全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(3): 431−438 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由黑龙江省教育厅科技项目(11521021), 国家自然科学基金项目(31171578), 黑龙江省重点实验室开放课题项目(NSGJ2009-02)
和黑龙江省高校科技创新团队建设计划项目(2011TD005)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 才华, E-mail: caihua@neau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: annabelle_biology@yeah.net
Received(收稿日期): 2013-03-01; Accepted(接受日期): 2013-10-18; Published online(网络出版日期): 2014-01-16.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140116.1608.003.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00431
转 GsCBRLK/SCMRP双价基因苜蓿耐碱性及氨基酸含量分析
赵 阳 朱延明 柏 锡 纪 巍 吴 婧 唐立郦 才 华*
东北农业大学农业生物功能基因重点实验室, 黑龙江哈尔滨 150030
摘 要: 从野生大豆盐碱胁迫基因表达谱中筛选并克隆到 GsCBRLK基因, 与人工合成的高甲硫氨酸含量 SCMRP基
因构建成双价植物表达载体, 将其转入苜蓿, 获得超量表达的转基因苜蓿, 并进行耐碱性分析。结果显示, 经过 100、
150 mmol L–1 NaHCO3处理 14 d后, 转基因株系生长状态良好, 而非转基因对照株系萎蔫、失绿、甚至死亡; 转基因
株系的丙二醛含量和相对质膜透性显著低于非转基因株系(P<0.05), 而 SOD 酶活性显著高于非转基因对照(P<0.05),
说明超量表达 GsCBRLK 基因增强了苜蓿的耐碱能力; 各转基因株系的甲硫氨酸含量均比对照植株高, 表明 SCMRP
基因的导入提高了苜蓿叶片甲硫氨酸的含量。
关键词: CBRLK; SCMRP; 转基因苜蓿; 氨基酸含量; 耐碱性
Over-expressing GsCBRLK/SCMRP Enhances Alkaline Tolerance and Me-
thionine Content in Transgenic Medicago sativa
ZHAO Yang, ZHU Yan-Ming, BAI Xi, JI Wei, WU Jing, TANG Li-Li, and CAI Hua*
Key Laboratory of Agricultural Biological Functional Genes, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China
Abstract: Drought and saline-alkaline stresses, significantly affect growth and productivity of plants. The reaction of plant to
environmental stresses is controlled by numerous genes via transcriptional regulation and protein phosphorylation. A
stress-responsive kinase gene, GsCBRLK, has been cloned from a Glycine soja cDNA library under salinity, drought, and cold
stresses. Over-expression of GsCBRLK in transgenic Arabidopsis resulted in enhanced tolerance to high salinity and ABA.
SCMRP is a kind of storage protein gene coding high-sulfur-containing amino acid. In this study, we constructed an expression
vector BEOCBRLK-SCMRP and transformed both GsCBRLK and SCMRP genes into alfalfa. The transgenic alfalfa grew well
after NaHCO3 treatment (100 and 150 mmol L–1) for 14 days; whereas, the wild type plants exhibited discoloration and stunted
growth, even death. The MDA content and relative membrane permeability caused by alkaline stress in transgenic plants varied
significantly compared to those in the wild type (P < 0.05). Moreover, the superoxide dismutase (SOD) activity in transgenic
plants under alkali stress increased than that of the wild type. Amino acid content assay showed that the transformants had higher
methionine content than the non-transformed plants. These results indicated that the transgenic alfalfa carrying both GsCBRLK
and SCMRP possesses enhanced alkaline tolerance and rich methionine simultaneously.
Keywords: CBRLK; SCMRP; Transgenic alfalfa; Methionine content; Alkaline tolerance
紫花苜蓿(Medicago sativa)是一种优良的豆科
牧草, 其营养价值相当于豆类作物, 在我国的种植
面积约有 133万公顷[1]。近年来, 随着我国畜牧业的
发展, 对优质苜蓿的需求进一步加大。虽然苜蓿是
中等耐盐作物, 但其耐力有限, 由于土壤严重盐碱
化, 极大地制约了苜蓿产业的发展。因此亟需培育
耐盐碱性强的苜蓿品种, 满足畜牧产业日益发展的
需求。
转基因技术已在改善苜蓿品质, 提高抗病[2-4]、
抗虫[5-7]、抗除草剂[8-10]及抗逆性[11-15]等方面应用。
然而, 功能明确的、可用于苜蓿耐碱基因工程的基
因资源还很有限。Yang等[16]首次从野生大豆中分离
432 作 物 学 报 第 40卷


