全 文 ：书转犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘基因双价苜蓿的耐盐性分析
吴婧，才华，柏锡，纪巍，魏正巍，唐立郦，赵阳，朱延明
（东北农业大学农业生物功能基因重点实验室，黑龙江 哈尔滨１５００３０）
摘要：本研究是将从野大豆盐碱胁迫基因表达谱中筛选得到的犌狊犌犛犜１３基因和采用生物信息学方法改造的高甲
硫氨酸蛋白基因犛犆犕犚犘构建成双价植物表达载体，通过农杆菌介导法转化农菁１号苜蓿，获得超量表达的转基
因苜蓿，并对其中２个转基因苜蓿株系进行耐盐性分析及氨基酸组分分析。结果显示，转基因苜蓿具有较强的耐
盐性，表现为随着盐浓度的升高，野生型苜蓿盐害不断加重，生长发育受抑制，叶片逐渐变黄、卷曲、萎蔫，而转基因
苜蓿只受到轻微影响，仍能正常生长。转基因株系的丙二醛含量和过氧化氢含量显著低于非转基因株系（犘＜
０．０５），而株高，鲜重，ＧＳＴ活性和ＳＯＤ活性显著高于非转基因对照（犘＜０．０５，犘＜０．０１）；同时株系Ｇ１６和Ｇ５０的含
硫氨基酸含量分别比野生型植株提高了０．５７％和０．５２％。说明超量表达犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘 基因增强了苜蓿的
耐盐性，并提高了含硫氨基酸含量。
关键词：转基因苜蓿；犌狊犌犛犜１３基因；犛犆犕犚犘基因；耐盐
中图分类号：Ｓ８１６；Ｓ５４１＋．１０３．４；Ｑ９４５．７８ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００４５７５９（２０１４）０１０２５７０９
犇犗犐：１０．１１６８６／ｃｙｘｂ２０１４０１３１
我国是世界上主要的盐碱地国家之一，盐碱地面积约４０００万ｈｍ２，土壤盐渍化严重影响农牧业生产和生态
环境［１］。因此培育耐盐碱作物品种，充分利用盐碱地资源是推动农牧业生产发展的有效手段。紫花苜蓿（犕犲犱犻
犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪）作为栽培牧草，是农牧业结合的纽带。其营养丰富，产量高，同时具有适应性广、抗盐性强的特性，是
改良和利用盐碱地的主要植物［２３］。然而苜蓿的耐盐碱性有限，其耐盐程度有待进一步提高［４］。因此通过转基因
手段培育耐盐碱苜蓿，对于发展畜牧业、改善生态环境具有重要作用［５］。
ＧＳＴ（谷胱甘肽Ｓ转移酶，ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）是一类植物普遍存在多功能酶。这类酶用于催化谷胱
甘肽与毒性生物异源物质或氧化产物结合，从而促进此类物质的代谢、区域化隔离或清除［６］。大量研究表明，它
的表达不仅受生物胁迫［７］的影响，还受干旱［８］、冷［９］、重金属离子［１０］、盐［１１］和除草剂安全剂［１２］等非生物胁迫的诱
导。而参与非生物胁迫的机制是降低细胞体内活性氧（ｒｅａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）水平，从而减轻非生物胁迫
对植物的损伤［１３］。本实验室（东北农业大学农业生物功能基因重点实验室）前期应用基因芯片技术建立野生大
豆（犌犾狔犮犻狀犲狊狅犼犪）盐碱胁迫基因表达谱，并构建了盐碱胁迫基因调控网络，从中筛选出２８个位于关键调控节点的
胁迫应答基因，其中包括３个ＧＳＴ家族基因犌狊犌犛犜１３，犌狊犌犛犜１１４，犌狊犌犛犜１９［１４］。并系统的研究了３个基因的耐
盐碱功能。其中将犌狊犌犛犜１４，犌狊犌犛犜１９转入苜蓿，增强了苜蓿的耐碱性［６，１５］。而犌狊犌犛犜１３（ＧＱ２６５９１１）基因可
以提高烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋犪犫犪犮狌犿）对ＮａＣｌ和干旱胁迫的耐性［７］。但其转入苜蓿是否能够提高苜蓿的耐盐性，有
待进一步研究。
苜蓿中含硫氨基酸匮乏，严重影响了苜蓿的营养价值和商业价值［１６］。因此提高苜蓿含硫氨基酸的含量对于
改善苜蓿的品质具有重要作用。犛犆犕犚犘（专利号Ｎｏ：ＣＮ２００９１００７３１６２．７）基因是利用生物信息方法改造的高甲
硫氨酸蛋白基因，适合在豆科植物中表达［１７］。但该基因转入苜蓿是否能够提高苜蓿的含硫氨基酸含量有待研
究。
本研究将犌狊犌犛犜１３和犛犆犕犚犘基因构建双价植物表达载体，采用农杆菌介导法将其转化到农菁１号苜蓿
第２３卷 第１期
Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１
草 业 学 报
ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ
２５７－２６５
２０１４年２月
收稿日期：２０１３０２２２；改回日期：２０１３０３２５
基金项目：国家自然科学基金项目（３１１７１５７８），黑龙江省高校科技创新团队建设计划项目（２０１１ＴＤ００５），黑龙江省重大科技攻关项目
（ＧＡ０６Ｂ１０３３），东北农业大学创新团队项目（ＣＸＴ００４１）和黑龙江省重点实验室开放课题资助项目（ＮＳＧＪ２００９０２）资助。
作者简介：吴婧（１９８７），女，蒙古族，辽宁义县人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ａｚａａｚａｎｌ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｙｍｚｈｕ２００１＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ
（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪ｃｖ．ＮｏｎｇｊｉｎｇＮｏ．１）。并对转基因苜蓿在盐胁迫下的表型、生理指标进行分析，同时进行氨基
酸含量分析。旨在获得质量及品质均改良的苜蓿品种，并阐明犌狊犌犛犜１３基因在苜蓿中的耐盐能力，为耐盐苜蓿
品种的筛选提供参考依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
大肠杆菌ＤＨ５α、农杆菌ＥＨＡ１０５、植物表达载体ｐＣＧＥＭＳＣＭＲＰ，ｐＣＧＢＥＧｓＧＳＴ１３均由东北农业大学农
业生物功能基因重点实验室构建保存；转化受体为农菁１号苜蓿［１８］，由黑龙江省农业科学院草业研究所提供。
１．２ 方法
１．２．１ 植物表达载体的构建 在植物表达载体ｐＣＧＥＭＳＣＭＲＰ上利用ＥｃｏＲⅠ单酶切得到犛犆犕犚犘基因，连
接到带有犌犛犜１３基因的植物表达载体ｐＣＧＢＥＧｓＧＳＴ１３上，构建双价植物表达载体ｐＢＥＯＧＳＴ１３／ＳＣＭＲＰ。其
中犌狊犌犛犜１３基因由烟草花叶病毒Ｅ１２ＣａＭＶ３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ调控，而犛犆犕犚犘基因由双３５Ｓ启动子调控，以犫犪狉
作为筛选标记基因，构建高水平组成型植物表达载体。采用冻融法将重组质粒导入农杆菌ＥＨＡ１０５，用ＳＣＭＲＰ
Ｓ／ＳＣＭＲＰＡＳ对转化子进行基因特异性引物ＰＣＲ检测，阳性菌用于苜蓿的遗传转化。
１．２．２ 犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘基因对苜蓿的遗传转化及再生植株的获得 在盛慧等［１９］的农杆菌介导方法基础上
略做改进，进行苜蓿遗传转化。经过种子萌发、无菌苗获得、子叶节农杆菌共培养、抗性不定芽诱导及筛选（草胺
膦ｇｌｕｆｏｓｉｎａｔｅ，０．５ｍｇ／Ｌ）、诱导生根，驯化移栽等过程。
１．２．３ 转基因苜蓿植株的分子生物学鉴定 分子生
物学检测，包括ＰＣＲ检测和ＲＴＰＣＲ检测。ＰＣＲ检
测：以抗性植株的总ＤＮＡ为模板，以植物表达载体质
粒ＤＮＡ为阳性对照，分别以水和未转基因植株的总
ＤＮＡ为阴性对照，用筛选标记基因犫犪狉及其启动子序
列设计特异引物。选取ＰＣＲ阳性的转基因植株，进行
犌狊犌犛犜１３和犛犆犕犚犘 转录水平分析。以苜蓿犌犃犘
犇犎 （ＧｅｎＢａｎｋ登录号为 ＭＴＲ＿４Ｇ１３１１８０）基因为内
参基因。引物序列如表１。
１．２．４ 盐处理下转基因苜蓿的表型分析 实验于
２０１２年６月中旬－８月底在东北农业大学香坊农场
２７号温室内进行。
参照魏正巍等［２０］的方法，略有改动。选取生长状
表１ 引物序列
犜犪犫犾犲１ 犘狉犻犿犲狉狊犲狇狌犲狀犮犲狊
基因名
Ｇｅｎｅｎａｍｅ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
犌犃犘犇犎 Ｆｏｒｗａｒｄ ５′ＧＴＧＧＴＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧＴＴＧＴＴＡＴ３′
Ｒｅｖｅｒｓｅ ５′ＣＴＧＧＧＡＡＴＧＡＴＧＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧ３′
犛犆犕犚犘 Ｆｏｒｗａｒｄ ５′ＣＡＧＣＡＧＧＧＴＣＴＣＧＣＴＴＣＡＣＴ３′
