全 文 ：Vol131 , No16
pp1 686 - 691 　Jun1 , 2005作 　物 　学 　报ACTA AGRONOMICA SINICA第 31 卷 第 6 期2005 年 6 月 　686～691 页
葡萄糖氧化酶基因转化小麦的研究
康　乐　叶兴国 3 　徐惠君　杜丽璞 Ξ
(中国农业科学院作物科学研究所 ,北京 100081)
摘 　要 : 葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase , GO)在植物抵抗真菌和细菌感染时起重要作用 ,但将 GO 基因转入小麦的研究目
前还未见报道。本研究利用基因枪介导法将来源于黑曲霉的 GO 基因转入优良小麦品种扬麦 10 号、鲁麦 22 和鲁麦 23 ,
从轰击的 3 300 块幼胚愈伤组织中 ,获得了 246 棵再生植株 ,经 PCR 鉴定 ,其中的 31 棵含有 GO 基因 ,PCR 阳性植株比例
为 0194 %。T1 代经 Southern blotting分析 ,证明 GO 基因已整合到小麦基因组中。T2 代植株淀粉2碘化钾染色结果证实 GO
基因已在蛋白质水平表达。对 T2 代植株进行了白粉病抗性鉴定 ,结果在 34 个转基因株系中有 23 个株系的病情指数低
于相应的非转基因对照。T1 代转基因植株经 PCR 分析 ,筛选到 48 株含有 GO 基因而不带有筛选标记基因 ( bar)的植株。
关键词 : 小麦 ;葡萄糖氧化酶基因 ;基因枪转化法
中图分类号 : S512
Transferring Glucose Oxidase Gene into Wheat by Biolistic Particle
KANGLe , YE Xing2Guo 3 , XU Hui2Jun , DU Li2Pu
( Institute of Crop Sciences , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081 , China)
Abstract : It is difficult to prevent and control wheat diseases only by traditional disease2resistant breeding technique1 In
such case , plant genetic engineering might provide a new approach to make use of disease2resistant resource from different
species1 Some foreign genes such as Glucose Oxidase( GO) plays a very important role in plant disease resistance caused by
bacteria and fungus pathogens , while , no study has been reported on the transfer of GO gene into wheat1 In addition ,
biosafty of transgenic crops has been strengthened in these years by farmers and scientists worldwide1 Therefore , it will be
very necessary to introduce GO gene isolated from Aspergillus nige into wheat and create new marker2free germplasm for its
breeding1 13 - 14 days after pollination , wheat immature embryos were collected and pre2cultured on callus2induction
mediumfor 7 days , and then these calli were bombarded by gold particles coated with mixed plasmids of pUbi2GO and
pAHC20 at the ratio of 1∶1 , in which GO gene and bar gene were contained respectively1 The bombarded calli were
selected on the medium with 3 - 5 mgΠL bialaphos for several times1 At last , 246 regeneration plantlets were obtained from
