全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(7): 1179−1186 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08005-002)和国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-18)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 郝俊杰, E-mail: haojjds@163.com; 王庆东, E-mail: qdwang@zzu.edu.cn
** 同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2012-11-29; Accepted(接受日期): 2013-03-11; Published online(网络出版日期): 2013-04-23.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130423.1336.013.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01179
用相互嫁接和定量 PCR分析棉花对棉花黄萎病的抗性
郝俊杰 1,*,** 胡雨薇 1,** 郭晓琴 2 赵付安 3 贾新合 4 郭利娟 1
张志新 1 王庆东 5,*
1 河南省农业科学院植物保护研究所 / 农业部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室 / 河南省农作物病虫害防治重点实验室 ,
河南郑州 450002; 2中州大学化工食品学院, 河南郑州 450044; 3河南省农业科学院经济作物研究所, 河南郑州 450002; 4郑州市农林科
学研究所, 河南郑州 450000; 5郑州大学生物工程系, 河南郑州 450001
摘 要: 为了研究棉花对棉花黄萎病的抗性机制, 本文选用对棉花黄萎病表现抗病的海岛棉(Gossypium barbadense)
材料海 7124和 Pima 90及感病的陆地棉(G. hirsutum)材料冀棉 11, 通过相互嫁接的方法构建试验系统, 用棉花黄萎菌
对其人工接种, 利用 Real-time quantitative PCR (qPCR)技术分析其在感病和抗病棉花中侵染的差别。相互嫁接试验中
感/抗和抗/感组合的病情指数介于感/感和抗/抗对照之间, 且相互嫁接棉株各个部位的 IC值(侵染系数)也多介于其对
照相应部位之间; 并且病情指数与不同部位 IC值显著相关, 说明棉花黄萎菌可以通过接口在抗、感部位之间扩展。
感/抗嫁接组合试验说明抗病材料的茎基部在抑制病原菌扩展中起重要的作用, 而抗/感类型试验说明抗病材料接口
以上部分也具有抑制病原菌增殖的作用。总之, 抗病海岛棉无论作为砧木还是接穗, 都能有效抑制病原菌的扩展, 说
明抗病海岛棉对棉花黄萎菌具全株抗性, 但茎基部在抑制病原菌扩展中起重要的作用; 同样, 感/抗和抗/感组合试验
也说明感病材料的各个部位均不能抑制病原菌的定殖和扩展。
关键词: 棉花黄萎病; 相互嫁接; 实时定量 PCR
Resistance to Verticillium wilt in Cotton by Reciprocal Grafting and Real-time
Quantitative PCR
HAO Jun-Jie1,*,**, HU Yu-Wei1,**, GUO Xiao-Qin2, ZHAO Fu-An3, JIA Xin-He4, GUO Li-Juan1, ZHANG
Zhi-Xing1, and WANG Qing-Dong5,*
1 Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southern Region of North China, Ministry of Agriculture / Henan Key Laboratory for
Control of Crop Diseases and Insect Pests / Plant Protection Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China; 2 College
of Chemical and Food Engineering, Zhongzhou University, Zhengzhou 450044, China; 3 Industrial Crops Research Institute, Henan Academy of
Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China; 4 Zhengzhou Institute of Agriculture and Forestry Sciences, Zhengzhou 450000, China; 5 Depart-
ment of Biology Engineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, China
Abstract: In an attempt to understand the resistance mechanism of controlling cotton Verticillium wilt by locating responsible for
resistance in the plant, reciprocal grafts were made between resistant (Gossypium barbadense, cv. Hai 7124 and Pima 90) and
susceptible (G. hirsutum cv. Jimian 11) genotypes. The grafting combinations were inoculated with Verticillium dahliae. Quantita-
tive monitoring of colonization of V. dahliae in different parts of the plant was analyzed using Real-time quantitative PCR (qPCR).
When comparing resistant/susceptible or susceptible/resistant grafted combinations with their resistant and susceptible self-graft
checks, respectively, disease index of reciprocal grafts and IC (infection coefficient) values of different parts of the plant were
nearly within a range between their corresponding checks, respectively, indicating the pathogens could be transferred through the
graft union in reciprocal grafts. The disease index was significantly related with average IC values in different parts of plant in
different cotton types. Susceptible/resistant grafted combinations showed basal stem of resistant genotypes had an important role
to inhibit translocation of pathogens, and the resistant/susceptible grafted combinations also showed upper stem above graft union
with the resistant ability to V. dahliae in resistant genotypes, which indicated that the resistant genotype G. barbadense has the
1180 作 物 学 报 第 39卷

whole-plant of resistance to V. dahliae. In addition, it seems that all parts of the plant in susceptible genotypes (G. hirsutum) were
susceptible to V. dahliae.
