全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(3): 479486 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由广西自然科学基金项目(桂科自 0832047)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 何龙飞, E-mail: lfhe@gxu.edu.cn, Tel: 0771-3235212-801
第一作者联系方式: E-mail: gxhhwn@gxaas.net, Tel: 0771-3244229
Received(收稿日期): 2014-08-12; Accepted(接受日期): 2014-12-19; Published online(网络出版日期): 2014-12-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20141229.1006.011.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00479
飞机草类黄酮 3’-羟化酶基因(CoF3’H)的克隆及其在烟草中的表达
何海旺 潘华清 张铙丹 何龙飞*
广西大学农学院, 广西南宁 530004
摘 要: 利用 RT-PCR和 RACE技术从飞机草中克隆得到 1628 bp的类黄酮 3’-羟化酶 cDNA的全长序列, 命名为 CoF3’H,
GenBank 登录号为 HQ268505.1。CoF3’H 基因的编码区长度为 1524 bp, 编码 507 个氨基酸。氨基酸序列含 P450 蛋白
结构域和半胱氨酸亚铁血红素结合域保守区(F××G×R×C×G), 利用 DNAMAN 软件比对显示, CoF3’H 与其他植物的
F3’H蛋白的同源性很高。通过农杆菌介导成功地将 CoF3’H基因导入烟草, T2代的转 CoF3’H基因烟草植株的黄酮含量
显著高于野生型。说明 CoF3’H在黄酮的生物合成中起重要作用, 为后续研究飞机草的化感作用及综合利用提供基础。
关键词: 飞机草; 类黄酮 3’-羟化酶; 克隆; 表达
Chromolaena odorata Flavonoid 3’-hydroxylase Gene Cloning and Its Expres-
sion in Tobacco
HE Hai-Wang, PAN Hua-Qing, ZHANG Nao-Dan, and HE Long-Fei*
Agriculture College of Guangxi University, Nanning 530004, China
Abstract: A flavonoid 3’-hydroxylase gene cDNA sequence was cloned by RACE and RT-PCR techniques from Chromolaena
odorata. The obtained full-length cDNA was named as CoF3’H with GenBank accession number HQ268505.1. It is 1628 bp in
length, containing a 1524 bp open reading frame, encoding 507 amino acid residues. The amino acid sequence of CoF3’H con-
tains cytochrome P450 domain and cysteine heme binding region (F××G×R×C×G). Homology analysis by DNAMAN software
showed that the deduced CoF3’H protein was highly homologous to F3’H proteins from different species. CoF3’H gene was
transferred into tobacco by Agrobacterium-mediated genetic transformation. There was higher content of flavonvoids in T2 trans-
genic tobacco than in the wild type. This result shows that CoF3’H plays an important role in flavonoid biosynthesis, and provides
a basis for researches on allelopathy and comprehensive utilization of C. odorata in the future.
Keywords: Chromolaena odorata; Flavonoid 3’-hydroxylase; Clone; Expression
飞机草[Chromolaena odorata (L.) R. M. King and H.
Robinson]属菊科多年生植物, 又名暹罗草、香泽兰, 原产
地中南美洲, 广泛分布于美国与阿根廷之间的热带地区,
包括西印度群岛[1-3], 第二次世界大战后, 传播到东南亚、
非洲和太平洋群岛等地[4-6]。在中国云南、广西、广东、
湖南和贵州等地均发现飞机草的入侵[6-7]。飞机草被认为
是世界上最严重的外来入侵种之一[8], 它主要是依靠其强
化感作用以及旺盛的繁殖、生长能力与草原或作物竞争,
破坏当地的生态环境。研究表明, 飞机草中含有大量的黄
酮类物质 , 这些黄酮类次生代谢物是飞机草的主要化感
物质及药用成分 , 但目前 , 对这些黄酮类物质的合成及
调控过程知之甚少。深入了解黄酮类物质合成的分子机
制 , 将有助于我们进一步研究飞机草的入侵性以及综合
利用。
类黄酮 3’-羟化酶(flavonoid 3’-hydroxylase, F3’H, EC:
1.14.13.21)是一种细胞色素 P450单加氧酶[9], 属于CYP75
亚族的成员。它是合成黄酮类物质过程中的一个关键酶,
以 芹 黄 素 (apigenin) 、 柚 皮 素 (naringenin) 、 山 奈 酚
(kaempferol)以及二氢山奈酚 (dihydrokaempferol)等多种
物质为底物, 催化单加氧反应, 合成类黄酮、黄酮及黄酮
醇等。自 1999 年从矮牵牛中克隆到第 1 个 F3’H 基因以
来, 已从多种植物中克隆得到编码 F3’H 酶的基因, 并进
行表达研究 [10-15]。由于 F3’H 催化生成的圣草酚
(eriodictyol)和二氢栎皮黄酮 (dihydroquercetin)是花青素
和原花青素生物合成的重要中间产物[9], 目前对 F3’H 基
因功能表达的研究大多集中在花色改变等方面[16-20]。对飞
480 作 物 学 报 第 41卷


