全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(3): 431439 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31101206), 教育部高等学校博士点基金项目(20100097120036), 江苏省自然科学基金项目(BK2011636)和
山东农业大学作物生物学国家重点实验室开放课题项目(2012KF09)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 陈佩度, E-mail: pdchen@njau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: liping99@hotmail.com
Received(收稿日期): 2012-08-01; Accepted(接受日期): 2012-11-16; Published online(网络出版日期): 2013-01-04.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130104.1735.020.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00431
小麦Mlo反义基因的转化及转基因植株的白粉病抗性分析
邢莉萍 钱 晨 李明浩 曹爱忠 王秀娥 陈佩度*
南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095
摘 要: 采用基因枪法将小麦反义 Mlo基因导入扬麦 158和济麦 20的幼胚愈伤组织中, 在含除草剂的分化培养基上
经两轮筛选, 获得抗性再生植株。PCR检测、PCR-Southern杂交、基因组 DNA斑点杂交和除草剂 BASTA抗性分析
结果证实已获得转基因扬麦 158和济麦 20阳性植株, 荧光定量表达分析亦证明 Mlo基因发生沉默。对 T0和 T1代转
基因植株的白粉病抗性鉴定表明, 有 6个转基因株系高抗白粉病。对 T1代转基因小麦接种白粉菌后孢子发育的显微
观察结果显示, Mlo反义基因的导入明显加快了乳突的形成和维持时间, 有效抑制了吸器的发育, 因而使转 Mlo反义
基因材料表现抗病性。
关键词: 基因枪转化; 小麦反义 Mlo基因; 小麦白粉病; 乳突和吸器
Transformation of Antisense Wheat Mlo (Ta-Mlo) Gene and Wheat Powdery
Mildew Resistance Analysis of Transgenic Plants
XING Li-Ping, QIAN Chen, LI Ming-Hao, CAO Ai-Zhong, WANG Xiu-E, and CHEN Pei-Du*
National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: The antisense wheat Mlo gene, Ta-Mlo, was transformed into wheat (Tritivum aestivum L.) varieties Yangmai 158 and
Jimai 20 via biolistic transformation using immature embryo calli as explants. After two rounds of bialaphos selection and regen-
eration, herbicide-resistant plants were obtained, which were subsequently confirmed by PCR, PCR-Southern hybridization, ge-
nomic dot hybridization, and BASTA resistance analysis. The results showed that the Ta-Mlo antisense transgenic Yangmai 158
and Jimai 20 plants were obtained. The real time fluorescence quantitative PCR analysis proved that the transcript of Ta-Mlo was
knocked down in these transgenic plants. The disease resistance test showed that the six transgenic lines appeared highly resis-
tance to powdery mildew pathogen Blumeria graminis f. sp. tritici (Bgt). The transgenic lines showed distinct acceleration of the
production and stabilization of papillae, and effective suppression to further development of haustoria of Bgt. Therefore, the
transgenic lines showed high resistance to Bgt.
Keywords: Biolistic transformation; Antisense wheat Mlo gene; Wheat powdery mildew; Papillae and haustoria
白粉病是由白粉菌 (Blumeria graminis f. sp.
