全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(9): 15401548 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2010CB126006)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 喻树迅, E-mail: yu@cricaas.com.cn
第一作者联系方式: E-mail: wnhan2013@126.com
Received(收稿日期): 2014-01-23; Accepted(接受日期): 2014-06-16; Published online(网络出版日期): 2014-07-09.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140709.1532.008.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01540
棉花 GhMYB0 基因的克隆、表达分析及功能鉴定
王诺菡 1,2 于霁雯 2 吴 嫚 2 马启峰 1 李兴丽 2 裴文锋 2 李海晶 2
黄双领 2 张金发 2 喻树迅 1,2,
1西北农林科技大学农学院, 陕西杨凌 712100; 2中国农业科学院棉花研究所 / 棉花生物学国家重点实验室, 河南安阳 455000
摘 要: MYB类转录因子是植物转录因子最大的家族之一, 参与控制植物腺毛细胞的模式和形态建成。本研究利用
雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii) D5 基因组数据库以 AtMYB0 (GL1, NM_113708)蛋白为参比序列获得同源基因
GrMYB0, 从徐州 142中克隆了陆地棉的 GhMYB0, 其开放阅读框长度为 843 bp, 编码 280个氨基酸。经过保守结构
域分析和亚细胞定位确定 GhMYB0为 R2R3-MYB转录因子。qRT-PCR的结果表明, GhMYB0在徐州 142开花当天开
始高调表达, 开花后 20 d表达量达高峰; 在所有的组织器官中, 花中表达量最高, 其次为胚珠。转基因功能分析结果
表明, 在野生型拟南芥(Columbia)中过表达 GhMYB0, 使其叶片表皮毛与野生型相比明显减少; 该基因在拟南芥突变
体 gl-1 中过表达, 能恢复表皮毛缺失型突变体的表型, 说明该基因可能对拟南芥表皮毛的形态建成发挥一定作用,
本试验为研究 R2R3-MYB转录因子在棉纤维起始和伸长过程中的调控作用提供有力证据。
关键词: 棉花; MYB转录因子; 植物表达载体构建; 遗传转化
Cloning, Expression, and Functional Analysis of GhMYB0 Gene from Cotton
(Gossypium hirsumtum L.)
WANG Nuo-Han1,, YU Ji-Wen2, WU Man2, MA Qi-Feng1, LI Xing-Li2, PEI Wen-Feng2, LI Hai-Jing2,
HUANG Shuang-Ling2, ZHANG Jin-Fa2, and YU Shu-Xun1,2,
1 College of Agronomy, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 State Key Laboratory of Cotton Biology / Cotton Research Institute,
Chinese Academy Agricultural Sciences, Anyang 455000, China
Abstract: MYB transcription factor, one of the most important protein families in plants, is involved in the regulation of secon-
dary metabolism, morphogenesis of plant, responding to environment stress and plant hormone. In this study, we used D5 genomic
bank of Gossypium raimondii as the reference to AtMYB0 (GL1, NM_113708) protein, and cloned the full-length cDNA of a new
MYB transcription factor gene GhMYB0 from cotton (Gossypium hirsutum L.). The open reading frame of GhMYB0 is 843 bp in
length, which encodes 280 amino acid residues. GhMYB0 was confirmed as R2R3-MYB transcription factor via conserved struc-
ture analysis and subcellular localization. The qRT-PCR result indicated that GhMYB0 was highly expressed at the blossom day,
its expresssion amount reached the peak after 20 days, with the most amount in flower, then in ovules. Transgenic funtion analysis
indicated that GhMYB0 over-expressed in Arabidopsis lines, showing fewer trichomes in leaf epiderm than in that of the wild type,
which suggests that the gene can restore the notrichome phenotype of gl-1 mutant of Arabidopsis. In addition, the transgenic lines
had shorter plant heights, longer vegetative growth time, and pollen abortion.
Keywords: Cotton; MYB transcription factor; Construction of plant expression vector; Genetic transformation
棉花纤维是最大的可再生纺织原料, 同时也是
人工纤维的潜在替代品。棉花纤维细胞是一种不分
支的单细胞, 由胚珠表皮细胞分化、发育而形成, 是
高等植物中伸长最快、发育最长的单细胞, 也是现
在研究单细胞的最好的生物模式[1-2]。所有的表皮细
胞(除气孔保卫细胞和珠孔细胞外)都有可能发育成
纤维原始细胞, 但并非所有的都能分化成纤维。研究
证明约 30%~40%的胚珠表皮细胞分化形成纤维原始
第 9期 王诺菡等: 棉花 GhMYB0基因的克隆、表达分析及功能鉴定 1541