机草 F3’H基因克隆及合成黄酮功能研究尚未见报告。
本研究以同属植物紫茎泽兰的 F3’H 基因序列为基础,
设计特异引物, 通过 RT-PCR及 RACE技术克隆飞机草的
类黄酮 3’-羟化酶基因的全长, 并将其导入烟草, 测定转
基因烟草中的总黄酮含量 , 以期为进一步研究飞机草的
强入侵性及综合利用提供基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料
飞机草样本采自广西隆安县 , 盆栽种植于广西大学
温室内。
1.2 RNA的提取及反转录
参考何海旺等[21]的方法提取RNA, 用 1%琼脂糖凝胶
电泳检测 RNA的完整性和纯度。选择条带清晰、无降解、
无蛋白质及 DNA 污染的高质量 RNA 样品进行后续的反
转录分析。
使用 Thermo 公司的 RevertAid First Strand cDNA
Synthesis Kit 试剂盒参照其说明书对提取的 RNA 进行反
转录获得第 1链 cDNA。将反转录产物保存于–20℃备用。
反转录所用的引物见表 1。

表 1 基因克隆和荧光定量 PCR分析所用引物
Table 1 Primers used for gene cloning and real-time PCR analyses
用途
Purpose
名称
Name
序列
Sequence (5–3)
OligodT (T)18
Mi-outer-F TCACAATAGCCAATCGTCGG
Mi-outer-R GGTAGCCTCGACTTTGGGTG
Mi-inner-F ACAGGAGGATGTGGCGATAC
克隆中间片段所用的引物
Primers for middle fragment amplifying
Mi-inner-R ACTAGCCTCGACTTTGGGTG
3-RT GACTAGATCTCCATGGCCTAGG(T)15
3-outer-F CTCCGCCTACCAAGAGTTTC
3-inner-F ATCAACTCGGTTCTTGCCTG
克隆 3端片段所用的引物
Primers for 3-end amplifying
3-R GACTAGATCTCCATGGCCTAGG
5-RT GCAAGTCACCATTGTTTCCA
5-R CTCTTCTTCGTTACGCCTTG
克隆 5端片段所用的引物
Primers for 5-end amplifying
AUAP GGCCACGCGTCGACTAGTAC
ORF-F TCTAGACTCACCCCGTTATAAAATG 克隆 ORF全长所用的引物
Primers for ORF amplifying ORF-R GGATCCTCTTAACAACTTTTGCATAC
NPTII-F TGACTGGGCACAACAGACAAT 验证转基因烟草所用的引物
Primers for transgenic tobacco analysis NPTII-R CGGCGATACCGTAAAGCAC
F3H-qF ATCGTCGAGTACCGTGGAATGG
F3H-qR GGAGAGTGGCGTTGAAGGATGG
Actin-qF AGTCCTCTTCCAGCCATCCATGAT
荧光定量 PCR所用的引物
Primers for Real-time PCR
Actin-qR TGAGCCACCACTGAGCACAATG