tritici, Bgt)引起的一类具有高度专化性的真菌病害[1]。
白粉菌生理小种多, 变异速度快, 抗病品种往往因
为生理小种变异而感病, 这就大大地缩短了品种的
使用年限。利用基因工程方法选育广谱抗白粉病品
种将是比较经济和有效的方法之一。
野生型 Mlo 基因是大麦(Hordeum vulgare)抗白
粉病的负调控因子, 隐性突变的 mlo 基因介导了大
麦对白粉菌(B. graminis f. sp. hordei, Bgh)的广谱抗
性[2]。Shirasu 等[3]和 Kim 等[4]将完整的 Mlo 基因转
到 mlo突变的大麦中, 瞬间表达后, mlo突变的大麦
对白粉病菌的感病性得以恢复。Schweizer 等[5]利用
基因枪将 Mlo-dsRNA直接导入 Mlo背景的大麦品种
叶片, 导入 Mlo-dsRNA 基因的叶表皮单细胞高抗白
粉病菌侵入。随后 Buschges等[6]和 Devoto等[7]也证
明大麦 Mlo 基因是一种植物防卫机制的负向调控因
子。研究表明, 大麦 mlo 基因不会引起被侵染细胞
的过敏性坏死反应, 而是利用乳突抗性(又称为细胞
432 作 物 学 报 第 39卷
壁加厚)机制来抵抗病原菌的侵入, mlo 基因促使乳
突高频、快速形成和保持时间长是大麦抗白粉菌侵
入的关键[8-10]。因此 Mlo 抗性代表了一类由寄主基
因突变控制的植物广谱抗病新机制。全面深入地研
究 Mlo 基因及其介导的抗病性对揭示植物广谱抗病
机制、创造优良的抗白粉病新抗源具有重要意义[11]。
小麦是大麦的近缘种, 而且二者的 Mlo 基因具
有高度的同源性, 推测它们可能具有相似的作用机
制。Wang和 Waterhouse[12]提出可以通过 RNA干扰
技术(RNA interference, RNAi)或者反义技术(antisense)
关闭或者减弱植物自身 Mlo 基因的表达以赋予植物
抗病性。赵同金等[13]将大麦 Mlo反义基因通过农杆
菌介导的苗端转化法转入小麦中, 获得了抗白粉病
的转基因植株, 但并未验证小麦内源 Mlo 基因沉默
的效率以及探究抗性产生的分子细胞学机制。本实
验室于玲等[14]克隆了一个小麦 Mlo 基因(Ta-Mlo), 其
cDNA全长序列为1602 bp (GenBank登录号为AF384144),
其氨基酸序列与大麦 Mlo 基因(GenBank 登录号为
gi7489389)编码蛋白的相似性为 89%。为进一步了解
该小麦 Mlo 基因的功能及其与小麦白粉病抗性的关
系, 本实验构建了包含该 Ta-Mlo 反义基因的植物表
达载体, 利用基因枪法将其导入高感白粉病的小麦
品种中, 期望通过转录后基因沉默(PTGS)途径造成
小麦内源 Mlo 基因表达缺失, 验证转基因植株基因
沉默的效率并鉴定其白粉病抗性, 从而进一步探讨
该小麦 Mlo基因的作用机制。
1 材料与方法
1.1 植物材料选取和幼胚愈伤组织诱导培养
采用综合农艺性状优良的感白粉病小麦品种扬
麦 158和济麦 20作为转化受体。选取开花后 12~16
d 的小麦未成熟种子用于幼胚愈伤组织的诱导。依照
蒋正宁等[15]的方法消毒种子及诱导培养愈伤组织。
1.2 反义 Ta-Mlo基因植物表达载体构建
将 Ta-Mlo 编码序列从 pGEM-T-easy 载体上用
Not I切下, 并连接到中间载体 pBluescript的相同酶
切位点处, 将重组克隆用 pBluescript载体上 M13左
引物(M13F)和目标基因左引物(MloF)进行 PCR 扩增,
筛选出目标基因反向插入的克隆 pBS-Mlo(–), 再以
Sma I和 Sac I从 pBS-Mlo(–)切下目标基因, 在相同
酶切位点处替换表达载体 pAHC25载体上的 GUS基
因编码序列, 由此将目标基因克隆到强启动子 ubi
的下游, 获得表达载体 pAHC-Mlo(–) (图 1)。
图 1 pAHC-Mlo()质粒载体图谱
Fig. 1 Map of plasmids pAHC-Mlo()
1.3 基因枪转化和转基因植株获得
以预培养 7~10 d 的幼胚愈伤组织为转化受体,
在轰击前 6 h至轰击后 16 h进行高渗处理。基因枪
轰击方法和轰击参数参照王华忠等[16]的方法。轰击
后的愈伤组织转移到无选择压的 SD2培养基上恢复
培养 2 周, 并使选择标记基因充分表达。恢复培养
后转移到添加 3 mg L1除草剂 Bialaphos的筛选培养
基进行除草剂抗性芽苗的分化, 每 3 周继代一次,
于 26℃、光照 10 h d1和光照强度为 40 μmol m2 s1