细胞, 但这些原始细胞只有 l/3能形成有效纤维[3]。
MYB 类转录因子是植物转录因子最大的家族
之一, 也是功能最多样化的家族, 现已证实其参与
多种植物代谢途径。植物中第一个被鉴定分离出的
MYB 基因是 1987 年 Paz-Ares 等[4]发现的与玉米色
素合成有关的 Clorless1 基因 c-myb。此后在许多生
物中也相继鉴定出与 c-MYB蛋白同源的蛋白。研究
结果显示拟南芥公布的 1922个转录因子中, MYB类
转录因子约 168个, 占整个拟南芥转录因子总数的
8.74%。玉米的 MYB 转录因子数目也已经超过 80
个, 说明 MYB 基因是由多个成员组成的大家族(植
物转录因子数据库 http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/
index.php)。以 c-MYB为标准, 将 MYB保守结构域
分为 3类(R1、R2、R3)[5], 据 MYB保守结构域重复
种类和数目的不同, 将整个 MYB 转录因子家族分
为 4 类, 其中 R2R3-MYB 是植物 MYB 转录因子中
最大的一类[6]。目前 R2R3-MYB类转录因子研究的
热点主要集中在腺毛发育调节方面, 例如参与控制
腺毛细胞模式和形态建成, 其中研究最为广泛的 2
种模型即拟南芥表皮毛的激活侧抑制模型和棉花纤
维起始的机制[7]。
棉花纤维与拟南芥表皮毛两者都是单细胞, 都
起源于表皮, 两者很可能有类似的发育机制[8-12]。因
此目前在棉花中克隆的纤维特异表达 MYB 基因大
都与拟南芥表皮毛发育相关基因 AtMYB0 (GL1,
NM_113708)同源, 这些 MYB 转录因子的功能主要
集中在调控棉花纤维的起始和伸长 2 个阶段。
AtMYB0是一类 R2R3-MYB转录因子, 其过表达会
抑制拟南芥表皮毛细胞的分化与发育, 功能缺失突
变体为无毛表型[13]。而最早在棉花中分离到的 R2R3-
MYB基因是 GhMYB1-GhMYB6, Loguercio等[14]根据
其表达特征指出 MYB 基因对棉纤维分化起主要作
用。Guan等[15]研究证明 GhMYB2能使拟南芥产生种
皮毛和果夹异位表皮毛, 且与一些负调控因子有协
同作用。在陆地棉中分离出另外 1个 MYB转录因子
GhMYB25, 与金鱼草中的 R2R3-MYB 型转录因子
AmMIXTA 相似, 该基因在长纤维细胞起始时期高
调表达[16]。研究发现在烟草中过量表达 GhMYB25
能增加叶表皮毛分支, 进一步表明棉纤维和表皮毛
发育有关联, 通过激光捕获显微解剖试验表明相对
于无纤维胚珠表皮细胞, GhMYB25 在有纤维起始细
胞中富集表达[17-18]; 另外研究发现棉花 GhMYB109
基因与 AtMYB0 同源性最高[13], 其在纤维起始细胞
和延伸细胞中特异表达, GL1::GhMYB 109能部分互
补拟南芥 gl-1突变体表型[19]。
综上所述, R2R3-MYB 转录因子在决定棉花胚
珠表皮细胞命运、促使纤维原始细胞分化以及在纤
维伸长过程中都发挥着作用。因此本研究利用雷蒙
德氏棉(Gossypium raimondii) D5基因组数据库以拟
南芥 R2R3-MYB 转录因子 AtMYB0 (GL1, NM_
113708)蛋白为参比序列, 同源克隆了一个新的棉花
R2R3-MYB 基因 GhMYB0。在表达模式分析的基础
上对该 R2R3-MYB 转录因子遗传转化拟南芥, 对其
功能进行了验证, 为更进一步解析 R2R3-MYB 转录
因子在决定胚珠表皮细胞命运的调控机制以及在棉
花纤维伸长中的作用提供理论依据, 为棉花分子改
良定向育种奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
陆地棉徐州142及其无绒无絮突变体, 种植于中
国农业科学院棉花研究所南试验场, 田间常规管理,
棉花生长期间, 分别采集野生型的根、茎、叶、花
及野生型 10个发育时期(–3、–1、0、1、3、5、10、
15、20和 25 DPA)的胚珠和纤维。将所有田间材料
立即放入液氮速冻, 于–80℃冰箱保存备用。野生型
拟南芥(Columbia)种植于本课题拟南芥培养室。所用
数据库为雷蒙德氏棉 D5 基因组数据库 (http://
cgp.genomics.org.cn/page/species/index.jsp)。
1.2 总 DNA、RNA提取纯化和 cDNA的制备
采用 CTAB法提取棉花叶片的基因组 DNA[20]。
利用 TIANGEN公司 RNA提取试剂盒参照说明书提
取不同组织和各发育阶段棉花胚珠及纤维的总
RNA。按 TaKaRa (宝生物工程有限公司)反转录试剂
盒说明书合成 cDNA第 1链, –20℃保存备用。
1.3 目的基因的克隆与生物信息学分析
电子克隆以拟南芥(Arabidopsis thaliana, NM_
113708)的AtMYB0蛋白序列为参比序列在雷蒙德氏
棉(Gossypium raimondii) D5基因组中比对调取与其
相似的序列, 在徐州 142 野生型中进行GhMYB0 全
长 cDNA的克隆。采用 Oligo6 软件设计引物
GhMYB0F和GhMYB0R (表 1)。
以 GhMYB0 为查询参比序列 , 在 NCBI 的
GenBank 数据库中搜索与该基因同源的其他物种的
氨基酸序列, 通过 ClustalX2软件进行氨基酸序列比
对, 进行保守结构域分析, 采用 MEGA5.0 软件的
1542 作 物 学 报 第 40卷