GsCBRLK(钙 /钙调素调控的受体类蛋白激酶 , cal-
cium-dependent calmodulin-binding receptor-like
kinase)基因, 经验证, GsCBRLK 基因的超量表达提
高了拟南芥耐盐性, 降低了对 ABA的敏感性。深入
研究发现 , GsCBRLK 的 N 端 CaM 结合结构域
(147~169 位氨基酸)可与钙调素结合并且依赖 Ca2+;
Ca2+的存在可以强烈激活其自磷酸化活性, 同时钙
调素与 GsCBRLK 蛋白结合正调控蛋白自磷酸化和
底物磷酸化[16]。由此可见, 该基因在高盐、ABA信
号传导途径中, 通过钙离子和钙调素传递信号, 起
着重要的调控作用。然而, 该基因在碱胁迫反应中
是否有作用，能否提高植物耐碱性，目前尚不明确。
紫花苜蓿营养丰富, 干草约含 16%蛋白质和 8%
矿物质, 以及丰富的胡萝卜素和多种维生素, 在畜
牧业生产中占有重要的地位, 以“牧草之王”著称。在
同等种植面积上, 紫花苜蓿提供的可消化总养料、
可消化蛋白质和矿物质分别是禾本科牧草的 2.0、2.5
和 6.0倍。但是, 豆科植物蛋白质缺乏含硫氨基酸[17],
而含硫氨基酸是反刍动物必需氨基酸。饲料中含硫
氨基酸增加, 可使羊毛产量增加 20%左右; 与其他
氨基酸配合使用, 可使牛奶、牛肉产量显著提高, 其
作用是其他氨基酸不可替代的[18]。因此, 提高饲料
作物中含硫氨基酸的含量, 调节氨基酸的均衡, 成
为饲料作物育种的关键问题之一。1991年, Schroeder
等[19]首次将含硫氨基酸的鸡卵清蛋白基因转入苜蓿,
并在转基因植株中检测到鸡卵清蛋白显著增加。
2000 年, 吕德扬等[20]通过农杆菌介导法将高含硫氨
基酸蛋白(HNP)基因转入苜蓿 , 明显提高了转基因
植株含硫氨基酸的含量。2005年, Avraham等[21]将拟
南芥胱硫酸 γ-合成酶 (AtCGS)基因转入紫花苜蓿 ,
结果发现多种代谢相关氨基酸含量增加。
SCMRP是根据大豆密码子偏爱性, 利用生物信
息学方法对来源于玉米的 MRZP 基因修饰和改造,
获得的具有高表达活性、并能在植物中稳定表达的
新基因 [22-23]。大豆遗传转化实验结果表明 , 转
SCMRP大豆的甲硫氨酸含量明显提高[24]。
在已有研究基础上 , 本研究利用经改造的
SCMRP 基因和耐盐基因 GsCBRLK, 构建组成型双
价基因植物表达载体, 将 GsCBRLK/SCMRP 基因借
助农杆菌介导法转化农菁 1 号苜蓿, 以期获得耐碱
性及甲硫氨酸含量同时提高的转基因苜蓿新材料 ,
并为 GsCBRLK 基因的耐碱功能验证和应用潜力探
索提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens) EHA105、质粒 pBEOM、
pCGEM 均由东北农业大学农业生物功能基因重点
实验室保存。
1.2 植物表达载体的构建
利用 EcoR I单酶切载体 pCGEM, 得到 SCMRP
基因 , 连接到含有 CBRLK 基因的表达载体
pBEOMCBRLK上。鉴定连接正反向, 构建双价基因
(GsCBRLK-SCMRP)组成型植物表达载体 pBEO-
CBRLK-SCMRP。采用冻融法将重组质粒导入农杆
菌 EHA105, 用于苜蓿的遗传转化。
1.3 苜蓿遗传转化及植株再生
以 8 日龄无菌苗的子叶节为外植体, 在盛慧等[25]
苜蓿转化方法的基础上略改进, 用 0.5 mg L–1草铵
膦(glufosinate-ammonium, 购自 Sigma 公司)为筛选
剂。将再生植株移栽到草炭土∶沙土=2∶1 的花盆
中, 于温室培养(24℃, 600 μmol s–1 m–2, 16 h d–1光照,
80%相对湿度)。
1.4 分子生物学鉴定
以转基因苜蓿叶片 DNA 为模板, 根据 SCMRP
基因的全长序列设计特异引物 MVP-S 和 MVP-AS
(5′-CAGCAGGGTCTCGCTTCACT-3′和 5′-GCAGAT
TCCAATGCCACAAT-3′)进行 PCR 检测。PCR 产物
长度为 358 bp。
选取 PCR 阳性的转基因株系, 进行 GsCBRLK-
SCMRP双价基因转录水平分析。参照 RNAprep Pure
Plnat Kit (TIANGEN, 北京)提取苜蓿叶片总 RNA。
取 2 μg总 RNA, 应用 SuperScript III Reverse Tran-
scriptase (Invitrogen, USA)合成 cDNA 第一链。以
GsCBRLK-SCMRP基因的特异引物GsCBRLK-SQ-S,
GsCBRLK-SQ-AS (5-GCACCAGGGAGACAACCA
CG-3; 5-CATATGTCTTATGCCTATTCTTCCTACC-3)
和 MVP-S, MVP-AS 进行半定量 RT-PCR。以苜蓿
GPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,
GenBank 登录号为 MTR_4g131180)为内参基因, 引
物为 S: 5-GTGGTGCCAAGAAGGTTGTTAT-3和
AS: 5-CTGGGAATGATGTTGAAGGAAG-3。
取 RT-PCR阳性植株进行 Western blot检测。在
蛋白的 N-末端设计 GsCBRLK编码蛋白特异性多肽
(N-Term: KKTPAPSLHQSNQRQKNC), 委托哈尔滨
赛拓生物公司合成及制备多克隆抗体。参见陈富成
第 3期 赵 阳等: 转 GsCBRLK/SCMRP双价基因苜蓿耐碱性及氨基酸含量分析 433


