全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(8): 1339−1344 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(31171619)和教育部和国家外专局“作物种质资源利用创新引智基地”(B12006)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 李加纳, E-mail: ljn1950@swu.edu.cn, Tel: 023-68250642
第一作者联系方式: 黄杰恒, E-mail: iorihhhh@163.com; Tel: 023-68222116; 李威, E-mail: liwei.99love@163.com
** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2013-01-10; Accepted(接受日期): 2013-04-22; Published online(网络出版日期): 2013-05-21.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130521.1032.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01339
甘蓝型油菜不同抗倒性材料中木质素代谢途径关键基因表达特点
黄杰恒** 李 威** 曲存民 刘列钊 徐新福 王 瑞 李加纳*
西南大学农学与生物科技学院 / 南方山地农业教育部工程研究中心, 重庆 400716
摘 要: 植物体内木质素的含量不仅与植物的抗病性有关, 也与植物的抗倒伏性状密切联系。本试验以 15个抗倒性
等级不同的甘蓝型油菜品种为材料, 分别在初花期和青荚期测定茎秆中部木质素含量, 同时用 qRT-PCR 的方法分析
了木质素代谢途径中 6 个关键基因 PAL、4CL、C4H、CCR1、CCR2 和 CAD 的表达量差异。结果表明, 油菜茎秆木
质素从初花期到青荚期平均增加了 28%, 抗倒性强的材料木质素增加最明显, 达到 33.5%; 不同时期, 不同抗倒伏性
的油菜茎秆中部木质素含量差异均极显著; 各基因表达量在两个时期间差异均显著或极显著, 但在不同抗倒性材料
间, 只有基因 PAL、4CL和 CCR1表达量间差异显著; 基因 PAL的表达量与木质素含量相关性最强, 4CL基因的表达
量与其他关键酶基因表达量相关性最强。综上所述, 木质素的合成积累由代谢途径中各个环节关键基因所共同决定,
但基因 PAL和 4CL对木质素的代谢影响更明显。
关键词: 木质素; 荧光定量 PCR; 代谢途径; 抗倒性
Expression Characteristics of Key Genes in Lignin Pathway among Different
Lodging Resistance Lines of Brassica napus L.
HUANG Jie-Heng**, LI Wei**, QU Cun-Min, LIU Lie-Zhao, XU Xin-Fu, WANG Rui, and LI Jia-Na*
Engineering Research Center of South Upland Agriculture / College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716,
China
Abstract: Lignin is related to not only plant disease resistance but also lodging resistance. The lignin content and six key genes
(PAL, 4CL, C4H, CCR1, CCR2, and CAD) expression characteristics of the middle stem were analysed at early flowering stage
and podding stage of 15 Brassica napus L. varieties with different lodging resistance level. The results indicated that the lignin
content generally increased by 28% from early flowering stage to podding stage, especially by 33.5% in the varieties with stronger
lodging resistance. Lignin content was significantly different between the varieties with different lodging resistance levels. The
expression of key enzyme genes was remarkably different between two stages, and the expression of genes PAL, 4CL, and CCR1
was remarkably different between the varieties with different lodging resistance levels. The expression of gene PAL was signifi-
cantly correlated with lignin content at both stages, and the expression of gene 4CL was significantly correlated with that of most
other genes. Our results suggested that all the genes studied in the paper could control the lignin synthesis, and PAL and 4CL were
the most important genes in lignin pathway.
Keywords: Lignin; qRT-PCR; Lignin pathway; Lodging resistance
木质素是植物界仅次于纤维素的第二大类植物
纤维成分, 参与植物细胞次生壁加厚、生长发育和
形态建成, 影响株高、株型、生物量、抗倒伏性等
性状。此外, 木质素途径还可以合成与木质素类似
的防卫型酚类物质或其他小分子物质, 参与对病等
逆境的防卫反应。目前, 在拟南芥[1-3]、烟草[4]、杨
树[5-7]、苜蓿[8]、玉米[9]、桉树[10]等植物中进行了较
为深入的研究。Bate等[11]研究表明抑制 PAL活性会
出现非正常生长或伴随着环境适应性及抗逆性下
降。Hu等[12]用反义 RNA技术抑制杨树 4CL基因表
1340 作 物 学 报 第 39卷