Neighbor-Joining算法构建系统进化树, 用 BootStrap
检验, 并重复 1000 次系统进化分子; 用 ProtParam
(http://web.expasy.org/protparam/)进行氨基酸基本理
化性质分析 ; 利用 Predictprotein (http://www.pre-
dictprotein.org/) 和 SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/
services/SignalP/)分别预测跨膜区、功能位点和信号
肽; 由 ProtScale tool (http://expasy.org/tools/pscale/
Hphob.Woods.html)预测蛋白质的疏水性。
1.4 MYB 转录因子的亚细胞定位
构建 35s::GhMYB:GFP 融合表达载体, 引物见
表 1。取一块长、宽大约 4 cm的洋葱幼嫩表皮, 在
固体 MS培养基上 22℃培养 3~4 h。采用 PDS-1000/
He 基因枪(Bio-Rad)轰击洋葱表皮细胞, 可裂膜压力
为 1100 psi, 轰击距离约为 9 cm。于 22℃培养箱中培
养被轰击的洋葱表皮细胞 14~16 h, 于激光共聚焦显
微镜下(Leica, TCS SP2)观察 GFP的表达定位。
1.5 目的基因遗传转化拟南芥的及形态观察
利用在线工具 In-Fusion Primer Design Tool
(http://bioinfo.clontech.com/infusion/convertPcrPrimers-
Init.do)设计 In-GhMYB0 上下游引物(表 1), 构建超
表达载体。将扩增得到的片段利用凝胶电泳回收后,
采用 In-Fusion HD Cloning System 试剂盒(购自
Clontech 公司)与经 BamH I 单酶切后线性化的
pBI121 植物表达载体(由中国农业科学院棉花所早
熟课题组馈赠)相连接, 获得超表达载体。将超表达
载体进行大肠杆菌(DH5α)转化, 由上海生工生物工
程技术服务有限公司测序。然后进行农杆菌转化(由
中国农业科学院棉花所转基因课题组馈赠), 将得到
的阳性菌液采用蘸花法侵染拟南芥野生型植株和
gl-1 突变体[21], 收获成熟 T0代种子。T0代种子经消
毒后, 点播在 MS选择培养板上(1‰卡那霉素)。4℃
下春化 3 d后, 移入光照培养箱(22℃恒温, 24 h光照,
光强 30~40 µmol m–2 s–1)。10 d后挑选深绿色健康真
叶和根伸长至培养基中的转化体。将转化体幼苗移
入土中(营养土∶蛭石=1∶1, v/v), 至收获 T1 代种
子。经卡方检测, 筛选出符合 3∶1 分离比例的 T1
代种子, 种植后获得 T2 代纯系种子。同时, 提取 3
个转基因株系和野生型整株 RNA后进行反转录, 用
qRT-PCR 方法检测目的基因在转基因株系中是否正
常表达(PCR SYBR Green Real-time PCR Master Mix
购自康为世纪), 检测上下游引物 GhMYB0-q (表 1)。
利用 SteREO Discovery.V8 体视显微镜观察转基因
拟南芥叶片及花器官。
1.6 实时荧光定量 RT-PCR
分别提取徐州 142的根、茎、叶、胚珠(0 DPA
和 5 DPA)、以及野生型和无绒无絮突变体不同发育
时期(–3、–1、0、1、3、5、10、15、20和 25 DPA)
纤维的总 RNA, 反转录成 cDNA, 稀释 8 倍取 2 μL
用于 qRT-PCR 分析。以基因 Ghhiston3 为内参, 比
较不同组织器官不同发育期相对表达水平。反应在
iCycler iQ5荧光定量 PCR仪(Bio-Rad, USA)上进行,
采用 SYBR Premix Ex Taq II 试剂盒。反应体系为
20 μL, 包括 SYBR Premix Ex Taq II (2×) 10 μL、
10 μmol L–1 GhMYB0-q上下游引物各 0.4 μL、模板
cDNA 2 μL, 加 ddH2O至 20 μL。PCR程序为 95℃
预变性 10 min; 95℃变性 15 s, 58℃退火 30 s, 72℃延
伸 20 s, 40个循环; 最后 72℃延伸 5 min。设 3个技
术重复。荧光定量引物见表 1。