33002bombarded calli , and the ratio of PCR positive plants to calli bombarded was 0194 %1 By PCR analysis and southern
blotting analysis , it was proved that GO gene was integrated into the host’s chromosomes in T1 plants(Fig13 , Fig14) 1 The
result of starch2KI stainning in T2 generation lines indicated that GO gene was expressed and showed enzyme activity1 To
identify GO gene’s function in wheat , powdery mildew was artificially inoculated onto T2 plants , the statistics result
indicated that the disease index of some transgenic plants were lower than wild type plants , among which line 86 , line 105
and line 113 were identified to be with available resistance to powdery mildew1 At the same time , 48 plants with GO gene
but without bar gene were screened in T1 generation , this work paved the way of removing bar gene from transgenic plants
for their environment release1
Key words :Wheat ; Glucose oxidase gene ; Biolistic co2transformation
基金项目 : 国家转基因植物研究与产业化专项资助课题 ( Y032B222) 。
作者简介 : 康乐 (1973 - ) ,女 ,作物遗传育种专业硕士研究生。3 通讯作者 (Corresponding author) :叶兴国 (1963 - ) ,博士、研究员 ,主要从事
小麦和大豆遗传转化研究。E2mail :yexg @mail . caas. net . cn
Received(收稿日期) :2004205224 ,Accepted(接受日期) :20042112081

　　小麦是世界上主要的粮食作物之一 ,但每年因
病害减产十分严重 ,因此 ,增强小麦抗病性从而提高
小麦产量成为十分迫切的问题。常规抗病育种对农
业生产做出了卓越的贡献 ,但不能克服抗原缺乏和
选育周期长的困难。随着 DNA 重组、植物组织培养
及植物转化技术的发展 ,植物基因工程为抗病育种
开辟了一条新途径。
植物受到病原微生物侵染以后 , 往往产生一系
列防御反应 , 包括细胞壁加固、细胞过敏性坏死及
防御相关基因的表达。随着这些反应的发生 ,细胞
内产生的活性氧 (active oxygen species , 简称 AOS) 及
H2O2 等是研究较多的与抗逆信号传递有关的分子 ,
它不仅对病原微生物有直接的抑杀作用 , 而且和相
关的 AOS一起被认为在植物的超敏反应和系统获
得性抗性中起十分重要的作用[1 ] 。例如在白桦中 ,
H2O2 起到接受外界压力继而调节抗病基因表达及
细胞死亡分子信号的作用[2 ] 。
葡萄糖氧化酶是由 Muller 于 1928 年在黑曲霉
抽提物中发现的[3 ] , 它在有氧条件下可以催化β2D2
葡萄糖氧化生成 H2O2 和葡萄糖酸 ,目前在植物和动
物中尚末发现控制该酶的基因。用 GO 处理植物
体 ,可导致晚期防御基因的表达。Kachroo 等将 GO
基因以组成型和诱导型表达系统转化水稻[4 ] ,结果
显示 ,无论是组成型还是诱导型表达系统产生的
H2O2 达到一定浓度时都会导致细胞死亡 ,亚致死浓
度的 H2O2 足以激活细胞防卫基因表达 ,从而诱发植
株抗病机制。组成型所表达的 GO 及其相应的酶活
性比诱导型高 3～10 倍 ,高水平的酶活性导致了种
子活力降低 ,而病原诱导型的转化系统能够有效赋
予植株广谱抗病性 ;Wu[5 ] 、甄伟[6 ] 、彭昊[7 ] 和 Orozco2
Cardenas[8 ]等也分别将 GO 基因转化至马铃薯、烟
草、水稻、棉花 ,证明转基因植株对马铃薯软腐病、水
稻稻瘟病等具广谱抗性。上述研究表明 , GO 基因
在植物抗病基因工程育种中具有良好的应用前景。
但在小麦基因工程研究中还未见报道。本研究的目