条件下培养, 经两轮筛选及分化, 当除草剂抗性绿
芽长至 3~5 cm时, 转入生根壮苗培养基中。待苗长
到 6~8 cm高时, 开管炼苗 2~3 d, 用清水洗净苗根系
上的培养基后移栽至瓦盆, 在温室生长成株。
1.4 转基因植株的分子检测
1.4.1 PCR检测 依据BAR基因和目标基因序列
设计 3对扩增引物, 分别是BARF: 5′-CGAGACAAG
CACGGTCAACTTC-3′, BARR: 5′-AAACCCACGT
CATGCCAGTTC-3′, 退火温度 63 , ℃ 扩增片段长度
402 bp; MloF: 5′-ATGGCAAAGGACGACGGGTA-3′,
MloR: 5′-AAGCGGAACCGCGCAGGATC-3′, 退火
温度 60 , ℃ 扩增片段长度为 548 bp; UbiF: 5′-CCAC
ATCATCACAACCAAGC-3′, UbiR: 5′-ACCCAGAT
CTCCCCCAAATC-3′, 退火温度 55 , ℃ 扩增片段长
度 616 bp。小量提取 T0和 T1代转化植株及受体对照
的基因组DNA, 分别使用上述引物对进行 PCR筛选
和鉴定。PCR反应程序为 94℃预变性, 3 min; 94℃变
性, 30 s, 退火 45 s, 72℃延伸 1 min, 35个循环; 72℃
再延伸 10 min; 10℃保存。扩增产物经 0.8%琼脂糖
凝胶电泳分离后, 用凝胶成像系统拍照和分析。
1.4.2 PCR-Southern 杂交和基因组 DNA 斑点杂交
检测 PCR-Southern杂交取上述目标基因 PCR扩
增产物, 纯化后经 0.7%琼脂糖胶电泳, 采用碱法转
移到 Amersham Hybond N+膜上。斑点杂交采用转基
第 3期 邢莉萍等: 小麦 Mlo反义基因的转化及转基因植株的白粉病抗性分析 433
因植株的基因组 DNA(以受体品种作对照)经超声波破
碎及碱变性后, 直接点到 Amersham Hybond N+膜上。
探针均采用地高辛标记的用特异引物扩增获得的目
标基因片段(548 bp)。探针标记和 Southern blot均采
用 DIG High Prime DNA Labeling and Detection
Starter Kit II试剂盒(Roche), 按使用说明书操作。
1.4.3 实时荧光定量 PCR (real time fluorescence
quantitative PCR, qPCR)检测 提取 T0代经分子
检测为阳性的 18 个单株的总 RNA, 其中表现高抗
(病级为 0; 和 1)的 6株, 以扬麦 158和济麦 20为受
体各 3 株; 表现中抗及中感(病级为 2~3)的 8 株, 包
括以扬麦 158为受体的 5个单株和以济麦 20为受体
的 3 个单株; 表现高感(病级为 4)的 4 株, 两基因型
受体各 2株。以未转基因受体为对照。利用 PrimeScript
RT reagent Kit (TaKaRa)反转录成 cDNA, 用 Premix
Ex Taq (Probe qPCR) Kit (TaKaRa)进行 PCR扩增。
1.5 T1代转基因植株的 BASTA抗性分析
T1代小麦植株长至 4~5 叶时, 在新叶近端部涂
抹浓度为 120 mg L1的 BASTA水溶液(中国农业科
学院徐惠君研究员惠赠), 10 d后观察抗性差异并拍
照记录。
1.6 转基因植株的白粉病抗性鉴定
将 T0代和 T1代转化植株种植于南京农业大学
江浦试验站塑膜大棚中, 苗期人工接种白粉病混合
菌种, 接种 7 d后调查并记录发病情况, 按盛宝钦[17]
提出的苗期反应型(0~4 级)分级标准进行抗病性鉴
定, 0、0;和 1级为高抗, 2级为中抗, 3级为中感, 4级
为高感。
1.7 白粉菌侵染的组织解剖学显微观察
白粉菌接种后 12、18、24、30、36和 48 h, 分
别对转基因植株和受体对照植株的叶片取样, 将叶
片样品在含 0.15%三氯乙酸的乙醇脱色液中于 37℃
恒温箱脱色 48 h, 中间更换 2~3次脱色液, 直至叶段
完全透明, 保存于水合氯醛溶液中, 显微镜观察前
用考马斯亮蓝染色液(0.15%三氯乙酸水溶液:0.6%
考马斯亮蓝 R-250甲醇溶液=1∶1, V/V)染色 10 min,
再用蒸馏水漂洗, 滴加甘油∶水(1∶1, V/V)溶液镜
检。使用 Leica光学显微镜观察染色后的叶片, 统计
分析 100~150 个白粉菌侵入位点的乳突和吸器的形