表 1 GhMYB0 基因克隆与表达所用引物
Table 1 Sequences of primers for GhMYB0 isolation and expression
名称
Name
上游引物
Forward primer (5′→3′)
下游引物
Reverse primer (5′→3′)
GhMYB0 ACAGAGAGAGAGAGAGAGAC TCGTCGTCGTCATATCAG
In-GhMYB0 GGACTCTAGAGGATCCACAGAGAGAGAGAGAGAGAC GACCACCCGGGGATCCTCGTCGTCGTCATATCAG
Ghhiston3-q GAAGCCTCATCGATACCGTC CTACCACTACCATCATGGC
AtTUB-q AATGAAGCGAGTTGCGGTAG TCCCTTGGCCCAGTTGTTA
GhMYB0-q CTAACCTTTGGGGAGTCATCA TGTCTCTCTCTCTCTCTCTGT

2 结果与分析
2.1 GhMYB0的克隆和氨基酸序列分析
采用电子克隆方法获得含有完整ORF的雷蒙德
氏棉 GrMYB0基因 , 利用特异引物 GhMYB0F 和
GhMYB0R (表1)在陆地棉徐州142 cDNA 中扩增,
产物 ORF 长度为843 bp, 编码280个氨基酸(图1)将
该基因命名为 GhMYB0。通过氨基酸序列分析发现,
与雷蒙德氏棉 D5基因组调取的 GrMYB0相比, 保守
结构域之外, 在陆地棉中克隆的 GhMYB0多9个氨基
第 9期 王诺菡等: 棉花 GhMYB0基因的克隆、表达分析及功能鉴定 1543


酸, 并存在7个氨基酸的差异(图2-A)。保守结构域分
析发现, GhMYB0基因编码的蛋白具有典型的 MYB
转录因子 R2和 R3结构域(图2-B)。系统进化树分析
发 现 , GhMYB0 与 棉 花 GhMYB4 以 及 大 豆
GmMYB185归为一个小的类群(图3-A)。基因结构分
析结果显示, GhMYB0编码区内仅含有一个内含子,
长度为86 bp (图3-B)。
利用 ProtParam分析显示, GhMYB0的理论分子量为
32.269 kD, 理论等电点为 9.22, 平均亲水系数
(grand average of hydropathicity, GRAVY)为–0.974。
通过蛋白质亚细胞定位 PSORT 工具预测, GhMYB0
蛋白被定位于细胞核 , 用 Targ e tP、Sing l eP、
PredictNLS 等进行定位信号分析 , 综合结果表明
GhMYB0 蛋白是核蛋白, 不具有信号肽或者定位信

图 1 棉花 GhMYB0 全长核苷酸序列及推测编码的氨基酸序列
Fig. 1 Full-length nucleotide sequence and putative amino acid sequence of GhMYB0
方框代表起始密码子; *代表终止密码子。Rectangular frame: initiation codon; * termination codon.

图 2 GhMYB0 氨基酸序列与雷蒙德氏棉及其他物种的氨基酸序列多重比对结果
Fig. 2 Alignment of the GhMYB0 with Gossypium raimondii and other species by ClustalX2 program
A: 灰色区域表示陆地棉 GhMYB0与雷蒙德氏棉 GrMYB0氨基酸序列的差异; B: 下画线部分 表示 GhMYB0的 R2和 R3保守结构域。
A: gray parts indicate the different domains from Gossypium raimondii; B: underlined letters indicate R2 and R3 conserved domain of MYB
transcription factor.
1544 作 物 学 报 第 40卷



图 3 GhMYB0 系统进化树和基因组内含子位置
Fig. 3 Phytogenic tree of GhMYB0 and intron site of GhMYB0
图中“●”代表本研究中的 GhMYB0。“●” stands for GhMYB0.

号。PROSITE分析结果显示 GhMYB0含有 MYB型
的螺旋 -转角 -螺旋 DNA 结合域 (Myb-type HTH
DNA-binding domain profile)。
2.2 GhMYB0蛋白的亚细胞定位
对 GhMYB0 基因亚细胞定位融合载体用基因
枪轰击法转入洋葱表皮细胞, 用 pBI121 表达载体
作为对照。经过培养后, 在激光共聚焦显微镜下观
察, 显示对照 GFP 蛋白可以在细胞膜和细胞核内
见到比较均一的明亮的绿色荧光(图 4-A, B, C), 而
pBI121-GhMYB0融合蛋白则位于细胞核中(图 4-D,
E, F), 更进一步说明 GhMYB0 蛋白是核定位的转
录因子。
2.3 GhMYB0的组织表达分析
qRT-PCR 分析表明, GhMYB0在整个发育过程中
表达趋势基本一致, 并且表达量在不同时期均以徐
州142野生型(WT)明显高于其突变体(fl)。GhMYB0在
徐州142开花当天(0 DPA)开始高调表达, 开花后20
DPA 达到最大, 初步推测该基因可能在棉花纤维的
起始和伸长阶段皆发挥一定的作用(图5-A), 该基因
在花中表达最高, 在胚珠中其次(图5-B)。
2.4 GhMYB0转化拟南芥及阳性植株的筛选
利用抗性筛选和 PCR 筛选, 共筛选出10个抗性
转基因拟南芥株系, PCR 结果显示10个转基因株系
全部扩增出了与目的基因片段大小(843 bp)一致的
特异性条带, 阴性对照(野生型拟南芥叶片)中没有
扩增出此特异条带(图6); 分别提取 T3代野生型背景
下2个转基因拟南芥株系(L2和 L5)以及 gl-1突变体
背景下3个转基因株系(Lb、Lc 和 Le)的总 RNA, 反
转录后进行 qRT-PCR 分析 , 选拟南芥内参基因
A t T U B 2作为平行反应 , 引物 G h M Y B 0 - q F、
GhMYB0-qR和 AtTUB-qF、AtTUB-qR见表1。结果
显示 GhMYB0在野生型拟南芥和 gl-1突变体中几