等[26]的方法, 提取植物叶片总蛋白, 并进行 Western
blot检测[27]。以野生大豆总蛋白为阳性对照, 非转基
因苜蓿总蛋白为阴性对照。目标蛋白约为 50 kD。
1.5 转基因苜蓿碱胁迫处理
剪取带有 2~3 个节点的茎段扦插扩繁。待茎段
生根后, 选取生长状态良好且一致的扩繁苗, 移栽
到含有蛭石∶珍珠岩=1∶1 的小钵中, 分别用含有
100 mmol L–1 和 150 mmol L–1 NaHCO3 的 1/8
Hoagland营养液(pH值分别为 8.0和 8.5)处理, 每 2 d
更换一次营养液, 14 d后观察记录表型。
1.6 耐碱性相关生理生化指标检测
采用硫代巴比妥酸 (TBA)比色法测定丙二醛
(MDA)含量[28]。采用 NBT比色法[29]检测 SOD酶活
性, 以抑制 NBT氧化还原 50%消耗的酶为 1个活性
单位。参照 Gibon等[30]的方法, 用 DDSJ-308A电导
率仪(中国上海)检测相对质膜透性。
1.7 氨基酸含量的测定
取苜蓿地上部分材料 , 于烘箱 105℃下杀青
15 min, 80℃烘至恒重; 将烘干的样品粉碎过 60~80
目筛, 称样 100 mg; 加 6 mol L–1 HCl 6~8 mL, 充氮
气, 封口; 110℃烘箱水解 22 h; 冷却, 摇匀过滤, 以
双蒸水定容至 50 mL, 润洗 3次以上; 取 1 mL将其
冻干并加 0.02 mol L–1 HCl溶液 1 mL振荡摇匀; 以
18 407×g离心 15 min, 吸上清 0.8 mL, 过 0.45 μm滤
膜后上机检测[31]。用全自动氨基酸分析仪(日本日立,
型号 L-8800)测量氨基酸含量。
2 结果与分析
2.1 转基因苜蓿的获得
双价基因组成型植物表达载体 pBEOCBRLK-
SCMRP (图 1)使用烟草花叶病毒 CaMV35S 启动子
分别调控双价基因, 以 bar基因作为筛选标记基因。
使用能增强翻译的 omega调控元件及 E12增强子[32],
有利于外源基因在受体植物中的高效表达。
采用农杆菌介导法转化苜蓿 , 对草铵膦筛选
得到的抗性植株进行 PCR鉴定 , 获得 PCR阳性植
株 55株。阳性对照和转基因植株中均扩增出大小为
358 bp的目的片段, 而阴性对照中无扩增带(图 2)。

图 1 植物表达载体 pBEOCBRLK-SCMRP结构图谱
Fig. 1 Sketch map of plant expression vector pBEOCBRLK-SCMRP

图 2 转基因苜蓿 PCR分析
Fig. 2 PCR analysis of transgenic alfalfa leaf
M: DL2000 marker; –: 阴性对照; NT: 非转基因株; +: 阳性对照; 1~23: 部分转基因株系。
M: DL2000 marker; –: negative control; NT: non-transgenic plants; +: positive control; 1–23: partial transgenic lines.

为了筛选 GsCBRLK 基因超量表达的转基因苜
蓿, 随机选取 5个 PCR阳性植株进行半定量RT-PCR
检测(图 3)。结果显示, GsCBRLK和 SCMRP2个基因
在转基因苜蓿中均能超量表达, 而非转基因对照株
系中未检测到阳性信号。
图 4显示, 1~5号转基因株系均有 50 kD大小的
免疫印迹条带, 表明 GsCBRLK 基因已经转入苜蓿
中并能正常表达。
2.2 碱胁迫下转基因苜蓿的形态
由于紫花苜蓿是典型异花授粉四倍体植物, 通
过种子繁殖难以获得遗传稳定的纯合体, 本研究采
用茎节扦插扩繁的方式, 获得大量可用于耐碱性分
析的材料。从 RT-PCR阳性株系中选取表达量较高
的 2个株系 CS-16和 CS-21进行表型分析。在未处
434 作 物 学 报 第 40卷



图 3 转 GsCBRLK and SCMRP基因苜蓿半定量 RT-PCR分析
Fig. 3 RT-PCR analysis of GsCBRLK and SCMRP expressions
in leaf of transgenic alfalfa
NT: 非转基因株; 1~5: 转基因株系, 其中 4道为 CS-16, 5道为
CS-21。
NT: non-transgenic plants; 1–5: transgenic plants, includinglines
CS-16 (lane 4) and CS-21 (lane 5).