1.3 CoF3’H基因的克隆
根据 GenBank上查到的紫茎泽兰的 F3’H基因的序列
(GenBank登录号为 EF137714.1)设计内外侧 2对特异引物
(表 1), 对第 1 链 cDNA 进行巢式 PCR 扩增, 获得的目的
片段, 经回收、连接、转化和测序后, 得到中间片段序列。
根据中间片段序列设计 2 条上游引物以及根据反转录引
物序列设计下游引物(表 1), 对第 1 链 cDNA 进行巢式
PCR扩增, 获得 3末端片段。根据中间片段序列设计一条
特异反转录引物(表 1), 合成第 1 链 cDNA 用于 5末端片
段的克隆。再设计一条上游引物用于 PCR 扩增。5端片
段的克隆利用 Invitrogen公司的 5RACE快速扩增试剂盒
来完成, 根据 5RACE System for Rapid Amplification of
cDNA Ends, Version 2.0手册操作。
利用 DNAMAN 软件拼接上述 3 个片段 , 得到
CoF3’H 基因序列的全长序列, 以该全长序列为模板, 在
启动密码子 ATG 及终止密码子 TAA 外设计 1 对引物(表
1), 扩增出 ORF全长序列并校正。
PCR体系 25 μL, 包含 2.5 μL的 10×缓冲液(15 mmol
L–1 MgCl2)、0.5 μL的 dNTPs 混合物(各 10 mmol L–1)、1 μL
的 cDNA第 1链、1 μL的上游引物(10 μmol L–1)、1 μL的
下游引物(10 μmol L–1)及 0.2 μL的 rTaq DNA聚合酶(1 U
μL–1)。PCR程序先用 95℃变性 5 min, 接下来进行 30个
循环: 95℃变性 30 s、50℃退火 45 s、72℃延伸 45 s, 最后
用 72℃延伸 10 min, 产物于 4℃保存。PCR获得的目的片
段经 1%琼脂糖凝胶电泳检测鉴定后回收 , 并连接到
pUCm-T载体, 转化到 DH5α, 再经 PCR鉴定后测序。
第 3期 何海旺等: 飞机草类黄酮 3’-羟化酶基因(CoF3’H)的克隆及其在烟草中的表达 481