图 4 GhMYB0 蛋白亚细胞定位
Fig. 4 Subcellular localization of GhMYB0 protein
GFP: 以暗场(A)、明场(B)和暗场、明场叠加(C)观察 pBI121-GFP
载体在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。GhMYB0:GFP: 以暗场(D)、
明场(E)和暗场、明场叠加(F)观察 pBI121-GhMYB0:GFP融合表
达载体在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。
GFP: images of green fluorescence GFP of pBI121 vector in onion
epidermal cells under dark-field (A), bright-field (B) and over-
lapped field (C). GhMYB0:GFP: images of green fluorescence GFP
of pBI121-GhMYB0:GFP vector in onion epidermal cells under
dark-field (D), bright-field (E), and overlapped field (F).
第 9期 王诺菡等: 棉花 GhMYB0基因的克隆、表达分析及功能鉴定 1545



图 5 GhMYB0 表达的 qRT-PCR 分析
Fig. 5 qRT-PCR analysis of GhMYB0 expression
DPA: 开花后天数; WT: 野生型徐州 142; fl: 徐州 142无绒无絮突变体。–3、–1、0、1、3、5分别代表–3、–1、0、1、3、5 DPA的胚
珠和纤维组织; 10、15、20、25分别代表 10、15、20、25 DPA纤维组织。
DPA: days post anthesis; WT: wild type of Xuzhou 142; fl: the mutant of Xuzhou 142. –3, –1, 0, 1, 3, 5 indicate ovule and fibers at –3, –1, 0,
1, 3, 5 DPA respectively. 10, 15, 20, 25 indicate fibers at 10, 15, 20, 25 DPA respectively.

图 6 转基因拟南芥阳性株 PCR 检测
Fig. 6 PCR identification of transgenic Arabidopsis lines
1: marker III; 2: 阴性对照; 22: 阳性对照; 3~21: 转基因株系。
1: marker III; 2: negative control; 22: positive control; 3–21: transgenic lines.

乎不表达, 而在转基因株系中均有表达(图 7)。综上
说明, GhMYB0在这些转基因株系中正常表达, 并没
有发生基因沉默。
2.5 GhMYB0的功能验证
为分析 GhMYB0转录因子基因的功能 , 构建
了35S::GhMYB0的拟南芥超表达载体 , 并获得10
个超表达后代纯系。与野生型相比 , GhMYB0超表
达拟南芥植株的表皮毛减少 (图8)。利用 SteREO
Discovery.V8体视显微镜分别观察2个转基因株系
(L2和 L5)第3片真叶表皮毛 , 每个株系3个重复 ,
统计分析表明 , 超表达株系 L2和 L5皮毛密度分别
为1.77个 mm–2和3.26个 mm–2, 分别比野生型低
51.24%和10.19% (图9), 说明超表达株系中表皮毛
密度降低。另外 GhMYB0能够恢复拟南芥表皮毛缺
失突变体 g l - 1的表型 (图 8 )。可以看出过表达
GhMYB0对拟南芥表皮毛的生成有抑制作用, 与前

图 7 转 GhMYB0 基因拟南芥阳性株 qRT-PCR 检测
Fig. 7 qRT-PCR detection of GhMYB0 transgenic Arabidopsis
WT: 野生型拟南芥; gl-1: 拟南芥表皮毛缺失突变体; L2和 L5: 2个 T3代转野生型拟南芥株系;
Lb、Lc、Le: 3个 T3代转突变体拟南芥株系。
WT: Columbia; gl-1: the mutant of Arabidopsis; L2 and L5: two T3 transgenic Arabidopsis lines;
Lb, Lc, Le: three transgenic T3 Arabidopsis mutant lines.
1546 作 物 学 报 第 40卷



图 8 GhMYB0 转基因株系和野生型叶片表皮毛观察
Fig. 8 Trichome of 35S::GhMYB0 transgenic lines and WT
WT: 野生型拟南芥; gl-1: 拟南芥表皮毛缺失突变体。
WT: Columbia; gl-1: the mutant of Arabidopsis.