图 4 转基因苜蓿 Western blot分析
Fig. 4 Western blotting analysis of transgenic alfalfa
NT: 非转基因株; +: 阳性对照; 1~5: 转基因株系; 其中 4道为
CS-16, 5道为 CS-21。
NT: non-transgenic plants; +: positive control; 1–5: transgenic
plants, includinglines CS-16 (lane 4) and CS-21 (lane 5).

理条件下, 转 GsCBRLK 基因苜蓿与非转基因苜蓿
的生长状态并无明显差异(图 5-A), 100 mmol L–1和
150 mmol L–1 NaHCO3 处理 14 d 后, 转基因株系
CS-16 和 CS-21 的生长状态明显好于非转基因对照
(图 5-B, C)。经 150 mmol L–1 NaHCO3处理后, 差异
更明显, 转基因株系 CS-16 和 CS-21 虽受轻度影响,
但均能保持良好的生长状态, 而非转基因对照株系
则明显萎蔫、失绿甚至死亡(图 5-C)。
胁迫处理前后植株的株高和生物量(图 6)表明,
所有株系的株高随碱处理浓度的增大而逐渐下降 ,
但转基因株系 CS-16 和 CS-21 的下降幅度均小于非
转基因株系, 而在 150 mmol L–1 NaHCO3处理条件
下 , 转基因株系 CS-16 和 CS-21 的株高分别是
40.58 cm和 40.81 cm, 较非转基因株系 34.35 cm有
显著差异(P<0.05)。同样, 各株系地上部分及根系的
鲜重, 经过碱胁迫处理后均有所下降, 但 2个转基因
株系的生物量均显著地高于非转基因对照(P<0.05)。
由此进一步说明转 GsCBRLK 基因苜蓿具有较强的
耐碱能力。

图 5 转基因苜蓿碱胁迫表型分析
Fig. 5 Phenotypes of transgenic alfalfa under alkali stress
A: 无胁迫对照; B和 C: 100和 150 mmol L–1 NaHCO3处理 14 d;
NT: 非转基因株; CS-16和 CS-21: 转基因株系。
A: no stress control; B and C: 100 and 150 mmol L–1 NaHCO3
treated for 14 days; NT: non-transgenic plants; CS-16 and CS-21:
transgenic lines.


2.3 碱胁迫下转基因苜蓿的生理生化指标
2.3.1 NaHCO3胁迫对苜蓿叶片细胞膜透性的影响
图 7-A表明, 随着NaHCO3胁迫浓度的增加, 转
基因和非转基因株系的 MDA 含量均随之增加, 在
高 pH 值(pH 8.5)处理下 , 2 个转基因苜蓿株系的
MDA 含量增加幅度显著低于非转基因对照(P<0.05),
从而说明超量表达 GsCBRLK 基因可降低 NaHCO3
胁迫对细胞膜造成的氧化损伤。
相对质膜透性是反映细胞膜伤害程度的另一重
要指标。图 7-B 表明, 转基因和非转基因苜蓿相对
质膜透性均随 NaHCO3 胁迫浓度的增加而升高, 但
在 150 mmol L–1 NaHCO3处理下, 2个转基因株系相
对质膜透性的增加幅度与未转基因对照差异显著
(P<0.05)。结合 MDA 的结果, 说明 NaHCO3胁迫会
加速膜脂氧化, 并对细胞膜造成损害, 而 GsCBRLK
基因的超量表达, 减弱细胞膜的损伤及膜脂氧化程
度, 从而提高苜蓿的耐碱能力。
2.3.2 NaHCO3胁迫对苜蓿 SOD活性的影响 图
8 表明 , 正常条件下 , 转基因和非转基因株系的
SOD活性没有显著差异, 但在 NaHCO3胁迫条件下,
转基因和对照株系的 SOD活性均有提高, 当 NaHCO3
浓度达 100 mmol L–1时差异极显著(P<0.01)。说明
第 3期 赵 阳等: 转 GsCBRLK/SCMRP双价基因苜蓿耐碱性及氨基酸含量分析 435



图 6 NaHCO3胁迫对转基因苜蓿株高和生物量的影响
Fig. 6 Changes of plant height and biomass of transgenic alfalfa under NaHCO3 stress
柱形上不同字母表示相同处理条件下株系间有显著差异(P<0.05)。
Different letters above columns indicate significant difference among lines under the same condition (P<0.05).

图 7 转基因苜蓿的 MDA含量及相对质膜透性
Fig. 7 MDA content and relative membrane permeability of transgenic alfalfa
柱形上不同字母表示相同处理条件下株系间有显著差异(P<0.05)。
Different letters above columns indicate significant difference among lines under the same condition (P<0.05).


图 8 碱胁迫下转基因苜蓿的 SOD活性
Fig. 8 SOD activity in transgenic plant under NaHCO3 stress
标以不同字母表示在 P<0.01水平上差异显著。
Bars superscripted by different letters are significantly different at
the 0.01 probability level.