的是将 GO 基因转入小麦优良品种 ,创造小麦抗病
新种质。
随着转基因技术的发展和转基因植物的商品
化 ,生物安全性问题已成为人们研究和关注的热
点[9 ] 。在转基因环境安全方面 ,抗除草剂基因通过
有性杂交漂移到其野生近缘种或杂草是主要的危机
问题 ,因此有必要培育无标记基因的转基因植物。
本研究利用共转化法将包含目的基因与筛选标记基
因两个独立的质粒载体同时转化受体 ,从而可以在自
交后代有目的地选留无筛选标记的转基因植株。
1 　材料和方法
111 　小麦材料和外植体
　　供试小麦材料为本实验室所保存的扬麦 10 号、
鲁麦 22 和鲁麦 23。取授粉后 14 d 左右的幼胚为外
植体 ,接种在 MM 培养基上 ,26 ℃黑暗条件下诱导愈
伤组织[10] ,预培养 7 d 作为基因枪轰击的靶材料。
112 　质粒载体
含有 GO 基因的质粒载体 pTGO 由中国农业科
学院生物技术研究所王志兴博士提供 ; 带有
Ubiquitin 启动子和选择标记 bar 基因的 pAHC20 质
粒载体为本实验室所保存 , bar 基因 (膦丝菌素乙酰
转移酶基因) 具有除草剂 Bialaphos 和 Basta 抗性 ,在
培养基上可用 Bialaphos 对表达 bar 基因的愈伤组织
进行筛选 ,在田间可用 Basta 对表达 bar 基因的植株
进行筛选。为了利于 GO 基因向小麦中的转化和在
小麦中的表达 ,我们对 pTGO 进行了改造。将 pTGO
上的 CaMV35S 启动子换成了来自于 pAHC20 的
Ubiquitin 启动子。改造后的质粒命名为 pUbi2GO ,质
粒改造过程如图 1 所示。
113 　基因枪共转化法
将质粒 pUbi2GO 和 pAHC20 按摩尔比 1∶1 充分
混合 ,包裹在直径为 116μm 的金粉微粒上 ,用 PDS2
1000ΠHe 基因枪 (Bia2Rod 公司生产) 轰击靶材料[11 ] 。
将黑暗条件下预培养 7 d 的愈伤组织集中在培养皿
中央 ,经 014 molΠL 渗透压培养基 (MM 培养基[11 ] 添
加 012 molΠL 甘露醇和 012 molΠL 山梨醇) 处理 4～6
h 后进行基因枪轰击 ,轰击后的愈伤组织继续在原
渗透压培养基上处理 16～18 h ,然后转入 MM 培养
基 ,26 ℃黑暗条件下恢复培养 2 周[11 ] 。
114 　转化体筛选和植株再生
恢复培养 2 周的愈伤组织在分化和筛选培养基
(MM + 1 mLΠL 2 , 42D + 1 mLΠL KT + 3～ 5 mgΠL
Bialaphos)上诱导分化和筛选 4 周 ,每日 26 ℃10 h 光
照[10] ,分化出绿芽后移至无激素筛选培养基 (1Π2 MS +
3～5 mgΠL Bialaphos) 上继续筛选 ,温度与光照同前 ,
直到小苗伸长到 1～2 cm 时 ,移至壮苗培养基 (1Π2
MS + 015 mgΠL IAA + 5 mgΠL Bialaphos) 上 ,待再生
植株生长到适宜大小 (苗高 6～8 cm ,根系较好)时移
入花盆 ,温室中生长。
786　第 6 期 康 　乐等 :葡萄糖氧化酶基因转化小麦的研究 　　　

图 1 质粒改造过程
Fig. 1 Process of modifying the plasmid vector
115 　PCR扩增分析
采用 SDS 法从转基因小麦植株中提取基因组
DNA ,以其为模板进行 PCR 扩增 , GO 基因的引物序
列为 5′2CCTTGCTCATCCAGTACGAGAACTA23′和 5′2
GACATTTGCGTAGGAGGAATAGAACC23′; bar 基因的
引物序列为 5′2AAGCACGGTGAACTTCCGTA23′和 5′2
GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC23′。
116 　Southern blotting 分析
用 Pst Ⅰ消化转基因和阴性对照小麦总 DNA
(在 GO 基因内部有两个 Pst Ⅰ位点 ,相距 975 bp) ;用
Pst Ⅰ完全消化 pUbi2GO ,回收 975 bp 大小的含有
GO 基因部分序列的片段作为标记探针的模板 ,用
随机引物法掺入32 P ,标记探针 ;并用此 975 bp 大小
的片段稀释后作为阳性对照。小麦总 DNA 和阳性
对照在 018 %琼脂糖凝胶上电泳后转移到尼龙膜
上 ,用于 Southern blotting 分析。
117 　淀粉2碘化钾染色分析
将转基因小麦植株呼吸旺盛的根部浸泡在淀粉2
碘化钾溶液 (含 215 %淀粉、100 mmolΠL 碘化钾) 中 ,
于室温静置观察溶液的颜色变化。
118 　叶片涂抹除草剂实验