成情况, 用 SAS9.1.3进行Duncan氏新复极差检验法
分析观测数据。
2 结果与分析
2.1 转反义 Ta-Mlo基因植株的获得
采用基因枪法将 Ta-Mlo反义基因导入高感白粉
病的扬麦 158和济麦 20幼胚愈伤组织, 轰击幼胚愈
伤组织各约 2000块, 经筛选、分化和生根壮苗培养
(图 2-A~C), 获得以扬麦 158为受体的具除草剂抗性
的再生植株 154株, 再生频率为 7.2%; 以济麦 20为
受体的具除草剂抗性的再生植株 102 株, 再生频率
为 5.1%。
为了检测再生小麦基因组中是否有外源基因的
插入 , 首先用 BAR 基因引物对 T0 代转化植株的
gDNA 进行 PCR 扩增检测, 在 256 个 T0代植株中,
有 69 个单株(以扬麦 158 为受体 36 株, 以济麦 20
为受体的 33 株)扩增出预期的 402 bp 片段, 而受体
对照植株未出现该片段(图 3-A)。为避免小麦内源
Mlo 基因的干扰, 以 ubi 启动子左引物 UbiF 和目的
基因 Ta-Mlo 左引物 MloF 搭配进行 PCR 扩增检测,
在上述 69个单株中有 63个单株(以扬麦 158为受体
33株, 以济麦 20为受体的 30株)同时也能扩增出与
质粒对照相同大小的 DNA片段(2218 bp), 而受体对
照无扩增带(图 3-B)。3 次重复结果一致, 初步确定
这 63 株 T0代转化植株为 PCR 阳性转化植株, 因此
以扬麦 158为受体的转基因频率为 1.7%, 以济麦 20
图 2 转基因植株的获得
Fig. 2 Transgenic plants obtained
A: 轰击前转入高渗培养基的愈伤组织; B: 愈伤组织在添加 3 mg L1除草剂 bialapos的培养基上筛选和分化; C: 转化植株的生根壮苗。
A: Callus prepared for bombardment on high osmotic medium; B: Differential culture of the calli on selective medium with 3 mg L1 bialapos;
C: Transgenic plant regeneration.
434 作 物 学 报 第 39卷
图 3 T0代转化植株 BAR基因(A)和 ubi-Mlo DNA片段(B)的
PCR检测
Fig. 3 PCR testing of T0 transgenic plants for BAR gene and
ubi-Mlo sequences
M: 分子量标准 DL5000; 1: 扬麦 158; 2: 质粒对照;
3~8: T0代阳性转基因植株。
M: Marker DL5000; 1: Yangmai 158; 2: Plasmid control;
3–8: Positive T0 transgenic plants.
为受体转的基因频率为 1.5%。
2.2 转基因植株的分子检测
2.2.1 PCR-Southern 和基因组 DNA 斑点杂交检测
为进一步明确转基因植株的真实性, 对 T0代 PCR
阳性植株进行 PCR-Southern 杂交和基因组 DNA 点
杂交验证。结果显示 PCR阳性植株都可检测到与质
粒对照相同大小的杂交带(图 4-A)或杂交点(图 4-B),
仍表现为阳性, 而阴性对照没有出现任何杂交信号。
图 4 转基因 T0代植株的 PCR-Southern (A)和斑点杂交(B)分析
Fig. 4 PCR-Southern blot (A) and spot hybridization (B)
assays of different T0 transgenic plants
A图中, 1: 扬麦 158; 2: 质粒对照; 3: H2O; 4: Y158-1; 5: Y158-2;
6: Y158-3; 7: Y158-4; 8: J20-1; 9: J20-2; 10: J20-3; 11: J20-4。
B图中, 1: 扬麦 158; 2: 济麦 20; 3: H2O; 4: Y158-1; 5: Y158-2;
6: Y158-3; 7: Y158-4; 8: J20-1; 9: J20-2; 10: J20-3; 11: J20-4。
In panel A, 1: Yangmai 158; 2: Plasmid control; 3: H2O; 4: Y158-1; 5:
Y158-2; 6: Y158-3; 7: Y158-4; 8: J20-1; 9: J20-2; 10: J20-3; 11: J20-4.