Ｒｅｖｅｒｓｅ ５′ＧＣＡＧＡＴＴＣＣＡＡＴＧＣＣＡＣＡＡＴ３′
犌狊犌犛犜１３ Ｆｏｒｗａｒｄ ５′ＧＣＣＣＡＴＴＴＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧ３′
Ｒｅｖｅｒｓｅ ５′ＴＴＡＧＡＣＣＡＧＡＡＡＣＧＡＧＣＣ３′
犫犪狉 Ｆｏｒｗａｒｄ ５′ＴＧＣＡＣＣＡＴＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＴＣＧ３′
Ｒｅｖｅｒｓｅ ５′ＣＣＡＧＣＴＧＣＣＡＧＡＡＡＣＣＣＡＣＧＴＣＡＴＧ３′
Ｆｏｒｗａｒｄ：上游；Ｒｅｖｅｒｓｅ：下游．
态良好的转犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘基因植株和野生型（ＷＴ）植株枝条，剪取有２～３个节点的茎段于生根粉中浸泡２
ｈ左右。插入底部打孔的盛有普通土∶草炭土∶蛭石（１∶１∶１）的塑料大盆内１．５ｃｍ左右，定期喷灌。两周后
长出不定根，继续培养两周选取生长状态良好且一致的扩繁苗，移栽到含有相同基质的小钵中，每钵１株，用１／８
Ｈｏａｇｌａｎｄ营养液培养，缓苗１个月后，将转基因和野生型材料各分成３组，每组１０株单株，设３次重复。分别用
含有０，２００，３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理，每２ｄ更换一次营养液，１５ｄ后观察记录表型，并对植株株高，鲜重进行测
量。盐处理后直接用尺子测量苜蓿植株的株高，鲜重的测定将各处理苜蓿植株从营养钵中小心取出用水冲洗掉
其根部附着的蛭石并用吸水纸吸干其表面水珠剪开苗的根系和地上部分，于天平上称重。每株系每处理取样１０
株，取其平均值，实验做３次重复。
１．２．５ 转基因植株相关生理指标的检测 采用硫代巴比妥酸（ＴＢＡ）［２１］比色法测定丙二醛（ＭＤＡ）含量，参照
Ｒａｏ等［２２］的方法提取苜蓿叶片总蛋白，略作改动，采用考马斯亮蓝法检测蛋白含量。参照 Ｍａｕｃｈ和Ｄｕｄｌａｒ［２３］的
方法检测ＧＳＴ活性。采用ＮＢＴ比色法［２４］检测ＳＯＤ活性。采用Ｔａｌａｒｃｚｙｋ等［２５］的方法测定过氧化氢 （Ｈ２Ｏ２）
含量。
８５２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１
１．２．６ 转基因植株的氨基酸分析 采用氨基酸全自动分析仪，样品处理采用ＨＣｌ（６ｍｏｌ／Ｌ）水解法［２６］。
１．３ 数据统计分析
所有生理指标设置３次重复，用狋检验检测。和表示转基因株系和野生型株系间差异的统计学意义
（表示在犘＜０．０５水平差异有统计学意义，表示犘＜０．０１水平差异有统计学意义）。
２ 结果与分析
２．１ 植物表达载体构建及抗性植株的获得
植物表达载体ｐＢＥＯＧＳＴ１３／ＳＣＭＲＰ构建如图１，对转化子进行ＥｃｏＲⅠ酶切鉴定，由图２泳道４可以看出，
酶切得到约１２０００和２０００ｂｐ的两条带，证明载体构建正确。重组质粒命名为ｐＢＥＯＧＳＴ１３／ＳＣＭＲＰ。采用冻融
法将重组质粒导入农杆菌ＥＨＡ１０５，用于下一步的苜蓿遗传转化。采用根癌农杆菌介导法转化苜蓿（图３），共得
到了５４株抗性植株。
图１ 植物表达载体狆犅犈犗犌犛犜１３／犛犆犕犚犘构建
犉犻犵．１ 犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉狆犅犈犗犌犛犜１３／犛犆犕犚犘
２．２ 抗性植株的分子检测
图２ 植物表达载体狆犅犈犗犌犛犜１３／犛犆犕犚犘
的酶切鉴定结果
犉犻犵．２ 犐犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉
狆犅犈犗犌犛犜１３／犛犆犕犚犘
Ｍ：ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒ；１～４：ｐＢＥＯＧＳＴ１３／ＳＣＭＲＰ的ＥｃｏＲⅠ酶切鉴
定ＥｎｚｙｍｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＢＥＯＧＳＴ１３／ＳＣＭＲＰｗｉｔｈＥｃｏＲⅠ．
对得到抗性植株进行ＰＣＲ检测，部分ＰＣＲ鉴定
如图４所示，阳性对照和转基因植株均扩增出约４５０
ｂｐ片段。初步证明基因已整合到苜蓿基因组中。对
筛选得到的１７株ＰＣＲ阳性植株进行转录水平分析。
ＲＴ－ＰＣＲ分析结果显示，共获得了４株犌狊犌犛犜１３和
犛犆犕犚犘基因均超量表达的转基因苜蓿（图５）。