较低浓度 NaHCO3胁迫即可调控 SOD的活性以增强
活性氧清除的能力, 而GsCBRLK基因超量表达极大
提高了转基因株系的 SOD活性, 降低了碱胁迫对植
株造成的氧化伤害。
2.4 碱胁迫下转基因苜蓿的氨基酸含量
分析了转基因及非转基因苜蓿叶片中 16种氨基
酸含量(表 1)。2 个转基因株系甲硫氨酸含量均比较
未转基因对照高, 但天冬氨酸含量分别降低 1.03%
和 1.02%, 说明转基因株系中 SCMRP基因的超量表
达增加了苜蓿叶片中甲硫氨酸的含量。至于天冬氨
酸含量下降的原因还有待进一步研究。
3 讨论
蛋白激酶是一类磷酸转移酶, 在信号传导中通
过磷酸化调控底物蛋白的活性 , 使信号逐渐放大 ,
从而引起细胞反应[33]。蛋白激酶的重要功能之一是
参与环境胁迫信号的传递, 通过植物细胞的信号传
导因子及调节机制使植物避免盐环境的迫害[34]。然
而, 蛋白激酶在碱胁迫信号中的传导和调节机制的
研究报道很少[35]。来源于野生大豆的 GsCBRLK 基
因可以提高拟南芥对盐胁迫的抗性[16], 但其是否能

436 作 物 学 报 第 40卷


表 1 转基因苜蓿叶片氨基酸含量
Table 1 Content of amino acids in transgenic alfalfa (%)
氨基酸
Amino acid
NT CS-16 CS-21
Asp 6.91±0.39 5.88±0.85* 5.89±0.54
Thr 6.48±0.00 6.08±0.21 5.97±0.10
Ser 3.65±0.05 3.52±0.08 3.54±0.11
Glu 8.74±0.09 8.70±0.08 8.58±0.16
Gly 19.28±0.20 19.14±0.55 19.79±0.74
Ala 9.40±0.07 9.44±0.12 9.58±0.25
Cys 3.88±0.05 3.83±0.08 3.91±0.11
Met 0.97±0.04 2.50±0.24** 2.10±0.68*
Ile 4.16±0.10 4.06±0.08 4.10±0.06
Leu 8.38±0.10 8.44±0.17 8.19±0.21
Tyr 1.53±0.27 1.29±0.09 1.28±0.75
Lys 6.98±0.10 7.02±0.21 7.12±0.06
His 3.49±0.09 3.62±0.05 3.52±0.05
Arg 4.96±0.03 5.08±0.14 4.82±0.14
Pro 9.51±0.01 9.40±0.36 10.00±0.32
和**分别代表转基因株系(CS-16 或 CS-21)与未转基因对照
(NT)之间有显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)差异。
* and ** indicate significant difference between the transgenic
line (CS-16 or CS-21) and the non-transformed control (NT) at P <
0.05 and P < 0.01 levels, respectively.