用 30～50μmolΠL 的 Basta 溶液涂抹再生植株叶 片[12 ] ,1 周内观察结果。119 　白粉病抗性鉴定在温室中种植 T2 代植株 ,抽穗前接种白粉病菌混合生理小种孢子 ,3 周后观察并记录发病反应型和严重度 ,统计病情指数。2 　结果与分析211 　再生植株的获得和 PCR分析　　共轰击了扬麦 10 号、鲁麦 22 和鲁麦 23 小麦幼胚愈伤组织 3 300 块。轰击后的愈伤组织恢复培养2 周后 ,在含有 2 mgΠL、3 mgΠL、5 mgΠL 和 3 mgΠLBialaphos 的分化培养基上先后进行 4 次筛选 ,抗性愈伤组织分化出绿色的抗性芽 ,而大部分愈伤组织因不表达 bar 基因而逐渐褐变死去。从诱导愈伤组织至移栽抗性苗经历了 22 周 ,共获得 246 株抗Bialaphos 的再生植株。从苗期再生植株叶片中提取基因组 DNA 作为模板进行 GO 基因的 PCR 扩增 ,以质粒 pUbi2GO 作为阳性对照 ,以未转基因植株扬麦 10 号基因组 DNA作为阴性对照。扩增产物在 1 %琼脂糖凝胶上电泳 ,结果如图 2 所示 ,阳性对照和再生植株 1～8 中扩增出498bp的特异性片段 ,而阴性对照中没有扩
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图 2 T0 代植株 GO 基因 PCR分析
Fig. 2 PCR analysis of T0 generation plants for GO gene
1～8 :阳性植株 ;9 :阴性对照 ;10 :阳性对照 ;
11 :分子量标准。箭头所示为 498 bp 的扩增片段。
1～8 :PCR positive plants ;9 :negative control ;10 :positive control ;
11 :marker1 Arrow shows the 498 bp fragment from PCR1增出目的片段。 　　246 棵再生植株经 PCR 鉴定后 ,有 31 株表现为阳性 , PCR 阳性植株数与轰击愈伤组织数比例为0194 %(表 1) 。扬麦 10 号、鲁麦 22 和鲁麦 23 再生植株 PCR 阳性比率分别为 1159 %、0125 %和 0125 % ,扬麦 10 号再生植株PCR 阳性比率明显高于鲁麦 22和鲁麦 23。212 　T1 代转基因植株的 PCR 检测和 Southernblotting 分析　　将 T0 代植株上收获的种子按株系播种到大田 ,苗期从 T1 代植株叶片中提取基因组 DNA ,以其为模板进行 PCR 鉴定 (图 3) ,共检测了 301 株 ,其中的 60株 (来自 20 个株系)含有 GO 基因片段 ,20 个 T1 代株系均有分离 ,分离比例差异很大 ,有的接近 3∶1 ,有的只有 0105∶1 ,普遍低于 3∶1 孟德尔分离比例 (表 2) 。
表 1 基因枪转化 3 个小麦品种的结果
Table 1 Transformation results of three cultivars by biolistic particle
试验品种
Genotype
轰击胚数
Calli bombarded
再生植株数
Regeneration plants
阳性植株数
PCR positive plants
PCR + 植株与轰击胚数的比例
Ratio between PCR positive plants
and calli bombarded ( %)
扬麦 10 号 Yangmai 10 1700 188 27 1159
鲁麦 22 Lumai 22 1200 41 3 0125
鲁麦 23 Lumai 23 400 17 1 0125
共计 Total 3300 246 31 0194
表 2 T1 代转化植株 GO 基因的 PCR分析结果
Table 2 PCR results of T1 lines for GO gene
T1 代株系号
Code of T1
generation lines
T1 代检测植株数
T1 generation
plants detected
T1 代 PCR +
植株数
PCR positive plants
阳性植株与
阴性植株比例
Positive ratio
T121 13 4 0144∶1
T122 16 3 0123∶1
T123 12 1 0109∶1
T124 15 2 0115∶1
T125 18 1 0106∶1
T126 19 1 0106∶1
T127 17 1 0106∶1
T128 19 4 0127∶1
T129 12 4 0150∶1
T1210 8 6 3100∶1
T1211 11 1 0110∶1
T1212 21 10 0190∶1
T1213 10 1 0111∶1
T1214 16 2 0114∶1
T1215 7 1 0117∶1
T1216 11 2 0122∶1
T1217 20 1 0105∶1
T1218 12 1 0109∶1