达, 能使其活性降低 90%, 与对照相比木质素含量
也下降 45%; 而在油菜中通过异源 4CL 基因的过量
表达, 能显著提高木质素含量, 抗病虫害及抗倒伏
能力也随之增强。Sewalt等[13]研究发现, 当抑制 C4H
活性降低 80%, 导致木质素含量下降 5 倍。Jones
等[14]通过抑制转基因烟草 CCR 活性也能显著降低
木质素的含量, 且与模式植物拟南芥中 CCR基因的
缺陷表型一致, 会出现非正常生长, 如植株矮小、叶
片畸形、导管塌陷等现象。Halpin等[15]报道, 在抑制
CAD 表达的转基因烟草中, 醛醇比的变化大于 S/G
比值, 表明 CAD 活性降低, 抑制松柏醛还原相对强
烈一些, 因此推测 CAD 存在不同的 CAD 同工酶。
但对于木质素的研究主要通过抑制其关键基因的表
达 , 但这些关键基因的作用时期与机理的报道较
少。
油菜是我国重要的油料作物, 每年倒伏能使油
菜减产 10%~30%, 严重时可达 50%以上[16], 同时妨
碍油菜生产的机械化。研究表明, 木质素含量与作
物抗倒伏能力呈显著正相关[17-18], 且在甘蓝型油菜
中茎秆木质素含量与植株的抗倒伏和抗病虫能力密
切相关, 但对于木质素代谢途径本身各基因表达的
特点研究较少, 在油菜薹期和开花期, 李尧臣等 [19]
通过对基因 4CL、F5H和 COMT在根、根颈和茎部
RT-PCR结果表明 F5H 和 4CL 基因可能是与油菜抗
倒伏相关的关键基因。张建等[20]研究也认为油菜茎
秆中木质素含量差异是引起倒伏的主要因子, 抗倒
材料木质素的含量为倒伏材料的 1.2倍。杨向东等[21]
对 29个甘蓝型油菜成熟期茎段木质素含量与茎秆强
度相关性的分析发现, 随着木质素含量的增加茎秆
强度亦逐渐增加。田间观察发现, 不同甘蓝型油菜
植株茎秆中部强弱与抗倒伏能力密切关联。因此 ,
本研究以初花期和青荚期不同倒伏性甘蓝型油菜
(Brassica napus L.)的茎中部为材料, 分析 2个时期
茎中部木质素含量的差异, 分析木质素代谢途径中
关键酶基因 PAL、4CL、C4H、CCR1、CCR2和 CAD
全部拷贝表达量总和, 以期发现甘蓝型油菜木质素
合成积累的关键时期及参与代谢合成的关键酶基因,
为选育抗倒伏及抗病虫品种提供依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
供试材料为重庆市油菜工程中心选育的 15个甘
蓝型油菜品种(系), 根据多年田间观察, 将材料分为
抗倒性强、中、弱, 每种抗倒等级的材料各 5个, 材
料来源及编号见表 1。

表 1 试验材料名称及编号
Table 1 Names and codes of the materials
木质素含量
Lignin content (%) 材料
名称
Name
抗倒强度
Lodging-
resistance
倒伏率
Lodging
rate (%)
初花期
Flowering
stage
青荚期
Podding
stage
w309 低 Low ≥80 4.58 7.78
w307 低 Low ≥80 6.51 10.47
L017 低 Low ≥80 7.95 14.46
L088 低 Low ≥80 8.26 8.19
L630 低 Low ≥80 9.76 15.24
L475 中 Midium 40–60 10.39 8.95
L131 中 Midium 40–60 10.75 14.75
L031 中 Midium 40–60 11.31 15.45
L097 中 Midium 40–60 12.19 18.28
L130 中 Midium 40–60 12.75 10.84
L146 高 High ≤20 12.83 15.64
W356 高 High ≤20 12.94 14.34
W332 高 High ≤20 13.63 17.71
L014 高 High ≤20 13.75 19.93
L072 高 High ≤20 14.99 18.81