In panel B, 1: Yangmai 158; 2: Jimai 20; 3: H2O; 4: Y158-1; 5: Y158-2;
6: Y158-3; 7: Y158-4; 8: J20-1; 9: J20-2; 10: J20-3; 11: J20-4.
2.2.2 T0代转基因小麦的 qPCR 分析 对 18个分
子检测为阳性且不同病级的 T0代转基因植株和 2个
受体对照植株内源 Mlo 的 qPCR 分析结果表明, 与
受体对照相比, 绝大多数转基因植株的 Ta-Mlo基因
表达量显著降低(图 5), 说明反义基因的导入能有效
地沉默其内源 Mlo 基因, 但不同转基因植株降低的
程度并不一致。高感植株的 Ta-Mlo基因的表达量都
比较高并接近感病受体品种, 但表现中抗和中感的
转基因植株的抗性水平和 Ta-Mlo 基因的表达量并
不完全对应, 说明转基因植株表现出的抗病性可能
还受体内复杂的分子机制调控。
2.3 T1代转基因植株的 BASTA抗性分析
PCR检测呈阳性的 T1代转基因植株经 BASTA水
溶液处理 10 d后, 叶片上涂抹 BASTA的部位虽有些
脱水但仍然透绿, 而对照叶片上涂抹 BASTA 的部位
明显变黄枯死(图 6)。这与分子检测的结果相一致, 说
明 BAR基因也导入到受体小麦中并且可遗传到 T1代。
2.4 转反义 Ta-Mlo基因小麦的白粉病抗性鉴定
接种白粉菌 7 d后, 非转基因对照充分发病, 病
级为 4 级, 表现为高感; 以扬麦 158 为受体的 33 株
T0代转基因植株中有 1株表现近免疫(0; 级), 2株表
现高抗(1级), 17株表现中抗到中感(2级和 3级); 以
济麦 20为受体的的 30株 T0代转基因植株中有 3株
表现高抗, 3 株表现中感(表 1)。由此可见, 反义
Ta-Mlo基因的导入在某些情况下能够使转基因植株
的白粉病抗性提高。
将经过白粉病抗性鉴定且 T0代分子检测为阳性
的 18个转基因单株的种子播种获得 T1代植株, 苗期
剪叶片提取 DNA 进行目标基因的 PCR 鉴定后, 阳
性植株和受体对照同时接种小麦白粉病混合菌进行
抗性分级鉴定。结果表明, T1代不同株系中对白粉病
的抗性发生了分离, T0 代为抗病单株的后代多数仍
表现抗病, T0代为感病单株的后代则仍表现感病(表
2)。说明由反义基因导入造成的 Mlo 基因沉默能够
有效地遗传给下一代。
2.5 T1 代转基因小麦接种白粉菌后孢子发育的
观察
在接种白粉菌 12 h后, 不同受体背景的抗病转
基因材料(简称抗病材料)和感病受体材料(简称感病
材料)叶片的表皮细胞内, 白粉菌侵入点下方均可观
察到明显的乳突反应(图 7-a, b), 抗、感材料的乳突
在产生初期差异不明显, 说明小麦在白粉菌侵入早
期均有一定程度的乳突反应。随着侵染时间的延长,
抗、感材料中形成乳突的孢子百分率都逐渐增加 ,
于接种后 24 h达到峰值, 但感病受体材料不如抗病
转基因材料增加显著, 说明抗病转基因材料乳突的
形成速度较快。此后感病材料中观察到乳突形成的
孢子所占百分率逐渐降低, 抗病材料中也逐渐降低,
但降低的趋势较缓慢, 在接种后 30、36和 48 h时抗、
感之间呈现出显著差异(图 8-A), 说明抗病材料中乳
突维持的时间较长, 抑制或延缓了白粉菌的进一步
发育。
经考马斯亮蓝染色, 不同受体背景的抗、感材
第 3期 邢莉萍等: 小麦 Mlo反义基因的转化及转基因植株的白粉病抗性分析 435
图 5 以 qPCR分析转基因植株及受体中 Ta-Mlo的相对表达量
Fig. 5 Relative expression of Ta-Mlo in transgenic plants and acceptor controls by qPCR analysis
Y158和 J20分别为受体对照扬麦 158和济麦 20; Y-1至 Y-10为以扬麦 158为受体的转基因株; J-1至 J-8为以济麦 20为受体的转基因株。
Y158 and J20 are recipient controls of Yangmai 158 and Jimai 20, respectively; Y-1 to Y-10 are transgenic Yangmai 158 plants; and J-1 to J-8
are transgenic Jimai 20 plants.