T1219 20 3 0118∶1
T1220 24 11 0185∶1
总株数 Total 301 60 0120ν1 图 3 T1 代植株 GO 基因的 PCR分析Fig. 3 PCR analysis of T1 plants for GO gene1～8 :阳性植株 ;9 :阴性对照 ;10 :阳性对照 ;11 :分子量标准。箭头所示为 498 bp 的扩增片段。1～8 :PCR positive plants ;9 :negative control ;10 :positive control ;11 :marker1 Arrow shows the 498 bp fragment from PCR1　　为了检测 GO 基因在小麦基因组中的整合情况 ,选取 T1 代 6 个 PCR 阳性植株 (以扬麦 10 号为受体) 和一个相应的未转基因植株进行 Southernblotting 分析。杂交结果如图 4 所示 ,阳性对照和PCR 阳性植株中有杂交信号 ,而阴性对照中没有杂交信号 ,表明 GO 基因已整合到了小麦基因组中。213 　T2 代植株 GO 基因表达活性鉴定用淀粉2碘化钾染色法定性检测 T2 代植株中GO 基因的表达。如果转基因植株中 GO 基因表达的 GO 能将葡萄糖氧化并放出 H2O2 ,H2O2 就会与溶
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图 4 T1 代植株 GO 基因的 Southern blotting 分析
Fig. 4 Southern blotting analysis of
T1 generation plants for GO gene
1～6. 阳性植株 ; 7. 阴性对照 ; 8. 阳性对照。
箭头所示为 975 bp 的杂交信号。
1～6 :positive plants ; 7 :negative control ; 8 :positive control1
Arrow shows the 975 bp hybridization signal1
液中的 KI 发生歧化反应产生 I ,I继而使溶液中的淀
粉呈蓝色。染色 4 h 后观察发现 ,部分转 GO 基因的
无菌苗能使淀粉溶液变蓝 ,而非转基因无菌苗不能
使淀粉变蓝。这个结果说明 GO 基因已在蛋白质水
平表达并且能催化葡萄糖氧化放出 H2O2 。一共染
色处理了 96 株 ,其中有 24 株使溶液呈现蓝色 ,阳性
比率为 2510 %。
214 　T2 代植株白粉病抗性鉴定
为了证实 GO 基因在小麦中的功能 ,在温室中
对 T2 代转基因植株进行了白粉病抗性鉴定。表 3
比较了对照和各转基因株系的病情指数 ,转基因株
系的病情指数普遍略低于相应对照株系。以鲁麦
22 为受体的 7 个转基因株系中 ,有 6 个株系的病情
指数比对照低 ;以扬麦 10 号为受体的 27 个转基因
株系中 ,有 17 个株系的病情指数比对照低。
表 3 T2 代株系的病情指数
Table 3 Disease index of T2 lines
株系Line CK1 82 83 84 85 86 87 88
病情指数 Disease index 0182 0192 0181 0173 0178 0163 0171 0174
株系Line CK2 92 93 94 95 96 97 98 99 100
病情指数 Disease index 0171 0165 0167 0170 0178 0169 0180 0157 0160 0181
株系Line 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110
病情指数 Disease index 0173 0168 0185 0183 0170 0173 0156 0163 0169 0168
株系Line 111 112 113 114 115 116 118 119
病情指数 Disease index 0166 0180 0152 0170 0160 0179 0171 016
　　注 :CK1 :鲁麦 22 ;82～88 :以鲁麦 22 为受体的转基因株系 ;CK2 :扬麦 10 号 ;92～119 :以扬麦 10 号为受体的转基因株系。
Notes : CK1 : Lumai 22 ; 82 - 88 : transgenic Lumai 22 lines ; CK2 : Yangmai 10 ; 92 - 119 : transgenic Yangmai 10 lines1
215 　转基因植株中 bar 基因的检测
21511 　再生植株叶片涂抹除草剂实验 　　Basta 是
膦丝菌素的商品名 ,是一种广泛使用的除草剂。Basta
可抑制谷氨酰胺合成酶活性 ,从而导致敏感的非转化
细胞发生氨的致死性累积[13] 。对部分再生植株叶片