图 9 GhMYB0 转基因株系和野生型叶片表皮毛密度统计
Fig. 9 Trichome density of 35S::GhMYB0 transgenic lines and
WT
WT: 野生型拟南芥; gl-1: 拟南芥表皮毛缺失突变体; L2 和 L5:
转野生型拟南芥株系; a和 A 分别表示 0.05和 0.01水平上差异
显著。
WT: Columbia; gl-1: the mutant of Arabidopsis; L2 and L5: the
lines of transgenic Arabidopsis bacgruond wild type; “a” and “A”
indicate singnificant difference at 0.05 and 0.01 levels, respectively.

人对GL1和GaMYB23 (GL1同源基因)的研究结果相
符。继续对 T3代 35S::GhMYB0 转基因拟南芥观察,
发现有一株系与野生型相比出现严重矮化的现象 ,
雄蕊明显短于野生型, 不能形成正常的果夹, 萼片
上表皮毛数量与野生型相比明显增多(图 10)。
3 讨论
MYB 转录因子是研究较为广泛的植物转录因
子。在许多植物中克隆了 MYB基因, 并对其功能进
行了深入研究。近年来, 研究证明植物中 MYB转录
因子参与控制植物腺毛细胞的模式和形态建成。棉
花纤维与拟南芥表皮毛两者都是单细胞, 均起源于
表皮, 两者很可能有类似的发育机制[17-21]。Hülskamp
等[22]在研究拟南芥叶表皮毛和根毛的基础上, 提出
一个关于表皮毛模式形成的激活侧抑制模型(A-LI),
即GL1编码的 R2R3-MYB转录因子和 bHLH类转录
因子相互作用, 结合到下游基因启动子上, 激活下
游基因在叶表皮细胞中表达, 来控制叶表皮细胞的
特化[23-27], 负调控因子则通过与 R2R3-MYB转录因
子的竞争作用抑制表皮毛的生成[28-29], Wang等[30]在

图 10 GhMYB0 转基因株系和野生型形态观察
Fig. 10 Morphologic observation of 35S::GhMYB0 transgenic
line and WT
WT: 野生型拟南芥。WT: Columbia.

亚洲棉中发现了类似的控制棉花纤维起始的激活侧
抑制模型。因此在棉花中利用同源克隆得到与拟南
芥表皮毛起始相关 R2R3-MYB 转录因子基因, 验证
其功能是研究棉纤维发育的一个有效途径[31-33]。
本研究中, 雷蒙德氏棉 D5基因组作为四倍体陆
地棉 D 基因组的供体组, 氨基酸序列分析发现, 与
GrMYB0相比, GhMYB0多了 9个氨基酸, 并存在 7
个氨基酸的差异, 表明在棉花数百万年的进化史中,
一些功能基因发生了突变 [34]; 另外, 雷蒙德氏棉胚
珠表皮细胞不会特化成纤维原始细胞, 所以没有纤
维形成, 同时由于纤维原始细胞的分化是由多基因
形成的复杂基因网络来指引[35], 所以 GrMYB0 是否
在这一复杂过程中发挥调控作用有待进一步研究。
其 所 编 码 蛋 白 与 棉 花 GhMYB4 以 及 大 豆
GmMYB185同源性最高, Loguercio等[8]系统进化分
析也发现 GhMYB4与 GL1在同一进化支内。在本研
第 9期 王诺菡等: 棉花 GhMYB0基因的克隆、表达分析及功能鉴定 1547