1.4 CoF3’H基因的植物表达载体的构建
由于克隆 ORF 全长的上下游引物 ORF-F 和 ORF-R
的 5端分别有 BamH I酶切位点(GGATCC)和 Xba I酶切位
点 (TCTAGA), 可以直接用于构建植物表达载体。先将
ORF全长连接到 pUCm-T载体, 并转化到 DH5α中。提取
质粒, 用 BamH I和 Xba I酶进行双酶切, 回收并连接到经
同样的酶双酶切过的 PBI121 载体上, 将构建好的载体转
化到 DH5α中, 双酶切验证后提取质粒, 并通过冻融法[22]
将质粒转化到致癌农杆菌 EHA105 中, 于–80℃保存得到
的转化农杆菌备用。
1.5 农杆菌介导的遗传转化及转基因植物的检测
利用叶盘法通过农杆菌介导 [23]进行遗传转化 , 把
CoF3’H基因导入烟草品种K346 (Nicotiana tabacum cv.
K346)。移栽通过抗生素筛选获得的阳性植株及野生型烟
草 , 待其长出新叶后 , 取幼嫩叶片提取DNA, 用NPTII-F
及NPTII-F引物进行PCR验证。再以克隆到的中间片段为
探针 , 对通过PCR验证为阳性的转基因植株进行DNA印
迹杂交检测拷贝数, 方法参照Roche公司DIG High Prime
DNA Labeling and Detection Starter Kit II说明书。拷贝数
为1的植株自花授粉后收获并种植 , 直到获得T2代植株 ,
用于后续的检测。
1.6 转基因烟草中的 CoF3H 基因的表达及黄酮含量的
检测
采取 T2 代烟草嫩叶提取 RNA, 反转录得到 cDNA,
稀释 20倍后上机检测; 配制 PCR反应液(总体积为 20 μL):
10 μL 2×SYBR Green I Master Mix、1 μL上游引物(5 μmol
L–1)、1 μL下游引物(5 μmol L–1)、1 μL cDNA模板、7 μL
ddH2O; PCR条件为 95℃变性 10 min, 95℃变性 10 s, 60℃
变性和延伸 60 s, 50 个循环; 将上好样品的 96 孔板放在
Roche LightCycler 480荧光定量 PCR仪中进行反应, 根据
绘制的曲线计算结果。
转基因烟草中导入的 CoF3’H 基因, 采用 PBI121 载
体上带有的组成形启动子 CaMV35S, 因此, 取 T2代烟草
植株的倒数第 5 张叶片, 转基因和野生型烟草各取 5 株,
参照李增富等[24]的方法, 精密称取无水芦丁对照品适量,
加 75%乙醇配成 0.2 mg mL–1的芦丁溶液。分别吸取该溶
液 2、4、6、8和 10 mL, 置 5只 25 mL容量瓶中, 加蒸馏
水至 6 mL, 加 5% NaNO2溶液 1 mL, 摇匀放置 6 min, 再加
10% Al(NO3)3 溶液 1 mL, 摇匀放置 6 min, 再加 4.3%
NaOH溶液 10 mL, 并加水稀释至刻度, 摇匀放置 15 min。
将不同浓度的芦丁标准溶液在波长 510 nm处, 以蒸馏水为
空白参比, 测定吸光度, 获得标准曲线。将 T2代烟草的叶
片于 105℃杀青 30 min, 55℃烘干, 用液氮磨成粉末, 过 60~
120目筛, 称取过筛后的粉末 1 g, 按 1︰25加入 80%乙醇
溶液, 浸 15 min, 然后在 300 W、50℃下, 超声波作用 20
min, 过滤。取 2 mL提取液于 25 mL容量瓶中, 加蒸馏水
稀释至 6 mL, 加 5% NaNO2溶液 1 mL, 摇匀放置 6 min, 再
加 10% Al(NO3)3溶液 1 mL, 摇匀放置 6 min, 再加 4.3%
NaOH溶液 10 mL, 并加水稀释至刻度, 摇匀放置 15 min。
在波长 510 nm 处测定吸光度。按照标准曲线换算样品中总
黄酮含量。荧光定量 PCR及总黄酮含量测定均设置 3个重复。
2 结果与分析
2.1 CoF3’H基因的克隆
用飞机草嫩叶提取RNA的反转录产物为模板 , 进行
巢式PCR, 得到1059 bp长的中间片段(图1-A)。再以这个
片段为模板设计引物 , 通过RACE技术分别扩增得到
354 bp (图1-B)和724 bp (图1-C)的3末端及5末端。通过
DNAMAN软件拼接3个片段 , 得到基因cDNA全长序列 ,
为1628 bp。在该基因编码区的起始密码子ATG及终止物
码子TAA的外侧设计一对特异引物 , 扩增出它的ORF全
长(图1-D)。通过DNAMAN对扩增得到的ORF全长及拼接
得到的全长进行比对, 这2条序列的同源性为100%, 说明
拼接得到的全长是正确的。用BlastN比对, 该基因序列与
菊科其他植物的F3’H基因均具有80%以上的同源性 , 将
其命名为CoF3’H (GenBank登录号为HQ268505.1)。
2.2 CoF3’H蛋白性质及功能预测
在 NCBI 网站上用 ORF Finder 软件(http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)分析发现, CoF3’H 的起码密码
子 ATG位于 29 bp, 终止密码子 TAA位于 1552 bp, 整个
编码区(ORF)长度为 1524 bp, 共编码 507个氨基酸(图 2)。
使用频率最多的氨基酸是亮氨酸(14.20%), 其次为缬氨酸