涂抹 50 ×10 - 6 %的 Basta ,1 周后观察结果 ,表达 bar
基因的转基因植株叶片没有枯死 ,而非转基因植株叶
片形成枯死斑。说明部分再生植株中已经转入了 bar
基因 ,并且表现出膦丝菌素乙酰转移酶活性。
21512 　T1 代植株 bar 基因的 PCR 检测 　　对 60 株
T1 代 GO 基因阳性植株进行了 bar 基因的 PCR 分
析 ,结果表明 ,其中的 18 株扩增出了 bar 基因 412
bp 的特异带 (图 5) 。其余的 42 株只含有 GO 基因
而不含有 bar 基因。
3 　讨论
许多研究认为 ,外源基因在 T1 代的分离比例符
合 3∶1 的孟德尔遗传规律[14 ,15 ] 。但是显性个体比例
显著低于孟德尔比例的现象也普遍存在[16 ] 。本研
究中 GO 基因在 T1 代中的分离比例不符合孟德尔
图 5 T1 代转基因植株 bar 基因的 PCR分析
Fig. 5 PCRanalysis of bar gene in T1 generation transgenic plants
1～8 :阳性植株 ;9 :阴性对照 ;10 :阳性对照 ;
11 :分子量标准。箭头所示为 412 bp 的扩增片段。
1 - 8 :PCR positive plants ;9 :negative control ;10 :positive control ;
11 :marker1 Arrow shows the 412 bp fragment from PCR1
分离比例 ,阳性植株比例分布于 0105∶1 和 3∶1 之
间 ,普遍低于 3∶1 孟德尔分离比例。可能由于基因
枪转化过程是一个随机事件 ,使外源基因在受体植
株中遗传行为变得复杂的原故 ,目的基因在传递过
程中由于丢失或损伤等行为致使与正常内源基因的
分离规律不一样 ,从而使得 T1 代的分离比例不均
一 ,单位点的 3∶1 分离比较少。
理论上讲 ,外源基因在自交一代发生分离 ,在自
交二代中能得到纯合体 ,符合孟德尔遗传规律。但
也有一些外源基因在转基因植株中发生沉默、损伤
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或丢失 ,导致不规则的分离[17 ] 。本实验 T2 代 GO 基
因显性表型个体比例没有达到理论值 75 %。用淀
粉2碘化钾溶液处理部分 T2 代植株 ,只有 25 %的植
株表现出 GO 活性 ,明显不符合孟德尔遗传分离规
律。前人研究认为 ,基因枪转化法导入的外源基因
多拷贝整合的可能性较大 ,并且植物体会对外源遗
传物质做出诸如切除、甲基化、重排等排斥反应 ,这
样容易引起转基因沉默[18 ] 。本研究进一步验证了
上述观点。
T2 代植株白粉病抗性鉴定结果表明 ,转基因株
系的病情指数普遍略低于相应的非转基因株系 ,但
是相对于对照来说抗性并没有表现出整齐的大幅度
提高。可能是因为 T2 代株系还没有纯合 ,不能表现
出整个株系的抗性 ;即使有些株系接近纯合 ,但基因
枪转化法引起的转基因沉默现象比较普遍 ,从而导
致一部分 T2 代植株的 GO 基因不能在蛋白质水平
表达。
考虑到转基因植物的生物安全性问题 ,本研究
利用了分别含有 GO 基因和 bar 基因的两个不同载
体 ,以便在转基因后代筛选出只带有 GO 基因而不
带有 bar 基因的植株。T1 代 60 株 GO 基因阳性植株
中有 18 株同时还带有 bar 基因 ,其余 48 株只含有
GO 而不含 bar 基因 ,为在后代中筛选出无标记转基
因小麦纯合株系打下了基础。
选择适宜的转化受体是小麦转基因成功的关键
因素。选用再生能力强的基因型作为受体 ,会大大
提高转化效率。本实验所采用的转化受体品种是扬
麦 10 号、鲁麦 22 和鲁麦 23 ,其中扬麦 10 号再生植
株 PCR 阳性比例达到 1159 % ,适合作为基因枪转化
的受体 ,且扬麦 10 号农艺性状优良 ,生产利用前景
广阔。
本研究将 GO 基因转入小麦品种扬麦 10 号、鲁
麦 22 和鲁麦 23 , GO 基因在蛋白质水平表达 ,并且
使转基因植株的白粉病抗性比对照有所提高。我们
拟对转 GO 基因小麦后代进行进一步的抗病性鉴定。
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(吴宏亚) 1 Study on the gene transferring of Nib8 into wheat for its
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Escision of bar gene from transgenic wheat obtained by biolistic co2
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