图 6 T1代转基因植株的 BASTA抗性分析
Fig. 6 BASTA resistance test of T1 transgenic plants
1: 扬麦 158; 2: 济麦 20; 3: Y158-1; 4: Y158-2; 5: J20-1; 6: J20-2。
1: Yangmai 158; 2: Jimai 20, 3: Y158-1; 4: Y158-2; 5: J20-1; 6: J20-2.
料在接种白粉菌 12 h后, 有孢子侵入的叶片表皮细
胞内可以观察到少量的吸器形成, 随着接种时间推
移, 感病材料中吸器数目迅速增加, 抗病材料的吸
器数目也逐渐增加, 但增加的速度相对较缓慢。接
种后 24 h, 以扬麦 158和济麦 20为受体的抗病转基
因材料的吸器形成百分率分别达峰值 22%和 19%,
随后逐渐下降, 在接种后 48 h降至 7%~8%, 而 2个
感病受体对照的吸器形成百分率在接种 24 h后维持
在 50%~65%左右(图 8-B)。同时, 可以观察到吸器形
态在抗、感材料间也有显著的差异, 感病材料在接
种后 24 h开始出现大量正常的指状吸器(图 7-c), 而
抗病转基因材料的白粉菌侵入的细胞内观察到吸器
数目较少, 且吸器的形态偏小或畸形(图 7-d)。说明
由于转基因材料的抗性作用使吸器的发育受阻, 白
粉菌孢子无法吸收寄主营养而进一步发育, 从而转
基因材料表现为抗病。
3 讨论
大麦 Mlo基因的隐性突变(mlo)可以使大麦获得
对几乎所有已知大麦白粉病菌生理小种的广谱、高
效和持久抗病性。Wolter 等[18]认为 Mlo 基因缺失或
移码突变成为 mlo后, 不能合成有正常功能的 MLO
蛋白, 因此对细胞死亡的负调控作用被解除, 同时
可引起细胞壁加厚 , 有助于防止白粉病菌的侵染 ,
由此引发广谱抗病性。Uwe 等[19]研究表明 MLO 蛋
白通过抑制抗真菌基因(avrMla)的防御反应 , 抑制
由病原物相关分子表型 (PAMP)引发的基础抗性
(PTI), 导致感病性。进而 Panstruga[20]提出了大麦
Mlo 与白粉病菌的互作模型, 白粉菌萌发的芽管附
着在表皮细胞上后, PAMPs 引发信号传导, 激发大
麦获得性免疫系统, 从而导致了一系列的生化免疫
反应, 促进白粉菌的生长。Mlo基因与白粉病菌互作
的分子机制研究表明 , mlo 抗性的完全表达需要
Ror1、Ror2基因的参与[21]; 一种小 G-RACB蛋白与
大麦 mol抗性密切相关, 能够调节MLO对白粉病菌
的感病性[22]; 据报道, MLO 蛋白还是一种钙调素结
合蛋白, 对抗性基因的负调控作用会被病原菌侵入
激活, 可能参与植物抗病性反应的细胞信号传导[23]。
上述大麦 Mlo 基因在白粉病抗性中的功能和机
制的研究为小麦的直系同源基因的研究提供了启
示。根据 NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
查找, 目前小麦中克隆的 Mlo 家族成员和同源序列
有 18个。Shogo等[24]从盐胁迫的小麦幼茎和根部分
离出 7个组织特异性表达的小麦MLO蛋白家族成员,
并通过比对水稻等模式生物的同源序列进行了系统
436 作 物 学 报 第 39卷
表 1 T0代转化植株苗期小麦白粉病抗性鉴定
Table 1 Evaluation of wheat powdery mildew resistance for seedling T0 transgenic plants
不同病级的株数 Number of plants with different disease levels 转化受体
Recipient genotype 0 0; 1 2 3 4
合计
Total
扬麦 158 Yangmai 158 0 1 2 2 15 13 33
济麦 20 Jimai 20 0 0 3 0 3 24 30
病级 0为免疫; 病级 0;和 1为高抗; 病级 2为中抗; 病级 3为中感; 病级 4为高感。
Disease resistance are classified into immunity (infection type 0), high resistance (infection types 0; and 1), moderate resistance (infec-
tion type 2), moderate susceptibility (infection type 3), and high susceptibility (infection type 4).