够提高苜蓿的耐碱性并未报道。本研究表明 ,
GsCBRLK 在碱胁迫反应中也起重要的正调控作用,
经过信号传导, 最终提高 SOD 酶的活性, 减弱了膜
脂氧化的程度, 稳定了离子平衡, 降低了碱胁迫对
植物细胞膜的伤害, 提高转基因植物的耐碱性。因
此, 该基因可通过超量表达用于豆科植物耐碱基因
工程。
细胞质膜是细胞与外界环境之间物质和能量交
换的第一道屏障。所以, 当细胞受到环境胁迫时, 质
膜必然首先接触到环境因子。逆境伤害时, 质膜的
选择透性因而增大, 细胞内的电解质外渗, 导致离
子交换系统混乱, 破坏了细胞内的离子平衡。相对
电导率变化可反映出质膜的伤害程度和植物抗逆性
的强弱。在胁迫下, 植物细胞会产生大量的活性氧,
在活性氧的作用下, 膜脂发生过氧化反应而产生丙
二醛(MDA)[36], 其含量也可反映植物遭受逆境伤害
的程度[37]。对应于细胞遭受活性氧的毒害, 植物体
内形成了一系列的酶促和非酶促反应机制。超氧歧
化酶(SOD)在植物抗氧化胁迫中具有清除氧自由基、
维持活性氧代谢平衡的功能 , 是防止膜脂过氧化 ,
保护膜系统的关键酶[38]。因而, 可以利用以上 3 个
生理生化指标来衡量逆境胁迫条件下细胞膜的损
伤、膜脂氧化的程度和活性氧清除能力, 评价植物
的耐逆性[39]。本研究发现, 在碱胁迫反应中, 以上 3
个指标同盐胁迫一样也发生了相应的变化, 并且在
耐碱的转基因株系和不耐碱的对照中存在显著性差
异, 由此表明, 以上 3 个生理生化指标也可作为植
物耐碱性评价的基本指标。
在豆科植物苜蓿中含硫氨基酸的含量非常低 ,
而含硫氨基酸又是动物所必需的氨基酸。为了改善
这种不均衡的状况, 本研究利用经过人工改造的甲
硫氨酸 SCMRP 基因[23]转入苜蓿植株, 有效地提高
了苜蓿中甲硫氨酸的含量。但是, SCMRP 基因的导
入也导致天冬氨酸含量的下降, 却不影响另一种含
硫氨基酸——半胱氨酸的含量, 最终保证转基因苜
蓿含硫氨基酸总含量的增加。至于天冬氨酸含量下
降的具体原因还有待进一步研究。
本研究通过双价基因的同时导入, 最终获得了
耐碱性和甲硫氨酸含量均提高的转基因苜蓿新材
料。由此表明, 在苜蓿基因工程领域, 可以通过双价
乃至多价基因的联合导入而达到多效的转基因育种
的目的。然而, 在选用多基因时, 不可忽视基因之间
可能存在的拮抗和多个基因在同一个转基因植株中
的转录和表达水平不一致等问题[40], 相信这些问题
将在未来的实践中解决。
4 结论
构建双价基因组成型植物表达载体 pBEOCBRLK-
SCMRP; 获得超量表达的转 GsCBRLK-SCMRP基因
苜蓿; GsCBRLK的超量表达提高了转基因苜蓿的耐
碱性, SCMRP 基因的表达提高了转基因苜蓿甲硫氨
酸含量。
References
[1] 耿华珠. 中国苜蓿. 北京: 中国农业出版社, 1995. pp 1–5
Geng H Z. Alfalfa in China. Beijing: China Agriculture Press,
1995. pp 1–5 (in Chinese)
[2] Samac D A, Smigocki A C. Expression of oryzacy statin I and II
in alfalfa increases resistance to the root-lesion nematode. Phy-
topathology, 2003, 93: 799–804
[3] Hipskind J D, Pavia N L. Constitutive accumulation of resvera-
trol glucoside in transgenic alfalfa increases resistance to Phoma
medicaginis. Mol Plant Microbe Interact, 2000, 13: 551–562
[4] Guo D G, Chen F, Wheeler J, Winder J, Selman S, Peterson M,
Dixon R A. Improvement of in-rumen digestibility of alfalfa
forage by genetic manipulation of lignin O-methl transferases.
Transgenic Res, 2001, 10: 457–464
[5] Strizhov N, Keller M, Mathur J, Koncz-Kálmán Z, Bosch D,
Prudovsky E, Schell J, Sneh B, Koncz C, Zilberstein A. A syn-
thetic cryIC gene, encoding a Bacillus thuringiensis delta-
endotoxin, confers Spodoptera resistance in alfalfa and tobacco.
Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93: 15012–15022
第 3期 赵 阳等: 转 GsCBRLK/SCMRP双价基因苜蓿耐碱性及氨基酸含量分析 437