２．３ 盐处理下转基因苜蓿的表型分析
由于苜蓿的生长周期长，并且是开放式异花授粉，
不便于获得苜蓿种子。因此，采用无性扦插繁殖的方
式研究转基因苜蓿的耐盐性。在ＲＴ－ＰＣＲ阳性植株
中选取犌狊犌犛犜１３基因表达量最高和最低的２个株系
９５２第２３卷第１期 草业学报２０１４年
Ｇ１６和Ｇ５０，进行表型分析。将转基因和野生型苜蓿株系分别用０，２００，３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理１５ｄ后发现，在正
常条件下（０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ），转基因苜蓿与野生型苜蓿生长状态良好且大致相同（图６Ａ），表明犌狊犌犛犜１３／犛犆犕
犚犘基因的导入并未对苜蓿的生长发育造成影响。在２００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫下野生型苜蓿盐害较轻，叶片逐渐
变黄，而转基因株系生长良好（图６Ｂ）。在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ胁迫条件下，野生型苜蓿盐害比较严重，生长发育
受抑制，叶片逐渐变黄、卷曲、萎蔫，而转基因苜蓿只受到轻微影响，仍能正常生长，耐盐表现明显好于野生型苜蓿
（图６Ｃ）。
图３ 苜蓿遗传转化及植株再生
犉犻犵．３ 犌犲狀犲狋犻犮狋狉犪狀狊犳狅狉犿犪狋犻狅狀犪狀犱狆犾犪狀狋狉犲犵犲狀犲狉犪狋犻狅狀狅犳犕．狊犪狋犻狏犪
Ａ：工程菌液制备犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；Ｂ：种子春化后萌发Ｓｅｅｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎａｆｔｅｒｖｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ；Ｃ：萌发７～８日龄无菌苗 Ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ７－８
ｄａｙｓｏｆａｓｅｐｔｉｃｓｅｅｄｌｉｎｇ；Ｄ：农杆菌侵染子叶节犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；Ｅ：共培养阶段Ｃｏｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｔｉｍｅ；Ｆ：除菌筛选后不定芽诱导 Ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ
ｂｕｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｆｔｅｒａｓｅｐｔｉｃｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；Ｇ：抗性芽伸长Ｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｈｏｏｔｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ；Ｈ：抗性苗生根Ｒｏｏｔｐｌａｎｔｌｅｔｓ；Ｉ：驯化移栽后成活的再生植株 Ｄｏ
ｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔ．
图４ 转犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘抗性植株的犘犆犚鉴定
犉犻犵．４ 犘犆犚犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳狉犲狊犻狊狋犪狀狋狆犾犪狀狋狊狋犺犪狋狋狉犪狀狊犳狅狉犿犲犱狑犻狋犺犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘
Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ；＋：质粒ＤＮＡＰｌａｓｍｉｄＤＮＡ；－：水对照Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ（ｄｄＨ２Ｏ）；Ｃ：未转基因植株阴性对照 Ｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎ
