲菌(Methylosinus)和甲基孢囊菌(Methylocystis)等 4 属[69鄄70]。 玉型菌可进一步分成玉a 亚
型和玉b亚型,玉b亚型菌(Methylococcus和 Methylocaldum)同时拥有 RuMP 和丝氨酸途径,因此兼有玉型菌和
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域型菌的碳同化特征。
2.1摇 新型甲烷氧化菌
2.1.1摇 厌氧甲烷氧化过程
近年来,甲烷氧化菌研究的重要进展之一是厌氧甲烷氧化菌的发现。 鉴于甲烷的化学稳定性,长期以来,
科学家认为环境中不可能存在无氧参与的甲烷氧化。 但是生物地球化学方面的证据不断显示深海沉积物中
可能存在厌氧甲烷氧化过程[71]。 美国微生物学家 DeLong领导的研究小组利用稳定同位素探针技术,首次发
现古菌可能催化了海底沉积物的厌氧甲烷氧化[72],随后他们采用次级离子质谱技术(SIMS)证实厌氧甲烷氧
化依靠一类由硫酸盐还原菌和未培养古菌(ANME)组成的互营复合体[73]。 通过元基因组学(Metagenomics)
分析,该小组最终发现厌氧甲烷氧化实际上是产甲烷过程的逆向代谢过程[74]。 最近,德国学者发现未培养古
菌 ANME鄄2实际上具备独立完成硫酸盐还原和甲烷氧化两个过程的能力[75]。 厌氧甲烷氧化的另一个重大突
破是发现淡水沉积物中存在依赖于反硝化过程的厌氧甲烷氧化[76]。 根据热力学原理,与反硝化耦合的厌氧
甲烷氧化比与硫酸盐还原耦合的甲烷氧化更具有热力学优势。 因此,研究者推测在淡水沉积物中可能存在依
赖于反硝化过程的厌氧甲烷氧化。 荷兰学者最早获得了反硝化甲烷氧化富集物,并通过环境转录组研究发
现,反硝化甲烷氧化菌实际上拥有一套完整的好氧甲烷氧化途径,并拥有一套除 N2O还原酶以外的所有反硝
化基因[77]。 据此,他们推测反硝化甲烷氧化菌同时执行了反硝化和好氧甲烷氧化两个过程,表明环境中可能
存在一条全新的甲烷氧化途径。
2.1.2摇 疣微菌纲甲烷氧化菌
近年来甲烷氧化菌研究的另一重要突破是发现了属于疣微菌纲 (Verrucomicrobia)的好氧甲烷氧化菌。
疣微菌广泛分布在好氧和厌氧环境中,包括水稻土和湖泊沉积物。 但目前分离培养的纯菌十分罕见。 2007
至 2008年,国际上三个独立研究小组分别从富含甲烷的地热环境(温泉等)分离纯化了能进行好氧甲烷氧化
的疣微菌[78鄄80],这是研究者首次发现不属于变形细菌的好氧甲烷氧化菌。 疣微菌的分类地位如图 3 所示。
尽管地域起源不同,三株疣微菌的 16S rRNA基因相似度高达 98%以上,因此被归为同一个新属,命名为甲基
嗜酸菌(Methylacidiphilum) [81]。 这些氧化菌具有嗜热和极端嗜酸特点,缺乏好氧甲烷氧化菌特有的皱褶内膜
结构,但基因组含有三个完整的 pmoCAB操纵子以及一个单独的 pmoC 拷贝。 甲烷氧化疣微菌的发现显著拓
宽了对好氧甲烷氧化菌多样性的认识,但这类氧化菌是否在水稻土和其它生境中存在并具有氧化功能目前还
不清楚。 用磷脂脂肪酸稳定同位素标记的研究显示,在垃圾填埋土中一些在变形细菌中不常见的脂肪酸信号
分子如 i14:0磷脂脂肪酸受到同位素标记[82],在水稻根际的研究中也发现类似现象[83],这些研究可能预示甲
烷氧化疣微菌在非极端环境的生态功能。
2.2摇 甲烷氧化菌的生理生态特征
2.2.1摇 高亲和力甲烷单加氧酶
甲烷氧化在许多环境都能发生,即使在甲烷浓度很低的森林土和旱地土(大气甲烷浓度)也能检测到活
跃的甲烷氧化过程。 但至今为止纯培养研究无法解释大气甲烷浓度下的甲烷氧化。 最近,基因组研究揭示有
些甲烷氧化菌实际上拥有两套 pmo基因即 pmoCAB1和 pmoCAB2,其基因序列差异可达 70%以上[85]。 以上提
到的甲烷氧化疣微菌即拥有两套 pmo基因。 两套同工酶基因的存在暗示甲烷单加氧酶对甲烷的亲和力可能
存在差异,德国学者的研究证实了这一假设[86]。 他们发现甲烷氧化菌 pmoCAB1 只在甲烷浓度大于 600滋L / L
时才起作用(低亲和力),而 pmoCAB2能在甲烷浓度小于 10 滋L / L条件下保持活性(高亲和力)。 过去大量生
态生理的研究忽略了 pmoCAB2的功能。 显然,甲烷氧化菌如果拥有两套不同亲和力的酶,则它们的环境适应