表 2 T1代转化植株苗期小麦白粉病抗性分级鉴定
Table 2 Evaluation of wheat powdery mildew resistance for T1 transgenic plants at seedling stage
T1代白粉病不同病级的植株数
Number of T1 plants with different infection types to Bgt
株系
Line
T0代病级
Infection type of T0
plants
T0代抗性类型
Response of T0
generation
T1代观察株数
Observed T1
plants 0 0; 1 2 3 4
Y158 4 HS 20 0 0 0 0 0 20
Y-1 0; HR 20 0 13 0 5 1 1
Y-2 1 HR 17 0 1 7 4 2 3
Y-3 1 HR 16 0 0 4 8 4 0
Y-4 2 MR 15 0 0 0 6 5 4
Y-5 2 MR 14 0 0 0 3 9 2
Y-6 3 MS 14 0 0 0 1 3 10
Y-7 3 MS 10 0 0 0 0 4 6
Y-8 3 MS 13 0 0 0 0 11 2
Y-9 4 HS 13 0 0 0 0 6 7
Y-10 4 HS 16 0 0 0 0 3 13
J20 4 HS 20 0 0 0 0 2 18
J-1 1 HR 18 0 0 16 0 2 0
J-2 1 HR 19 0 0 12 4 0 3
J-3 1 HR 18 0 0 6 9 2 1
J-4 3 MS 17 0 0 0 0 12 5
J-5 3 MS 11 0 0 0 0 6 5
J-6 3 MS 18 0 0 0 0 6 12
J-7 4 HS 13 0 0 0 0 1 12
J-8 4 HS 16 0 0 0 0 2 14
Y158和 J20为未转基因对照扬麦 158和济麦 20, 其他为转基因株系。HS: 高感; MS: 中感; HR: 高抗; MR: 中抗。
Y158 and J20 are recipient controls of Yangmai 158 and Jimai 20, respectively, and other lines are transgenic lines. HS: highly sensitive;
MS: moderately sensitive; HR: highly resistant; MR: moderately resistant.
图 7 白粉菌发育的显微镜观察
Fig. 7 Microscopic observation of Bgt fungal structures
a: 接种后 12 h, 白粉菌在感病受体扬麦 158的表皮细胞内形成乳突; b: 接种后 12 h, 白粉菌在抗病转基因系 Y-1-9的表皮细胞内形成
乳突; c: 接种后 24 h, 白粉菌在感病受体扬麦 158的表皮细胞内形成正常的吸器; d: 接种后 24 h, 白粉菌在抗病转基因系 Y-1-9的表
皮细胞内形成畸形的吸器。C: 分生孢子; PA: 乳突; AGT: 附着胞芽管; HA: 吸器; SH: 二级菌丝。
a: Papilla formations in epidermal cells of the susceptible Yangmai 158 at 12 h after Bgt inoculation; b: Papilla formations in epidermal cells of the
resistant transgenic line Y-1-9 at 12 h after Bgt inoculation; c: Normal haustorium formations in epidermal cells of the susceptible Yangmai 158 at 24
h after Bgt inoculation; c: Abnormal haustorium formations in epidermal cells of the resistant transgenic line Y-1-9 at 24 h after Bgt inoculation.
C: condium; PA: papilla; AGT: appressorium germ tube; HA: haustorium; SH: secondary hypha.