图 1 飞机草 CoF3’H基因的克隆
Fig. 1 Cloning of CoF3’H gene from C. odorata
M: marker; 1: CoF3’H中间片段的第 2轮扩增产物; 2: CoF3’H的 3未端的第 2轮扩增产物; 3: CoF3’H的 5未端的扩增产物;
D: CoF3’H ORF全长的扩增产物。
M: marker; 1: The second round PCR products of middle fragment; 2: The second round PCR products of 3-end; 3: Amplification of 5-end;
4: Amplification of ORF.
482 作 物 学 报 第 41卷



图 2 CoF3’H编码区核苷酸序列及推导出的氨基酸序列
Fig. 2 Nucleotide and predicted amino acid sequences of CoF3’H
下画线部分为 P450蛋白的特征序列。
The characteristic sequence of P450 is underlined.

(7.50%), 最少的为半胱氨酸, 仅占1.18%。
用DNAMAN软件比对表明, 与CoF3’H同源性最高的
是紫茎泽兰(88.24%), 跟其他的菊科植物如万寿菊等也具
有极高的同源性(80.00%以上)。系统进化树显示, 飞机草
与紫茎泽兰聚为一小类, 再与其他菊科植物如菊花、万寿
菊等聚在一起, 说明它们的亲缘关系比较近; 而其他植物
基本上按所属的目聚类, 如管状花目的烟草与牵牛花、杜
娟花目的茶树与蓝莓、蔷薇目的苹果与草莓等分别聚为一
类(图3)。说明F3’H在系统发生上密切相关, 与植物亲缘关
系相一致。
为进一步了解 CoF3’H基因编码蛋白的物理性质, 用
protparam 软件(http://expasy.org/tools/protparam.html)进行
预测。CoF3’H 基因编码蛋白的分子式为 C2538H4040N690
O718S16; 相对分子质量为 56 221.1 Da; 等电点为 6.79; 不
稳定系数 34.96, 为稳定蛋白(不稳定系数小于 40 则为稳
定蛋白, 大于 40 为不稳定蛋白); 总平均疏水值–0.002,
属亲水性蛋白质(总平均疏水值小于 0 为亲水蛋白, 而大
于 0则为疏水蛋白)。
利用SMART软件 (http://smart.embl-heidelberg.de/)对
CoF3’H的结构域分析可知, 其含有一段信号肽, 这个肽
的起始位置在第1位氨基酸 , 终止于第28位氨基酸。而
32~494氨基酸的片段则属于细胞色素P450的结构域。用
PROSITE软件 (http://prosite.expasy.org/)再对编码的氨基
酸 序 列 搜 索 , 在 434~443 氨 基 酸 的 位 置 上 发 现
FGAGRRICVG序列, 该序列推定为细胞色素P450的半胱
氨酸亚铁血红素结合域保守区(F××G×R×C×G), 这是鉴定
P450蛋白的一个重要特征(图2中的下画线部分)。
利用Psipred软件 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)分
析CoF3’H蛋白的二级结构, 在二级构象中, 各种结构元
件所占的比例不同, 其中包含15个α螺旋, 占氨基酸总量
的47.47%, 无规则卷曲分散在整个蛋白质中, 占51.48%,
而延伸链比较少, 仅占5.72%, 在整个蛋白质中没有发现
β转角。
2.3 转 CoF3’H基因烟草的获得
将克隆到的 CoF3’H基因连接到 T载体上, 用 Xba I、
BamH I 双酶切并回收后 , 与同样经过双酶切回收的
PBI121载体连接, 得到 CoF3’H基因的植物表达载体, 转
化到大杆菌 DH5α中。从转化的大肠杆菌中提取质粒, 用
Xba I、BamH I对质粒双酶切验证, 图 4显示可以从质粒
上酶切出目的片段, 说明 CoF3’H基因已经成功地连接到
PBI121载体上。
将从大肠杆菌中提取的植物表达载体质粒用冻融法
转化到根癌农杆菌 EHA105 中 , 用 PCR 检测转化的
EHA105菌液, 所用的引物为 ORF-F及 ORF-R, 从琼脂糖
第 3期 何海旺等: 飞机草类黄酮 3’-羟化酶基因(CoF3’H)的克隆及其在烟草中的表达 483