1.2 田间种植及取材
2010 年和 2011 年在重庆市北碚区歇马镇试验
基地种植, 随机区组设计, 无重复, 每小区 3 行, 每
行 15株。田间管理按常规生产方式进行。
参照张文华等[28]对油菜抽薹期、花期和成熟期
分别测定木质素发现, 油菜木质素主要积累时期是
从花期到成熟期。因此, 本试验在木质素开始大量
积累的初花期(主花序有 10 朵花以内)与最易发生倒
伏的青荚期(收获前两周)取样, 随机选取每个材料 5
株, 在田间测量植株高度, 从中部剪断后迅速将中
部上下各取部分装入离心管中用液氮速冻, –70℃冰
箱保存。截取中部上下各 20 cm 茎秆, 烘箱中烘至
恒重, 于干燥器中保存, 用于木质素含量的测定。
1.3 木质素测定方法
采用 Klason法[21]测定总木质素含量。将样品用
粉碎机充分粉碎, 称取 0.3 g, 加入 72%的硫酸 7.5
mL, 30℃消化 1 h 后, 用蒸馏水稀释至硫酸浓度为
4%, 121℃下处理 1 h, 冷却至室温后, 单层滤纸过
滤, 最后将残渣烘干称重。木质素含量= (木质素质
量/所取材料的质量)×100%, 3次重复, 取平均值。
第 8期 黄杰恒等: 甘蓝型油菜不同抗倒性材料中木质素代谢途径关键基因表达特点 1341


1.4 木质素合成相关基因表达分析
1.4.1 总 RNA 的提取和 cDNA 的合成 用试剂
盒(TIANGEN BIOTECH)提取总 RNA。用 DNase I
(TaKaRa)除去总 RNA 中混有的少量 DNA, Thermo
NanoDrop 2000c 微量紫外分光光度计测定 RNA 浓
度并用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 的完整
性。按照说明书合成总 cDNA第一链, 20 μL体系含
1 μL总 RNA、50 μmol L–1 Oligo(dT)18混液于 70℃
水浴 10 min; 然后加入 200 U反转录酶、10 mmol L–1
dNTPs、40 U RNase抑制剂(TaKaRa)及灭菌的双蒸
水, 置 42℃水浴 15 min, 最后于 85℃变性 5 s, 冰上
冷却, –20℃保存备用。
1.4.2 qRT-PCR 分析 利用已公布的拟南芥基因
组序列(TAIR 数据库, http://www.arabidopsis.org/)及
白菜基因组序列(BRAD数据库, http://brassicadb.org/)
和已报道的油菜木质素合成相关的关键基因序列 ,
在 NCBI中进行多重比对, 用软件 Geneious 4.8.5设
计引物(表 2)。实时荧光定量 PCR 反应体系 20 μL
含 2×SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa) 10 μL、ROX
Reference Dye II 0.4 μL、cDNA 2 μL、Primer-F 0.4
μL、Primer-R 0.4 μL, 补水至总体积 20 μL。扩增反
应程序为 95℃ 30 s, 95℃ 5 s, 58℃ 34 s, 72℃ 30 s, 40
个循环 (退火温度根据不同引物进行调整 ), 采用
2−ΔΔCT法分析数据, 确定基因的相对表达量。每个取
样点设 3次技术重复, 试验共设 3次生物学重复, 分
别测定所选 15份材料 2个时期关键酶基因的全部拷
贝表达量总和。
2 结果与分析
2.1 木质素含量分析
2.1.1 初花期木质素含量 初花期木质素含量在
4.58%~14.99%间, 平均为 10.85%。其中抗倒性较弱、
抗倒性一般及抗倒性较强材料的木质素含量平均为
7.41%、11.48%和 13.63%, 抗倒性较强比较弱材料木
质素含量高 6.22 个百分点, 各抗倒等级间木质素含
量差异极显著(表 1)。
2.1.2 青荚期木质素含量 青荚期木质素含量在
7.78%~19.93%间, 平均值为 13.9%。其中抗倒性较
弱、抗倒性一般及抗倒性较强材料的木质素含量平
均为 8.84%、15.13%和 18.19%。抗倒性较强比较弱
材料木质素含量高 9.35个百分点(表 1)。与初花期相
比, 青荚期的茎秆木质素含量平均高 3.04个百分点,
增加了 28%, 不同抗倒类型材料的平均木质素含量
均有明显增加, 但抗倒性强的材料木质素含量增加
最明显, 增幅达到 33.5%。3 组不同抗倒性材料在 2
个时期间木质素含量方差分析见表 3。
2.2 木质素合成相关的关键基因 qRT-PCR 表达
分析
从图 1看出, 基因 PAL、4CL、CCR1、CCR2和
CAD的全部拷贝表达量总和从初花期到青荚期明显