[6] Thomas J C, Wasmanm C C, Echt C, Dunn R L, Bohnert H J,
Mccoy T J. Introduction and expression of an insect proteinase
inhibitor in alfalfa Medicago sativa L. Plant Cell Rep, 1994, 14:
31–36
[7] Narvaez V J. Orozco-Cardenas M L, Ryan C A. Differential ex-
pression of a chimeric CaMV-tomato proteinase Inhibitor I gene
in leaves of transformed nightshade, tobacco and alfalfa plants.
Plant Mol Biol, 1992, 20: 1149–1157
[8] Donn G, Tischer E, Smith J A, Goodman H M. Herbicide resistant
alfalfa cells: an example of gene amplication in plants. Mol Appl
Genet, 1984, 2: 621–635
[9] D’Halluin K, Botterman J, de Greef W. Engineering of herbi-
cide-resistant alfalfa and evaluation under field conditions. Crop
Sci, 1990, 30: 866–871
[10] Padgette S R, Kolacz K H, Delannay X, Re D B, LaVallee B J,
Tinius C N, Rhodes W K, Otero Y I, Barry G F, Eichholtz D A,
Peschke V M, Nida D L, Taylor N B, Kishore G M. Development,
identification, and characterization of a glyphosate-tolerant soy-
bean line. Crop Sci, 1995, 35: 1451−1461
[11] 秦智慧, 晁跃辉, 杨青川, 康俊梅, 孙彦, 王凭青, 龙瑞才. 紫
花苜蓿锌指蛋白基因 RNAi 表达载体的构建及在苜蓿的转化.
作物学报, 2010, 36: 596−601
Qin Z H, Chao Y H, Yang Q C, Kang J M, Sun Y, Wang P Q,
Long R C. Construction and transformation of RNAi vector of
MsZFN gene from alfalfa (Medicago sativa L.). Acta Agron Sin,
2010, 36: 596−601 (in Chinese with English abstract)
[12] 安宝燕, 罗琰, 李加瑞, 乔卫华, 张宪省, 高新起. 紫花苜蓿
Na+/H+逆向转运蛋白基因在拟南芥中表达提高转基因植株的
耐盐性. 作物学报, 2008, 34: 557−564
An B Y, Luo Y, Li J R, Qiao W H, Zhang X S, Gao X Q. Expres-
sion of a vacuolar Na+/H+ antiporter gene of alfalfa enhances sa-
linity tolerance in transgenic arabidopsis. Acta Agron Sin, 2008,
34: 557−564 (in Chinese with English abstract)
[13] Winicov I. Alfin1 transcription factor overexpression enhances
plant root growth under normal and saline conditions and im-
proves salt tolerance in alfalfa. Planta, 2002, 210: 416−422
[14] Tesfaye M, Temple S J, Allan D L, Vance C P, Samac D A.
Overexpression of malate dehydrogenase in transgenic alfalfa
enhances organic acid synthesis and confers tolerance to alumi-
num. Plant Physiol, 2001, 127: 1834−1844
[15] Samac D A. The influence of organic acid exudation in alfalfa on
aluminum tolerance, nutrient acquisition and bacterial diversity.
ISB News Rep, 2003, 11: 6−8
[16] Yang L, Ji W, Zhu Y M, Gao P, Li Y, Cai H, Bai X, Guo D J.
GsCBRLK, a calcium/calmodulin-binding receptor-like kinase, is
a positive regulator of plant tolerance to salt and ABA stress. J
Exp Bot, 2010, 61: 2519–2533
[17] Pickering F S, Reis P J. Effects of abomasal supplements of me-
thionine on wool growth of grazing sheep. J Exp Agric, 1993, 33:
7−12
[18] Reis P J. Effects of amino acids on the growth and properties of
wool. In: Black J L ed. Physiological and Environmental Limita-
tions to Wool Growth. Armidale: University of New England
Publishing Unit, 1979. pp 223−242
[19] Schroeder H E, Khan M R I, Knibb W R, Spencer D, Higgins T J
V. Expressing of chicken ovalbumin gene in three Lucerne culti-
vars. J Plant Physiol, 1991, 18: 495−505
[20] 吕德扬, 范云六, 俞梅敏, 唐顺学, 侯宁, 汪清. 苜蓿高含硫
氨基酸蛋白转基因植株再生. 遗传学报, 2000, 27:331−337
Lü D Y, Fan Y L, Yu M M, Tang S X, Hou N, Wang Q. Regenera-
tion of HNP transgenic alfalfa plants by agrobacterium mediated
gene transfer. Acta Genet Sin, 2000, 27: 331−337 (in Chinese
with English abstract)
[21] Avraham T, Badani H, Galili S, Amir R. Enhanced levels of me-
thionine and cysteine in transgenic alfalfa (Medicago sativa L.)
plants overexpressing the Arabidopsis cystathionine γ-synthase
gene. Plant Biotechnol J, 2005, 3: 71−79
[22] 朱延明, 柏锡, 才华, 纪巍, 李勇, 季佐军. 提高大豆蛋氨酸
含量的人工序列及其植物表达载体 : 中国专利 , 编号
200910073162.7. 2010-04-28
Zhu Y M, Bai X, Cai H, Ji W, Li Y, Ji Z J. Artificial Sequence of
Methionine Improved Content in Soybean and Expression Vector
Construction. Chinese patent, No. 200910073162.7 [2010-04-28]
(in Chinese)
[23] 翟红, 柏锡, 朱延明, 陈秀华. SCMRP基因原核表达及多克隆
抗体制备. 东北农业大学学报, 2009, 40(7): 60−65
Zhai H, Bai X, Zhu Y M, Chen X H. Protokaryotic expression of
SCMRP gene and preparation of polyclonal antibody. J Northeast
Agric Univ, 2009, 40(7): 60−65 (in Chinese with English ab-
stract)
[24] 张凤. 转 SCMRP基因大豆的遗传稳定性分析及环境安全性初
步评价. 东北农业大学硕士学位论文, 2012
Zhang F. Field Test and Genetic Stability Analysis of Transgenic
SCMRP Soybean Lines. MS Thesis of Northeast Agricultural
University, Harbin, China 2012 (in Chinese with English abstract)
[25] 盛慧, 朱延明, 李杰, 柏锡, 才华. DREB2A基因对苜蓿遗传转
化的研究. 草业科学, 2007, 24(3): 40−45
Sheng H, Zhu Y M, Li J, Bai X, Cai H. Genetic transformation of
DREB2A gene into alfalfa. Pratac Sci, 2007, 24(3): 40−45 (in
Chinese with English abstract)
[26] 陈富成, 祁建民, 徐建堂, 陈涛, 陶爱芬, 林培清, 陈美霞, 郭
英, 李华丽. 圆果种黄麻功能叶总蛋白提取方法及双向电泳
体系的优化. 作物学报, 2011, 37: 369−373
Chen F C, Qi J M, Xu J T, Chen T, Tao A F, Lin P Q, Chen M X,
Guo Y, Li H L. Optimization of extraction method and two-
dimensional electrophoresis conditions for proteome analysis of
jute functional leaf. Acta Agron Sin, 2011, 37: 369−373 (in Chi-
nese with English abstract)
[27] Sambrook J, Russell D W. Molecular Cloning: a Laboratory
Manual, 3rd edn. New York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 2001. pp 1713−1726
[28] Hodges D M, DeLong J M, Forney C F, Prange R K. Improving
the thiobarbituric acid-reactive-substances assay for estimating
lipid peroxidation in plant tissues containing anthocyanin and
other interfering compounds. Planta, 1999, 207: 604–611
[29] Health R L, Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts:
I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Arch
Biochem Biophys, 1968, 125: 1892–1981
[30] Gibon Y, Larher F. Cycling assay for nicotinamide adenine dinu-
cleotides: NaCl precipitation and ethanol solubilization of the re-
duced tetrazolium. Anal Biochem, 1997, 251: 153–157
[31] 魏正巍. 耐盐碱GsGST13SCMRP和GsCBRLKSCMRP双价基
438 作 物 学 报 第 40卷