能力将显著提高。 对纯菌分析表明大部分域型菌拥有两套 pmo 基因,而玉型菌往往只有 pmoCAB1。 这种差
异可能影响它们在土壤生态系统的群落结构和功能。
2.2.2摇 乙酸代谢能力
长期以来,学术界认为甲烷氧化菌是严格的 C1利用者(甲烷和甲醇等),不可能利用多碳化合物如乙酸。
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图 3摇 甲烷氧化菌分类[84]
Fig.3摇 16S rRNA gene phylogeny of the obligate aerobic methane oxidizing bacteria[84]
但最近有人发现了两个新的甲烷氧化菌(Methylocella 和 Methylocapsa),能利用乙酸作为独立的碳源和能源。
进一步研究发现在湿地土壤中广泛存在的甲基孢囊菌属(Methylocystis)具有乙酸利用能力,且在甲烷存在时,
乙酸利用效率更高[87]。 甲烷氧化菌的乙酸利用能力具有重要生态学意义,因为在湿地和水稻土,乙酸是有机
质降解的主要中间产物,而这些环境中甲烷生产通常呈现明显的季节性变化,乙酸利用能力可使这些甲烷氧
化菌具有更强的生存适应能力。
2.2.3摇 厌氧发酵作用
除乙酸利用能力外,一些甲烷氧化菌还可能拥有更为复杂的厌氧代谢能力,最近有研究表明在低氧
(5%—10% O2)条件下,甲基孢囊菌能利用甲烷在胞内合成羟基丁酸聚合物(PHB)。 当环境条件由低氧变成
无氧时,甲烷氧化菌能用 PHB进行厌氧发酵[88],供生存需要。 另外,厌氧发酵产生的发酵产物包括乙酸、丙
酮和琥珀酸可释放到环境,供其它微生物利用,形成由甲烷驱动的食物链[89]。 PHB是许多细菌抵御不良环境
的能量储备物质,拥有 PHB代谢能力将使甲烷氧化菌更能适应有氧与无氧交替变化的环境。
另外,作者实验室的研究发现玉型氧化菌主要分布在水稻的根际和表层土,而域型菌则在下层无氧区域
占优势[90]。 不少研究也表明域型菌更能适应低氧环境[91]。 但是,这些生态分布特点是否与域型菌的厌氧代
谢有关,有待进一步研究。
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3摇 展望
甲烷产生和氧化是陆地生态系统碳循环的重要环节。 纵观过去 20年来国内外对甲烷产生和氧化过程及
其微生物的研究,可以看出,为了理解不同环境中甲烷产生和氧化过程的机制,并探索起关键作用的微生物种
类和生理生态功能,研究工作已经取得了许多突破性进展,发现了一系列新型产甲烷古菌和甲烷氧化菌,揭示
了特殊生理生态机制。 这些创新突破十分依赖于关键科学问题的牵引、研究方法与技术的发展以及多学科交
叉发展的推动。 未来研究的科学问题如下:
第一,甲烷产生和氧化微生物适应环境变化的机理和理论。 微生物不断改变环境,并受到变化环境的影
响不断适应环境。 微生物对环境变化的适应机理是土壤微生物学的基本科学命题,但目前尚未形成相关理论
体系。 过去大量研究探索了环境因子对甲烷产生和氧化微生物群落结构和功能的影响,但大部分工作停留在
群落水平,在分子和细胞水平的研究相对缺乏。 如何从分子和细胞水平通过尺度放大,探究甲烷产生和氧化
微生物与环境之间的相互作用关系,揭示对环境变化的适应机理,将是未来相关研究的重要挑战。
第二,甲烷产生和氧化微生物的新型菌群和代谢途径。 大量环境微生物学的研究表明,目前已知的微生
物种类不足实际存在的 1%。 这暗示环境中可能仍存在大量未知的甲烷产生和氧化微生物。 新型微生物种
类极有可能拥有新的代谢途径,包括全新的甲烷产生和氧化途径以及微生物种间相互作用关系。 过去的研究
进展已经证明这一观点。 无疑,新型菌种及新途径的发现将继续成为未来研究的焦点。
第三,研究方法的创新发展和学科交叉。 近年来,一系列新的研究方法和技术,包括:环境基因组和转录
组学分析及其与 SIP 技术的结合、单细胞分离培养和测序技术、NanoSIMS 技术(高分辨率二级离子质谱)、电
化学研究方法和超分辨率荧光显微镜技术等正在迅速发展。 这些方法技术的发展与应用,无疑将推动甲烷产
生和甲烷氧化微生物的研究取得更多创新与发展。
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