第 3期 邢莉萍等: 小麦 Mlo反义基因的转化及转基因植株的白粉病抗性分析 437
图 8 白粉菌侵染点孢子发育的统计分析
Fig. 8 Statistic analysis of fungal development at infected site
A: 形成乳突的孢子占观察侵染孢子总数的百分比; B: 形成吸器的孢子占观察侵染孢子总数的百分比。柱形图上方字母表示在转基因
系和受体对照材料间有显著差异(P<0.05)。Y158: 扬麦 158; Y-1-9: 转 Ta-Mlo扬麦 158; J20: 济麦 20; J-2-7: 转 Ta-Mlo济麦 20。
A: Percentage of papilla at Bgt infected site (%); B: Percentage of haustoria at Bgt infected site (%). Bans superscripted by different letters
are significantly different between transgenic line and acceptor control at P < 0.05. Y158: Yangmai 158; Y-1-9: Ta-Mlo transgenic Yangmai
158; J20: Jimai 20; J-2-7: Ta-Mlo transgenic Jimai 20.
进化研究; 劭伯飞[25]克隆的 TaMlo3基因(AF336105)
在抗病品种中的表达丰度持续非常低, 而在感病品
种中表达丰度高, 且表达量在白粉菌接种后 6 h 达
到最低后逐渐恢复正常, 说明 TaMlo3的表达量与抗
性抑制程度有关; 徐红明等[26]和孙燕飞等[27]的研究
也显示, Mlo 基因在小麦与白粉菌亲和互作中的表
达高峰远远高于与非亲和组合。Eva等[29]采用大麦条
花叶病毒(BSMV)介导的基因沉默(VIGS)的方法抑制
感病小麦中 TaMlo 基因(GenBank 登录号为 AF361933)
的表达, 接种白粉菌后发现 Mlo 基因沉默的植株的
抗病性增加, 微观表现为次级菌丝和菌落的形成率
较对照显著降低, 说明小麦内源 Mlo 基因的沉默可
提高感病小麦的白粉病抗性, 但未在稳定转化情况
下验证。赵同金等[13]和吴莹莹[28]分别对大麦 Mlo基
因和小麦 Mlo 基因的反义序列进行转化小麦研究,
获得了抗白粉病小麦转基因植株, 但未对小麦内源
Mlo 基因沉默的效率进行检测, 亦未对转反义 Mlo
基因小麦的白粉病菌侵入进行细胞学观察。本实验
室于玲等[14]克隆了小麦 Ta-Mlo基因, 其核苷酸序列
与大麦 Mlo 基因的同源性为 92%, 编码蛋白相似性
为 89%; Northern杂交结果表明, 在感病亲本扬麦 5
号和抗病易位系中, Ta-Mlo 均能被白粉菌诱导增强
表达, 但表达方式有差异, 显示了与白粉病抗性有
密切关系。本研究采用反义基因转化技术, 获得了
转反义 Ta-Mlo基因的抗白粉病的转基因植株, qPCR
分析表明转基因植株内源 Mlo 基因表达量显著下降
且与其白粉病抗性水平有一定关联。对白粉菌入侵
的组织解剖学观察发现 , 在小麦白粉菌入侵小麦
Mlo 基因沉默的转基因植株细胞时, 白粉菌乳突的
形成加快和维持时间延长, 吸器的发育受抑制, 说
明转基因植株表现抗病性。本研究为揭示 Mlo 介导
的小麦白粉病抗性的细胞学机制提供了依据。以上
结果均说明由 Mlo 基因的缺失、突变和表达受抑制
而获得的对白粉病的广谱抗性在大麦和小麦中可能
具有相似的机制。
反义技术是通过形成靶基因转录产物的反义链,
并以碱基配对的方式与靶基因转录产物的特定互补
区域结合, 抑制基因的翻译, 从而参与调控有关基
因的表达[30]。由于反义技术对 mRNA翻译的阻抑不
像 RNA干涉那样存在放大效应, 因此一般反义技术
只能部分抑制或减弱基因的表达, 再加上小麦是异
源六倍体, 含有多个 Mlo 同源基因, 所以我们获得
的转基因植株个体间的差异比较大, 其沉默的机制
尚不完全清楚, 由该基因沉默引发内源抗病通路表
达的改变还需进一步研究。
4 结论
采用基因枪法将小麦反义 Mlo 基因导入扬麦
158 和济麦 20 中, 获得 Mlo 基因发生沉默的转基因
小麦阳性植株, 其中 6个转基因株系对白粉病高抗。
Mlo 反义基因的导入明显加快了乳突的形成和维持
时间, 有效抑制了吸器的发育, 因而转基因材料表
现抗病性。
438 作 物 学 报 第 39卷
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