表 2 本研究中所用到的引物及其扩增产物
Table 2 Primer sequences and amplification products size
引物序列 Primer sequence (5–3) 基因
Gene Forward Reverse
PCR产物长度
Amplicon size (bp)
退火温度
Tm (℃)
PAL GCAGCGCCACGTACCCGTTGAT AGCACCGCCTTGAGCTCCTCCT 142 61.86
C4H GCTCGCTGGCTATGACATCCCA ACGTCCAACACCAAACGGCAAG 181 60.93
4CL GACGACGTGGTGGCGCTTCCTT ATCGCCGTCGACTTGCTGAGCG 111 61.86
CCR1 CCGAACCGTGACCCTGAAGCCG CGGCTTGCTCCGCCACCATCTT 112 61.92
CCR2 CGGCGGTGAACGGAGCCAAGTT TGACCGCTGACTGGAGCGGTGG 297 62.11
CAD GTGCTTGAGTTGGGCTGCACGA CAACACCAACGTGGTCTCCGAC 254 59.75

表 3 初花期和青荚期木质素含量方差分析
Table 3 Variance analysis of lignin content in early flowering stage and podding stage
变异来源
Variation source
平方和
SS
自由度
df
均方
MS
F值
F-value
P值
P-value
时期间 Stages 0.0078 1 0.0078 52.1804 1.83E–07
类别间 Categories 0.0314 2 0.0157 105.5231 1.28E–12
互作 Interaction 0.0013 2 0.0006 4.3654 0.0242
误差 Error 0.0036 24 0.0001
总变异 Variance 0.0440 29
1342 作 物 学 报 第 39卷


图 1 不同抗倒性材料间各木质素关键基因全部拷贝表达量总和
Fig. 1 Key enzyme genes expression in different lodging-resistant materials at early flowering stage and podding stage

下降, 平均下降 80%、88%、61%、53%和 71%, 而
C4H 基因在青荚期的表达量较初花期平均上升 15
倍。初花期各基因表达量差异极显著 , 各抗倒性材
料间表达量差异也极显著(表 4)。各基因表达量与
木质素含量均正相关 , 其中 PAL 与木质素含量显
著相关 , 抗倒性强组表达量是抗倒性弱组的 7.67
倍 , 其次是基因 C4H和 CCR1, 其中基因 4CL表达
量与 PAL、CCR1、CCR2 和 CAD 基因表达量极显
著相关(表6); 青荚期各基因表达量差异极显著, 但
各抗倒性材料间表达量差异不显著 (表 4), 基因
PAL、4CL 表达量与木质素含量极显著相关, 抗倒
性强组表达量分别是抗倒性弱组的 5.26 倍和 7.67
倍, 且 2个时期间表达量差异显著(表5)而基因 C4H
和 CCR2与木质素含量呈负相关, 其中基因 4CL表
达量与 PAL 和 CAD 基因表达量均极显著相关 (表
6)。

表 4 初花期(FS)和青荚期(PS)关键基因表达量的方差分析
Table 4 Variance analysis of genes expression in early flowering stage (FS) and podding stage (PS)
平方和 SS 均方 MS F值 F-value P值 P-value 变异来源
Variation source FS PS
自由度
df FS PS FS PS FS PS
基因间 Intergenic 548.1042 792.5813 6 91.3507 132.0969 28.4710 14.403 0.0001 0.0001
类别间 Categories 92.7209 6.2345 2 46.3604 3.1172 14.4490 0.340 0.0001 0.7128
互作 Interaction 116.2707 73.8306 12 9.6892 6.1525 3.0200 0.671 0.0015 0.7745
误差 Error 269.5165 770.4293 84 3.2085 9.1718
总变异 Variance 1026.6122 1643.0756 104