究中, GhMYB0 基因的拟南芥超表达株系叶片表皮
毛密度减小, 与拟南芥中同源基因 Gl1 以及亚洲棉
中的 R2R3-MYB转录因子 GaMYB23的研究结果相
符[30], 说明该基因过表达对拟南芥表皮毛的生成有
抑制作用; 在 gl-1 突变体中过表达该基因能够恢复
突变性状, 表明 GhMYB0能够发挥 GL1在拟南芥中
同样的调控作用。综上所述, 在促使表皮毛细胞特
化机制中, GhMYB0发挥着一种精细的调控作用, 其
表达量对于表皮毛细胞特化数量存在一定阈值, 野
生型中过表达会抑制表皮毛的形成, 而在突变体内
刚好可以互补 GL1的作用。另外野生型中过表达株
系植株矮化 , 花器官畸形 , 育性降低 , 推测目的基
因的插入位点处于赤霉素受体 AtGID1 上, 导致该
株系与赤霉素受体 AtGID1 的突变体表型相似 [23],
使其育性下降, 该研究结果为筛选拟南芥不育突变
体提供了种质资源。同时 GhMYB0在徐州 142开花
当天(0DPA)开始高调表达, 开花后 20 天(DPA)达到
最大, 表明该基因对棉花纤维的起始和伸长都有一
定作用, 为研究 R2R3-MYB 转录因子在棉纤维起始
和伸长过程中的调控作用提供了证据, 目前正在通
过转基因棉花进一步证实该结论.
4 结论
从陆地棉徐州142中克隆了一个编码核定位
R2R3-MYB转录因子的 GhMYB0。该基因包含2个外
显子和1个内含子, ORF全长843 bp, 编码280个氨基
酸。GhMYB0在徐州142开花当天(0 DPA)开始高调表
达, 开花后20 DPA达到最大; 超表达野生型拟南芥
叶片表皮毛受到抑制, 突变体中过表达则可恢复其
表型。
References
[1] Ramsey J C, Berlin J D. Ultrastructure of early stage of cotton
fiber differentiation. Bot Gazette, 1976, 137: 11–19
[2] Rinehart J A, Petersen M W, John M E. Tissue-specific and de-
velopmental regulation of cotton gene FbL2A (demonstration of
promoter activity in transgenic plants). Plant Physiol, 1996, 112:
1331–1334
[3] Stewart J M. Fiber initiation on the cotton ovule (Gossypium hir-
sutum). Am J Bot, 1975, 62: 723–730
[4] Paz A J, Ghosal D, Wienand U, Peterson P A, Saedler H. The
regulatory C1 locus of Zea mays encodes a protein with homo-
logy to myb on-cogene products and with structural similarities to
transcriptional activators. EMBO J, 1987, 6: 3553–3558
[5] Ogata K, Morikawa S, Nakamura H, Hojo H, Yoshimura S,
Zhang R, Aimolo S, Ametani Y, Hirata Z, Sarai A, Ishii S, Ni-
shimura Y. Comparison of the free and DNA complex forms of
the DNA-binding domain of c-MYB. Nat Struct Biol, 1995, 2:
309–320
[6] Dubos C, Stracke R, Grotewold E, Weisshaar B, Martin C, Le-
piniec L. MYB transcription factors in Arabidopsis. Trends Plant
Sci, 2010, 15: 573–581
[7] 刘翔, 左开井, 张飞, 许洁婷, 黎颖, 赵凌侠, 唐克轩. MYB类
转录因子在植物腺毛发育中的作用研究进展. 上海交通大学
学报(农业科学版), 2010, 28: 188–194
Liu X, Zuo K J, Zhang F, Xu J T, Li Y, Zhao L X, Tang K X. Pro-
gress on the roles of MYB transcription factors on plant trichome
development. J Shanghai Jiaotong Univ (Agric Sci), 2010, 28:
188–194 (in Chinese with English abstract)
[8] Ishida T, Kurata T, Okada K, Wada T. A genetic regulatory net-
work in the development of trichomes and root hairs. Annu Rev
Plant Biol, 2008, 59: 365–386
[9] Koshion-Kimura Y, Wada T, Tachibana T, Tsugeki R, Lshiguro S,
Okada K. Regulation of CAPRICE transcription by MYB pro-
teins for root epidermis differentiation in Arabidopsis. Plant Cell
Physiol, 2005, 46: 817–826
[10] Larkin J C, Oppenheimer D G, Lloyd A M, Paparozzi E T, Marks
M. Roles of the GLABROUS1 and TRANSPARENT TESTA
GLABRA genes in Arabidopsis trichome development. Plant Cell,
1994, 6: 1065–1076
[11] Lee M M, Schiefelbein J. WEREWOLF, a MYB-related protein
in Arabidopsis, is a position-dependent regulator of epidermal
cell patterning. Cell, 1999, 99: 473–483
[12] Lee M M, Schiefelbein J. Developmentally distinct MYB genes
encode functionally equivalent proteins in Arabidopsis. Develop-
ment, 2001, 128: 1539–1546
[13] Oppenheimer D G, Herman P L, Sivakumaran S, Esch J, Marks
M. A myb gene required for leaf trichome differentiation in
Arabidopsis is expressed in stipules. Cell, 1991, 67:483–493
[14] Loguercio L L, Zhang J Q, Wilkins T A. Differential regulation of
six novel MYB-domain genes defines two distinct expression
patterns in allotetraploid (Gossypium hirsutum L.). Mol Gen
Genet, 1999, 261:660–670
[15] Guan X, Lee J J, Pang M, Shi X, Stelly D M, Chen Z J. Activa-
tion of Arabidopsis seed hair development by cotton fiber-related
genes. PLoS One, 2011, DOI: 10.1371/journal.pone.0021301
[16] Wu Y, Machado A C, White R G, Llewellyn D J, Dennis E S. Ex-
pression profiling identifies genes expressed early during lint fi-
bre initiation in cotton. Plant Cell Physiol, 2006, 47: 107–127
[17] Lee J J, Hassan O S, Gao W, Wei N E, Kohel R J, Chen X Y,
Payton P, Sze S H, Stelly D M, Chen Z J. Developmental and
gene expression analyses of a cotton naked seed mutant. Planta,
2006, 223: 418–432
[18] Machado A, Wu Y, Yang Y, Llewellyn D J, Dennis E S. The MYB
transcription factor GhMYB25 regulates early fibre and trichome
development. Plant J, 2009, 59: 52–62
[19] Suo J, Liang X, Pu L, Zhang Y, Xue Y. Identification of
GhMYB109 encoding a R2R3 MYB transcription factor that ex-
pressed specifically in fiber initials and elongating fibers of cotton
(Gossypium hirsutum L.). Biochim Biophys Acta, 2003, 1630: 25–34
[20] 宋国立, 崔荣霞, 王坤波, 郭立平, 黎绍惠, 王春英, 张香娣.
改良 CTAB 法快速提取棉花 DNA. 棉花学报 , 1998, 10:
273–275
1548 作 物 学 报 第 40卷