ｔｒｏｌ；１～１６：抗性植株Ｒｅｓｉｓｔａｎｔｌｉｎｅｓ．
０６２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１
图５ 转基因犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘植株的犚犜－犘犆犚检测
犉犻犵．５ 犚犜－犘犆犚犻犱犲狀狋犻犳犻犮犪狋犻狅狀狅犳犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮狆犾犪狀狋狊
ＷＴ：野生型植株 Ｗｉｌｄｔｙｐｅｐｌａｎｔｓ；Ｇ１２，Ｇ１３，Ｇ１６，Ｇ５０：转基因植株Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓ．下同Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．
图７Ａ，图７Ｂ表明，所有株系的株高与鲜重均随盐
图６ 转犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘基因苜蓿盐胁迫表型分析
犉犻犵．６ 犛狋狉犲狊狊狆犺犲狀狅狋狔狆犲犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳犌狊犌犛犜１３／
犛犆犕犚犘狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪犾犳犪犾犳犪
处理浓度的增高而逐渐下降，但转基因株系Ｇ５０和Ｇ１６
的下降幅度均小于野生型。其中在 ２００ ｍｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ处理条件下，转基因株系Ｇ１６的株高显著高于野
生型（犘＜０．０５），而转基因株系Ｇ５０的鲜重显著高于野
生型（犘＜０．０５）。在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理条件下２
个转基因株系的株高和鲜重均显著地高于野生型
（犘＜０．０５，犘＜０．０１）。由此进一步说明转犌狊犌犛犜１３／
犛犆犕犚犘 基因苜蓿具有较强的耐盐能力。
２．４ 盐胁迫条件下转犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘 基因苜蓿
相关生理指标的分析
为了验证超量表达犌狊犌犛犜１３基因的株系是否在
盐胁迫下能够提高谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）活性，进行
了ＧＳＴ活性的测定。结果显示：在正常条件下，２个
转犌狊犌犛犜１３基因株系的ＧＳＴ活性与野生型相比存在
显著差异 （犘＜０．０１）（图８Ａ），说明犌狊犌犛犜１３基因在
转基因植株中得到了超量表达；随着 ＮａＣｌ胁迫浓度
的增加，转基因和野生型苜蓿株系的ＧＳＴ活性均被诱
导升高，但转基因株系的ＧＳＴ活性均显著高于野生型
株系（犘＜０．０１）。说明随着胁迫浓度增加，超量表达
的犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘 基因增强了盐胁迫条件下转基
因苜蓿的ＧＳＴ活性，其保护细胞免受氧化中毒功能启
动，从而增强了转基因植株的耐盐能力。
超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）是参与清除植物体内活性
氧的重要机制之一［２７］。如图８Ｂ所示，胁迫１５ｄ后，在０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理下，各株系的ＳＯＤ活性无明显差异。
在盐胁迫下各株系的ＳＯＤ活性增强，转基因株系Ｇ５０和Ｇ１６株系的ＳＯＤ活性均显著高于野生型（犘＜０．０５，犘＜
０．０１）。表明了犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘基因的表达能够在盐胁迫下提高转基因植株的ＳＯＤ活性，进一步降低了盐
胁迫对植株造成的氧化伤害。
在盐胁迫下，植物细胞会产生大量的活性氧，同时在活性氧的作用下，膜脂发生过氧化反应［２８］。因此，进行
了Ｈ２Ｏ２ 和 ＭＤＡ含量的测定，以检测转基因苜蓿株系是否降低了氧化损伤。由图８Ｃ，图８Ｄ可见，在非盐分胁
迫条件下，转基因和野生型苜蓿的Ｈ２Ｏ２ 和 ＭＤＡ含量差异不显著。随着盐浓度的升高，转基因和野生型苜蓿叶