表 5 两个时期各基因表达量方差分析(用 F值加*表示)
Table 5 Variance analysis of each key enzyme gene expression during the early flowering stage and podding stage
基因 Gene 变异来源
Variation source PAL C4H 4CL CCR1 CCR2 CAD
生育期间 Stages 18.4756** 14.7401** 49.9115** 22.0726** 4.6588 18.7376**
类别间 Categories 6.9078** 0.5484 6.4644** 4.7319* 0.7475 3.0038
互作 Interaction 3.5222* 0.6219 3.8018* 2.8349 1.0717 1.1155
*和**表示在 5%和 1%水平上差异显著。* and ** denote significant difference at 5% and 1% probability levels, respectively.

表 6 初花期(FS)和青荚期(PS)关键酶基因表达量相关系数
Table 6 Correlation coefficients of expression between key enzyme genes at the early flowering stage (FS) and podding stage (PS)
LC PAL 4CL C4H CCR1 CCR2 基因
Gene FS PS FS PS FS PS FS PS FS PS FS PS
PAL 0.58* 0.61**
4CL 0.43 0.73** 0.73** 0.85**
C4H 0.28 –0.29 0.12 0.14 –0.21 0.05
CCR1 0.44 0.28 0.67** –0.10 0.98** 0.17 –0.19 0.11
CCR2 0.39 –0.19 0.29 –0.14 0.65** –0.18 –0.22 0.18 0.67** –0.28
CAD 0.44 0.43 0.43 0.56* 0.70** 0.69** 0.10 0.33 0.74** 0.20 0.65** 0.06
*和**表示在 5%和 1%水平上差异显著。* and ** denote significant difference at 5% and 1% probability levels, respectively.
第 8期 黄杰恒等: 甘蓝型油菜不同抗倒性材料中木质素代谢途径关键基因表达特点 1343