Song G L, Cui R Y, Wang K B, Guo L P, Li S H, Wang C Y,
Zhang X D. A rapid improved CTAB method for extraction of
cotton genomic DNA. Acta Gossypii Sin, 1998, 10: 273–275 (in
Chinese with English abstract)
[21] Steven J C, Andrew F B. Floral dip: a simplified method for
Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.
Plant J, 1998, 16: 735–743
[22] Hülskamp M. Plant trichomes: a model for cell differentiation.
Nat Rev Mol Cell Biol, 2004, 5: 471–480
[23] Li M Z, Elledge S J. Harnessing homologous recombination in
vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nat Methods, 2007,
4: 251–256
[24] Mayer F X, Schoof H, Haecker A, Lenhard M, Jürgens G, Laux T.
Role of WUSCHEL in regulating stem cell fate in the Arabidop-
sis shoot meristem. Cell, 1998, 95: 805–815
[25] Ogata K, Morikawa S, Nakamura H, Sekikawa A, Inoue T, Kanai
H, Sarai A, Ishii S, Nishimura Y. Solution structure of a specific
DNA complex of the Myb DNA-binding domain with coopera-
tive recognition helices. Cell, 1994, 79: 639–648
[26] Payne C, Zhang F, Lloyd A. GL3 encodes a bHLH protein that
regulates trichome development in Arabidopsis through interac-
tion with GL1 and TTG1. Genetics, 2000, 156: 1349–1362
[27] Percival A E. The national collection of Gossypium germplasm.
Southern Cooperative Series Bull, 1987, 12: 321–362
[28] Kirik V, Simon M, Huelskamp M, Schiefelbein J. The enhancer
of TRY and CPC1 gene acts redundantly with TRIPTYCHON and
CAPRICE in trichome and root hair cell patterning in Arabidopsis.
Dev Biol, 2004, 268: 506–513
[29] Schellmann S, Schnittger A, Kirik V, Wada T, Okada K, Beer-
mann A, Thumfahrt J, Jürgens G, Hülskamp M. TRIPTYCHON
and CAPRICE mediate lateral inhibition during trichome and root
hair patterning in Arabidopsis. EMBO J, 2002, 21: 5036–5046
[30] Wang G, Zhao G H, Jia Y H, Du X M. Identification and charac-
terization of cotton genes involved in fuzz-fiber development. J
Integr Plant Biol, 2013, 55: 619–630
[31] Turley R B, Kloth R H. Identification of a third fuzzless seed lo-
cus in upland cotton (Gossypium hirsutum L.). J Hered, 2002, 93:
359–364
[32] Zhao M, Morohashi K, Hatlestad G, Grotewold E, Lloyd A. The
TTG1-bHLH-MYB complex controls trichome cell fate and pat-
terning through direct targeting of regulatory loci. Development,
2008, 135: 1991–1999
[33] Griffiths J, Murase K, Rieu I, Zentella R, Zhang Z L, Powers S J,
Thomas S G. Genetic characterization and functional analysis of
the GID1 gibberellin receptors in Arabidopsis. Plant Cell, 2006,
18: 3399–3414
[34] Wang K B, Wang Z W, Li F G, Ye W W, Wang J Y, Song G L, Yue
Z, Cong L, Shang H H, Zhu S L, Zou C S, Yuan Y L, Lu C R,
Wei H L, Gou C Y, Zheng Z Q, Yin Y, Zhang X Y, Liu K, Wang B,
Song C, Shi N, Kohel R J, Percy R G, Yu J Z, Zhu Y X, Wang J,
Yu S X. The draft genome of a diploid cotton Gossypium rai-
mondii. Nat Genet, 2012, 44: 1098–1103
[35] Samuel Y S, Cheung F, Lee J J, Ha M, Wei N E, Sze S H,
Stelly D M, Thaxton P, Triplett B, Town C D, Jeffrey Chen Z.
Accumulation of genome-specific transcripts, transcription
factors and phytohormonal regulators during early stages of
fiber cell development in allotetraploid cotton. Plant J, 2006,
47: 761–775




信息索引
1571 欢迎订阅 2015 年《作物学报》
1578 欢迎订阅 2015年《植物遗传资源学报》
1584 欢迎订阅 2015年《农业生物技术学报》
1611 欢迎订阅 2015年《特产研究》
1628 欢迎订阅 2015年《作物杂志》
1649 欢迎订阅 2015年《中国农业科技导报》
1666 欢迎订阅 2015年《大豆科学》
1676 欢迎订阅 2015年《河南农业科学》
1685 欢迎订阅 2015年《中国农业生态学报》