因对苜蓿的遗传转化及转基因植株的培育. 东北农业大学硕
士论文, 2012
Wei Z W. The Transformation of Saline-Alkaline Stress Gene into
Alfalfa and the Creation of Transgenic Plants. MS Thesis of
Northeast Agricultural University, Harbin, China, 2012 (in Chi-
nese with English abstract)
[32] Mitsuhara I, Ugaki M, Hirochika H, Ohshima M, Murakami T,
Gotoh Y, Katayose Y, Nakamura S, Honkura R, Nishimiya S,
Ueno K, Mochizuki A, Tanimoto H, Tsugawa H, Otsuki Y, Ohshi
Y. Efficient Promoter cassettes for enhanced expression of for-
eign genes in dicotyledonous and monocotyledonous plants.
Plant Cell Physiol, 1996, 37: 49–59
[33] Garrett R H. Biochemistry 3rd ed. Beijing: Higher Education
Press, 2005
[34] 杨靓. 野生大豆渗透胁迫相关蛋白激酶基因的克隆及功能分
析. 东北农业大学博士学位论文, 2010
Yang L. Isolation and Functional Analysis of Protein Kinase
Genes Relevant to Osmotic Stress in Glycine soja. PhD Disserta-
tion of Northeast Agricultural University, Harbin, China, 2010 (in
Chinese with English abstract)
[35] 魏正巍, 朱延明, 化烨, 才华, 纪巍, 柏锡, 王臻昱, 文益东.
转GsPPCK1基因苜蓿植株的获得及其耐碱性分析. 作物学报,
2013, 39: 68−75
Wei Z W, Zhu Y M, Hua Y, Cai H, Ji W, Bai X, Wang Z Y, Wen Y
D. Transgenic alfalfa with GsPPCK1 and its alkaline tolerance
analysis. Acta Agron Sin, 2013, 39: 68−75 (in Chinese with Eng-
lish abstract)
[36] 高文俊, 徐静, 谢开云, 董宽虎. Na2CO3和 NaHCO3胁迫下冰
草的生长及生理响应. 草业学报, 2011, 20(4): 299−304
Gao W J, Xu J, Xie K Y, Dong K H. Physiological responses of
Agropyron cristatum under Na2CO3 and NaHCO3 stress. Acta Pra-
tac Sin, 2011, 20(4): 299−304 (in Chinese with English abstract)
[37] 李源, 刘贵波, 高洪文, 孙桂枝, 赵海明, 谢楠. 紫花苜蓿种
质耐盐性综合评价及盐胁迫下的生理反应. 草业学报, 2010,
19(4): 79−86
Li Y, Liu G B, Gao H W, Sun G Z, Zhao H M, Xie N. A compre-
hensive evaluation of salt tolerance and the physiological re-
sponse of Medicago sativa at the seedling stage. Acta Pratac Sin,
2010, 19(4):79−86 (in Chinese with English abstract)
[38] 张海娜, 李小娟, 李存东, 肖凯. 过量表达小麦超氧化物歧化
酶(SOD)基因对烟草耐盐能力的影响. 作物学报, 2008, 34:
1403−1408
Zhang H N, Li X J, Li C D, Xiao K. Effects of overexpression of
wheat superoxide dismutase (SOD) genes on salt tolerant capa-
bility in tobacco. Acta Agron Sin, 2008, 34: 1403−1408 (in Chi-
nese with English abstract)
[39] 王玉祥, 张博, 王涛. 盐胁迫对苜蓿叶绿素、甜菜碱含量和细
胞膜透性的影响. 草业科学, 2009, 26(3): 53−56
Wang Y X, Zhang B, Wang T. Effect of salt stress on the contents
of chlorophyll and betaine and its membrane permeability of
Medicago sativa. Pratac Sci, 2009, 26(3): 53−56 (in Chinese
with English abstract)
[40] 李宝健, 朱华晨. 论应用多基因转化策略综合改良生物体遗
传性研究方向的前景 . 中山大学学报(自然科学版), 2005,
44(4): 79−83
Li B J, Zhu H C. On the prospects of applying the multi-gene
transformation strategy (MTS) to modify the inheritance of or-
ganisms: II. General principles, possible problems and prospects
of the MTS. Acta Sci Nat Univ Sunyatseni (Nat Sci Edn), 2005,
44(4): 79−83 (in Chinese with English abstract)