片中Ｈ２Ｏ２ 和 ＭＤＡ的含量呈上升趋势。但转基因株系的增加幅度低于对照，尤其在３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ处理后
差异达到显著水平（犘＜０．０５），说明转基因苜蓿能够在高盐胁迫下减少氧化损伤，降低膜脂过氧化程度，遭受的
伤害较轻，耐盐能力有了显著地提高。
１６２第２３卷第１期 草业学报２０１４年
图７ 盐胁迫对转基因及野生型苜蓿生长的影响
犉犻犵．７ 犈犳犳犲犮狋狊狅犳狊犪犾狋狊狋狉犲狊狊狅狀狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪狀犱狑犻犾犱狋狔狆犲犪犾犳犪犾犳犪犾犻狀犲狊
Ａ：ＮａＣｌ胁迫对苜蓿株高的影响Ｃｈａｎｇｅｏｆｓｈｏｏｔｌｅｎｇｔｈｏｆａｌｆａｌｆａｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ；Ｂ：ＮａＣｌ胁迫对苜蓿鲜重的影响Ｃｈａｎｇｅｏｆｆｒｅｓｈｗｅｉｇｈｔｏｆａｌｆａｌ
ｆａｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ．
图８ 转犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘基因苜蓿生理指标分析
犉犻犵．８ 犆犺犪狀犵犲狊狅犳狆犺狔狊犻狅犾狅犵犻犮犪犾犮犺犪狉犪犮狋犲狉犻狊狋犻犮狊狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪犾犳犪犾犳犪狑犻狋犺犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘
２．５ 转犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘基因苜蓿的氨基酸分析
结果显示（表２），转基因株系 Ｇ１６叶片中甲硫氨
酸，半胱氨酸含量均高于野生型，且达到显著水平
（犘＜０．０５）；转基因株系Ｇ５０叶片中甲硫氨酸含量显著
高于野生型（犘＜０．０５），半胱氨酸含量也高于野生型
植株，但没有达到显著水平。２个转基因株系在含硫
氨基酸总量上与野生型相比，分别显著提高了０．５７％
和０．５２％。说明犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘基因的超量表达
能够提高转基因苜蓿中的甲硫氨酸及半胱氨酸的含
量。
表２ 转犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘基因苜蓿叶片
甲硫氨酸及半胱氨酸含量分析
犜犪犫犾犲２ 犃狀犪犾狔狊犻狊狅狀犕犲狋犪狀犱犆狔狊犮狅狀狋犲狀狋狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮
犪犾犳犪犾犳犪狑犻狋犺犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘犵犲狀犲 ％
株系
Ｌｉｎｅｓ
甲硫氨酸含量
Ｍｅｔｃｏｎｔｅｎｔ
半胱氨酸含量
Ｃｙｓｃｏｎｔｅｎｔ
含硫氨基酸含量
Ｓｕｌｐｈｕｒａｍｉｎｏａｃｉｄｓｃｏｎｔｅｎｔ
ＷＴ １．２９ ３．８６ ５．１５
Ｇ１６ １．４３ ４．２９ ５．７２
Ｇ５０ １．４８ ４．１９ ５．６７
２６２ ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１４） Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１
３ 讨论
利用基因工程技术提高苜蓿抗逆性已成为苜蓿育种的重要途径。目前，已有许多利用转耐盐相关基因来改
良紫花苜蓿耐盐性的研究报道，Ｌｉ等［２９］在紫花苜蓿中高效表达盐生植物苏打猪毛菜（犛犪犾狊狅犾犪狊狅犱犪）的Ｎａ＋／Ｈ＋
反向转运体基因犛狊犖犎犡１，使转基因植株的耐盐性显著增强。Ｂａｏ等［３０］将拟南芥（犃狉犪犫犻犱狅狆狊犻狊狋犺犪犾犻犪狀犪）Ｈ＋
ＰＰａｓｅ基因犃犞犘１导入新疆大叶苜蓿中，分析超表达犃犞犘１转基因植株的耐盐性，结果表明转犃犞犘１基因可以
明显地提高紫花苜蓿的耐盐性。李燕等［２８］将紫花苜蓿犕狊犣犐犘基因导入苜蓿，发现基因在苜蓿中的超表达可以
提高苜蓿的耐盐性。本研究选用的犌狊犌犛犜１３基因来源于野大豆盐碱胁迫基因表达谱，属于Ｔａｕ类ＧＳＴ亚家
族［６］。大量研究表明Ｔａｕ类ＧＳＴ与植物对生物和非生物胁迫的耐受有关［３１３２］。因而选用该基因转化农菁１号