3 讨论
油菜抗病、抗逆和抗倒性弱是限制我国油菜生
产面积和机械化生产的主要因素, 提高油菜茎秆木
质素含量可以显著提高油菜抗倒性, 但关于茎秆木
质素代谢的生理和分子生物学研究还很薄弱。前人
对于甘蓝型油菜木质素的研究也主要集中在油菜成
熟后期的根部以上茎秆[19-22], 而对于甘蓝型油菜最
易发生折断的茎秆中部以及最易发生倒伏的青荚期
的研究报道甚少。本研究表明, 在 2个时期各材料的
木质素含量均差异极显著, 初花期到青荚期油菜茎
秆木质素含量平均增加了 28.0%, 抗倒性强的材料
木质素增加最明显, 达到 33.5%, 其中上升幅度最
大的材料是 L17, 平均增加 45.0%; 但材料 L088、
L130 和 L475 的木质素含量却略有下降, 这可能是
这些材料在青荚期的木质素累计较少, 加上抽样误
差(因为是花期和青荚期是不同的单株)所致。在初花
期, 木质素代谢途径各主要基因的全部拷贝总表达
量与木质素含量正相关, 说明初花期可能是油菜茎
秆中部木质素积累的关键时期。另外, 木质素含量
与田间观察的抗倒性具有明显的正相关, 与前人的
研究结果一致[19-22]。
虽然研究者们对木质素的合成已经进行了深入
研究, 主要的关键酶基因和调控基因在拟南芥、烟
草、金鱼草、杨树、欧芹、桉树、苜蓿、水稻、葡
萄等众多植物中被克隆 , 但木质素途径比较复杂 ,
表现在中间产物及木质素的侧基修饰类型丰富, 合
成途径呈网络状, 许多产物的生成具有不止一条的
合成途径[23], 且这些基因均表现为多基因家族[24-25],
甘蓝型油菜木质素合成代谢作用机制尚不清楚。本
研究根据已报道的研究成果选取了木质素代谢途径
中 6个比较重要的功能基因, 经 qRT-PCR分析表明,
木质素合成的下游特异途径所涉及的酶 CCR 和
CAD基因在青荚期明显下调, CCR1和 CCR2分别平
均下调 60%和 50%, 而 CAD 平均下调 71%, 说明
CCR和 CAD基因主要参与木质素的合成, 随着青荚
期茎秆木质素合成量的减少, 它们的表达量也明显
降低。作为木质素合成途径的上游基因, C4H的表达
量在青荚期分别平均上调 15倍, 推测是由于C4H酶
在苯丙烷途径中主要催化苯丙氨酸到羟基肉桂酸及
其辅酶 A 酯类的过程, 这些产物除用于木质素的生
物合成外, 更多的还是很多酚类化合物的前体, 说
明在油菜青荚期茎秆中, 类黄酮代谢还比较旺盛。
研究结果还发现, 作为公共苯丙烷途径(木质素
与色素的共享途径)第一个关键酶基因PAL的全部拷
贝总表达量在青荚期大幅度下调, 高达 79%, 这与
C4H 基因的行为相悖, 这种现象是否是因为在油菜
花期至青荚期前期茎秆中 PAL 表达量高, 已合成了
足够的肉桂酸中间产物, 青荚期后期已不需要该基
因的过多参与？还需要进一步的试验证明。不过 ,
无论在初花期还是青荚期, 基因 PAL 的表达量与茎
秆木质素含量均呈极显著正相关, 还是说明该基因
与茎秆木质素的关系密切。
本研究中, 其他基因全部拷贝总表达量与木质
素含量相关性不显著, 鉴于这些基因都是木质素代
谢途径中的必需基因, 说明油菜茎秆木质素合成代
谢途径可能受这些基因的共同作用, 而非单个关键
基因的影响。在青荚期, 基因 CCR1、CCR2和 CAD
表达量显著下降, 此时木质素含量却没有明显变化,
说明木质素的代谢积累已处于基本停滞。
从基因间全部拷贝总表达量的相关性来看, 初
花期基因 4CL表达量与 PAL、CCR1、CCR2和 CAD
基因表达量极显著相关, 青荚期 4CL 表达量与 PAL
和 CAD表达量极显著相关, 说明 4CL是关联苯丙烷
代谢途径、类黄酮代谢途径和木质素代谢途径的重
要基因[26], 是木质素代谢中承前启后的关键酶基因,
这与杨向东等[21]结论相吻合。在初花期, CCR 家族
中的 CCR1 基因在高抗倒性材料中的表达量为低抗
倒性材料的 2.36 倍, 而 CCR2 基因表达量在不同抗
倒伏材料中差异并不明显, 说明 CCR1 主要参与茎
秆的木质化过程。另外, Buahcer等[27]]研究表明抑制
CAD 酶活性时, 植物木质素含量并未明显改变, 仍
维持在正常的水平 , 但相应的肉桂醇含量减少。
Halpin 等[15]则认为抑制 CAD 表达的转基因烟草中,
醛醇比的变化大于 S/G 比值, 表明 CAD 活性降低,
抑制松柏醛还原相对强烈, 推测 CAD 存在同工酶,
即 SAD。但本文的研究发现初花期 CAD基因在高抗
倒组是低抗倒组表达量的 2.28 倍, 并且进入青荚期
后显著下调, 幅度达到 71%, 说明 CAD 在木质素的
合成代谢和调控中起到了重要作用。
研究木质素途径中几个重要关键基因在油菜生
育后期茎秆中的表达特点基因间的相互关联作用 ,
对于深入研究甘蓝型油菜的茎秆木质素合成代谢机
制具有重要意义。
4 结论
初花期是油菜茎秆中部木质素合成的重要时期;
茎秆中部木质素含量与抗倒伏性有显著的相关性 ;
1344 作 物 学 报 第 39卷

不同遗传背景材料间木质素代谢并非由某个功能基
因所控制, 而是多个基因相互协调作用的结果, 基
因 PAL 的表达与木质素含量相关性最强, 4CL 基因
的表达量与其他基因表达量相关性最强, 而 C4H 基
因表达量与木质素含量及各基因表达量相关性最
弱。推测调控 PAL和 4CL基因对油菜茎秆木质素含
量的影响会更明显。
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