图 3 CoF3’H与其他植物 F3’H氨基酸序列的系统进化树
Fig. 3 Phylogentic relationship of amino acid sequences between CoF3’H and other F3’H


图 4 CoF3’H基因的植物表达载体酶切验证
Fig. 4 Restriction enzyme digestion analyses of
CoF3’H plant expression vector

凝胶电泳的结果(图 5)可以看出, 以转化过的 EHA105 菌
液为模板的泳道有目的条带 (泳道 1), 而非转化对照的
EHA105菌液没有目的条带(泳道 2), 说明 CoF3’H基因的
植物表达载体已成功地转化到根癌农杆菌中。
用转化的农杆菌液感染烟草的叶盘 , 放在含有卡那
霉素的培养基上筛选培养, 经过芽分化及生根阶段, 得到
阳性的烟草植株。将这些抗生素筛选为阳性的植株移栽,
待其长出新叶后, 提取其幼嫩叶片的 DNA, 用 NPT II-F
和 NPT II-R引物进行 PCR检测, 转基因烟草植物样本均
能扩增出目的条带(泳道 1~4), 而对照的野生型烟草没有
目的条带(泳道 5)(图 6), 说明 CoF3’H 基因已成功地被导
入这些烟草植株。
为进一步观察 CoF3’H基因在烟草中的拷贝数, 对这
些转基因烟草植株进行 DNA印迹杂交。提取烟草叶片的
总 DNA, 用 EcoR V酶切, 电泳分离后通过毛细管转移到
带正电荷的尼龙膜上后 , 用克隆的中间片段作为探针进
行印迹杂交。结果表明(图7), 在所检测的转基因植株中均
只检测到一个条带信号(泳道 1~4), 而非转基因野生型烟
草中没有杂交信号(泳道 5), 说明 CoF3’H 基因在这些转
基因植株中均为单拷贝。

图 5 转化后的农杆菌 PCR验证
Fig. 5 PCR analyses of Agrobacterium
1: 转基因植株; 2: 野生型非转基因植株。
1: Transgenic line; 2: Wild type plant.

图 6 转基因烟草的 PCR验证
Fig. 6 PCR analyses of transgenic tobacco
1~4: 转基因植株; 2: 野生型非转基因植株。
1–4: Transgenic lines; 5: Wild type plant.
484 作 物 学 报 第 41卷


2.4 CoF3H基因在转基因烟草中的表达
实时定量 PCR 检测结果表明, 在非转基因的野生型
烟草中也检测到 F3’H基因表达。以 2–(∆∆Ct)表示试验组目
的基因的表达相对于对照组的变化倍数。相对定量的结果
显示, 将对照样品的 2–(∆∆Ct)定为 1.00, 转基因的 2–(∆∆Ct)则
为 69.3 (图 8), 表明 CoF3’H 基因在转基因烟草中的表达
量显著提高, 是非转基因的野生型烟草表达量的 69 倍多,
差异达极显著水平, 说明 CoF3’H基因导入到烟草基因组
中, 能够正确地转录成 RNA, 并在烟草体内大量地表达。
总黄酮含量的测定分析表明(图 9), 在转有 CoF3’H 基因

图 7 转基因烟草的 DNA印迹杂交验证
Fig. 7 Southern blot analyses of transgenic tobacco
1~4: 转基因植株; 2: 野生型非转基因植株。
1–4: Transgenic lines; 5: Wild type plant.