苜蓿，期望能够提高苜蓿的耐盐性。
正常生理条件下，ＲＯＳ通常被控制在毒性水平以下；但是在盐胁迫条件下，过量的ＲＯＳ会使植物渗透应答
能力逐渐丧失，萎蔫甚至坏死［３３］。所以维持活性氧产生和清除之间的平衡，对于植物生长和代谢以及对环境胁
迫耐性至关重要。本研究将来源于野生大豆的犌狊犌犛犜１３基因导入苜蓿，结果表明转基因苜蓿在盐胁迫下的盐
害程度显著低于野生型。同时超量表达的转基因苜蓿在盐胁迫下，ＧＳＴ活性，ＳＯＤ活性显著高于野生型，并且
过氧化氢含量显著低于野生型植株，表明转犌狊犌犛犜１３基因增强了转基因苜蓿株系的活性氧清除能力，从而降低
了盐胁迫对植物产生的氧化损伤。另外转基因株系的丙二醛含量也显著低于野生型，可见犌狊犌犛犜１３的超量表
达降低了盐胁迫对转基因苜蓿膜脂的伤害，使转基因株系细胞膜保持较好的生理活性。以上表明，超量表达的转
基因苜蓿是通过降低盐胁迫导致的膜脂氧化伤害和活性氧伤害，从而提高了转基因苜蓿的抗氧化能力和盐胁迫
下的耐性。
对于苜蓿来说，提高甲硫氨酸含量是刻不容缓的重要问题。１９８８年Ｓａａｌｂａｃｈ等［３４］首次通过转基因技术提
高了蛋氨酸含量之后，已经开展了很多关于提高植物含硫氨基酸含量的研究。如李雷等［３５］将玉米（犣犲犪犿犪狔狊）１０
ｋｕ醇溶蛋白基因导入马铃薯（犛狅犾犪狀狌犿狋狌犫犲狉狅狊狌犿）块茎中提高了含硫氨基酸的含量。吕德扬等［１６］将高含硫氨酸
蛋白基因转入苜蓿，使苜蓿中含硫氨基酸含量提高１３％～２０％。本研究中选用的犛犆犕犚犘基因是将玉米醇溶蛋
白基因经过生物信息学方法设计并合成的适合豆科植物表达的基因。结果表明转基因苜蓿的含硫氨基酸分别比
野生型苜蓿提高了０．５７％和０．５２％。可见超量表达该基因可以有效地提高苜蓿的含硫氨基酸含量。
本研究通过在苜蓿中超量表达犌狊犌犛犜１３和犛犆犕犚犘基因，明显提高了转基因苜蓿的耐盐性和含硫氨基酸
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ｔｉｏｎｂｙ犆狅犾犾犲狋狅狋狉犻犮犺狌犿犱犲狊狋狉狌犮狋犻狏狌犿ａｎｄ犆．狅狉犫犻犮狌犾犪狉犲ａｎｄｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆｏｎｅｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＢｏｔａ
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犃狀犪狀犪犾狔狊犻狊狅犳狊犪犾狋狋狅犾犲狉犪狀犮犲狅犳狋狉犪狀狊犵犲狀犻犮犪犾犳犪犾犳犪狑犻狋犺狋犺犲犌狊犌犛犜１３／犛犆犕犚犘犵犲狀犲
ＷＵＪｉｎｇ，ＣＡＩＨｕａ，ＢＡＩＸｉ，ＪＩＷｅｉ，ＷＥＩＺｈｅｎｇｗｅｉ，ＴＡＮＧＬｉｌｉ，
ＺＨＡＯＹａｎｇ，ＺＨＵＹａｎｍｉｎｇ
（ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＦｕｎｃｔｉｏｎａｌＧｅｎｅｓ，ＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ１５００３０，Ｃｈｉｎａ）
犃犫狊狋狉犪犮狋：Ｔｈｅ犌狊犌犛犜１３ｇｅｎｅｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅ犌犾狔犮犻狀犲狊狅犼犪ｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｏｆｓａｌｔａｌｋａｌｉｎｅｓｔｒｅｓｓ．
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ｂｉｎａｒｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ（ｐＢＥＯＧＳＴ１３／犛犆犕犚犘）ｗａｓｄｅｓｉｇｎｅｄａｎｄｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄｉｎｔｏａｌｆａｌｆａ（犕犲犱犻犮犪犵狅狊犪狋犻狏犪
ｃｖ．ＮｏｎｇｊｉｎｇＮｏ．１）ｕｓｉｎｇｔｈｅ犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ．Ｍａｎｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｆａｌｆａｌｉｎｅｓ
ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ，ａｎｄｔｗｏｏｆｔｈｅｍｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｔｏａｎａｌｙｓｅｔｈｅｓａｌｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｓｕｌｆｕｒａｍｉｎｏａｃｉｄｓｃｏｎｔｅｎｔｓ．
ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｆａｌｆａｌｉｎｅｓｓｈｏｗｅｄｅｎｈａｎｃｅｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏＮａＣｌｓｔｒｅｓｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｗｉｌｄｔｙｐｅｐｌａｎｔｓ．ＵｎｄｅｒＮａＣｌ
ｓｔｒｅｓｓ，ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅｐｌａｎｔｓｗａｓｉｎｈｉｂｉｔｅｄ，ｔｈｅｂｌａｄｅｇｒａｄｕａｌｙｂｅｃａｍｅｙｅｌｏｗａｎｄｃｒｉｍｐｐａｎａｍａ，ｂｕｔ
ｔｈｅｒｅｗａｓｏｎｌｙａｓｌｉｇｈｔｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓ，ｗｈｉｃｈｈａｄｎｏｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｕｎｄｅｒｓｔｒｅｓｓ．Ｔｈｅｍａｌｏｎｄｉａｌｄｅ
ｈｙｄｅａｎｄｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｌｉｎｅｓ（犘＜０．０５）．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｐｌａｎｔｈｅｉｇｈｔ，ｆｒｅｓｈｗｅｉｇｈｔ，ＧＳＴａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄＳＯＤａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｆａｌｆａ
ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（犘＜０．０５，犘＜０．０１ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）ｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｏｆｎｏｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓｕｎｄｅｒｓａｌｔｓｔｒｅｓｓ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒ，ｔｈｅｓｕｌｆｕｒａｍｉｎｏａｃｉｄｓｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｔｈｅＧ１６ａｎｄＧ５０ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｆａｌｆａｌｉｎｅｓｗｅｒｅｈｉｇｈｅｒｔｈａｎ
ｔｈｏｓｅｏｆｗｉｌｄｔｙｐｅｐｌａｎｔｓ，ｂｙ０．５７％ａｎｄ０．５２％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅＧＳＴ１３ａｎｄ犛犆犕犚犘ｉｎ
ａｌｆａｌｆａｉｍｐｒｏｖｅｄｔｈｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｏｓａｌｉｎｉｔｙｓｔｒｅｓｓａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｓｕｌｆｕｒａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．
犓犲狔狑狅狉犱狊：ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃａｌｆａｌｆａ；犌狊犌犛犜ｇｅｎｅ；犛犆犕犚犘ｇｅｎｅ；ｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ
５６２第２３卷第１期 草业学报２０１４年