图 8 CoF3’H基因在烟草中的相对表达量
Fig. 8 Relative expression level of CoF3’H gene in tobacco
柱上大写字母不同表示在 0.01的水平上差异显著。
Bars superscripted by different letters are significantly different
at the 0.01 probability level.

图 9 转 CoF3’H基因烟草总黄酮含量
Fig. 9 Content of general flavonoid in transgenic tobacco
柱上小写字母不同表示在 0.05的水平上差异显著。
Bars superscripted by different letters are significantly different
at the 0.05 probability level.
的烟草植株中的总黄酮含量为 2.34 mg g–1, 比野生型烟
草的高 0.13 mg g–1, 差异达显著水平。表明 CoF3’H能在
转基因烟草中翻译成蛋白质 , 使得烟草中合成黄酮的量
显著增加。
3 讨论
黄酮是飞机草的主要成分之一 , 目前已从飞机草体
内分离鉴定出 47 种黄酮类化合物, 包括黄酮、黄酮醇、
二氢黄酮、二氢黄酮醇、查尔酮等[25]。黄酮是生物体内
的一大类活性物质, 在飞机草体内可能具有多种活性。有
研究指出, 多种植物中的黄酮成份均有化感物质的作用[26-27],
飞机草可以通过释放黄酮类物质抑制其他植物的生长 ,
从而破坏生态环境[28]。虽然飞机草是一种危害严重的外
来入侵种 , 但从飞机草中提取的黄酮成分具有极强的抗
氧化作用, 在医学上广泛应用[29-31]。因此, 研究飞机草中
的黄酮的生物合成 , 对进一步了解飞机草的强入侵性及
综合利用具有积极意义。
类黄酮 3’-羟化酶属 P450单加氧酶, 能够催化多种物
质氧化反应, 在黄酮的生物合成过程中起着重要作用。生
物信息学分析表明 , 在 CoF3’H 编码的氨基酸序列中 ,
34~494 氨基酸为 P450 蛋白的结构域, 434~443 氨基酸有
半胱氨酸亚铁血红素结合域保守区(F××G×R×C×G), 表明
它是一个典型的 P450蛋白。另外, CoF3’H与其他植物的
F3’H 的氨基酸同源性都很高, 所以, CoF3’H 在进化上是
一个比较保守的基因。在系统进行上, 参与聚类的植物的
F3’H 蛋白都能按各自物种所属的目聚类, 亲缘较近的植
物聚为一类。
张松焕等[32]认为, 由于紫茎泽兰的 F3’H 基因跟烟草
的同源性很高, 所以将其转化到烟草中后, 与烟草内源的
F3’H 产生共抑制现象, 导致 F3’H 基因的表达量降低, 使
烟草中的花青素积累减少, 花色变淡。在本研究中克隆到
的CoF3’H基因虽然与烟草的 F3’H基因具有较高的同源性,
但它能够在烟草中大量表达, 并且影响烟草植株中的黄酮
合成, 使总黄酮的总量有所增加, 可能 CoF3’H 基因与烟草
内源的 F3’H 基因并未发生共抑制现象, 具体原因有待进一
步研究。Nakatsula等[33]研究也认为外源 F3’H基因可以在烟
草中表达, 并且能够增加花青素的积累, 加深花的颜色。
据报道, F3’H 基因在黄酮的合成过程中起重要作用,
它可以以柚皮素为底物, 催化生成圣草素, 还可以以二氢
山萘酚为底物, 催化生成二氢槲皮素[34]。在本研究中, 与
对照相比, 转 CoF3’H 基因烟草总黄酮的含量显著增加,
说明 CoF3’H促进了黄酮合成, 为黄酮合成过程中的关键
基因之一。因此, 在今后的研究中, 揭示该基因的表达调
控机制, 将进一步了解飞机草的强入侵机制, 对飞机草的
防控及综合利用具有重要意义。
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