Keywords: Cotton Verticillium wilt; Reciprocal grafting; Real-time quantitative PCR
棉花黄萎病(Verticillium wilt)是严重影响棉花
产量和品质的土传维管束病害。其致病菌大丽轮枝
菌(Verticillium dahliae)在土壤中能够长期存活、且传
播途径广泛、不同菌株致病力也可能存在差异, 这
些给防治上造成了诸多困难。受根系分泌物的诱导
或合适的环境影响, 土壤中的大丽轮枝菌微菌核萌
发产生芽管或菌丝, 通过植株根的表皮或伤口侵入,
穿过根的内皮层, 进入木质部中定殖和扩展, 并随
着维管束系统向上运输, 扩散到棉株的茎、枝、叶
等地上部分, 引起叶片边缘或主脉间退绿变黄, 阻
碍棉花生长发育, 导致植株产生黄萎病症状[1-2]。
棉花抗黄萎病的机制主要是抗侵染或抗扩展 ,
这种能力来自棉花的物理阻碍或化学抑制, 或二者
共同的作用 [3], 那么这种抗性又来自棉株的哪个或
哪些组织？是棉花的根、茎基部、整个茎, 还是整
株？我们前期的试验将感棉花黄萎病品种冀棉 11做
接穗 , 分别嫁接在抗棉花黄萎病的海岛棉品系海
7124和 Pima 90上, 将嫁接棉花种植在连作棉田, 嫁
接组合冀棉 11/海 7124表现高抗, 而冀棉 11/Pima 90
表现耐病 [4], 说明大丽轮枝菌可自海岛棉的根部侵
染, 通过接口继续向上定殖和扩展。为进一步分析
这种差别, 我们利用相互嫁接的方法将抗病和感病
棉花组合在一起, 构建一个试验系统。通常嫁接技
术主要用来提高植物的抗病性、产量及克服连作障
碍等, 但近几年, 嫁接作为一种有效的试验方法 [5],
利用相互嫁接将 2 个相反或相对立的植物材料, 比
如抗病和感病、转基因和非转基因组合在一起, 来
研究激素、蛋白、病毒、病原菌、微量元素、RNA
等在植物维管束系统中的转运、调控等。前人通过
嫁接发现 mRNA和 microRNA能在韧皮部中长距离
运输, 从而改变植物的形态[6-8]; 对于植物的系统获
得抗性, Park等[9]利用不同遗传背景的材料, 通过相
互嫁接证明水杨酸甲酯是一个关键的移动信号。有
许多科学家也利用嫁接来研究植物的抗病机制、侵
染过程等, 比如 Bachman 和 Nickell [10]利用嫁接系
统证明了大豆对茎褐病(Phialophora gregata)的抗性
是其根部在起作用; Mueller等[11]利用嫁接发现对茄
病镰刀菌(Fusarium solani f. sp. glycines)具有部分抗
性的大豆品种并不表现根系抗性。
本研究构建抗/感、感/抗、抗/抗和感/感 4 种类
型的嫁接组合(接穗 /砧木)。用棉花黄萎菌接种和
qPCR 技术分析病原菌在感病和抗病棉花株各部位
定殖和扩展的差别, 从而明确棉花对棉花黄萎病的
抗性主要由棉株的哪个或哪些部位起作用, 进一步
明确棉花抗黄萎病的机制。
1 材料与方法
1.1 试验材料
选用 3 个对棉花黄萎病表现不同抗性类型的棉
花材料, 其中感病棉花为陆地棉材料冀棉 11 (S), 抗
病棉花为海岛棉材料海 7124 (R1)和 Pima 90 (R2)。采
用本实验室分离的强致病力棉花黄萎菌 VD26 为供
试菌株。
1.2 嫁接苗的培育
感病和抗病材料的棉花种子经消毒处理后(75%
的酒精中浸种 1~3 min, 随后用无菌水洗涤棉种 2~3
次, 再以 0.5%的HgCl2溶液浸泡棉种 4~6 min后, 用
无菌水洗涤 5~7 次), 分别播于装有已灭菌基质的无
底纸钵中(蛭石和沙 6∶4 混合作为基质)。待砧木株
和接穗株长出 1~2 片真叶时, 采用劈接法完成 4 个
嫁接组合(接穗/砧木), 即抗/感(R1/S和 R2/S)、感/抗
(S/R1和 S/R2)、抗/抗(R1/R1和R2/R2)和感/感(S/S), 具
体嫁接方法和培育条件参考郝俊杰等 [4], 以上操作
均在无菌条件下完成。此外, 也播种自根苗 S、R1
和 R2作为对照。
1.3 接种方法
嫁接 1 周接口愈合后, 去除嫁接夹即可接种。
在温室内采用伤根法, 用 VD26 菌株对嫁接棉株和
自生苗接种, 接种菌株孢子悬浮液的浓度为每毫升
1×107个孢子, 每个无底纸钵接种 15 mL, 以接种无
菌水的棉苗为对照处理, 4次重复。温室的温度设置
为 25℃/20℃(白天/黑夜), 光照为白天 14 h。
1.4 调查和取样
在接种后每 7 d按 0~4级分级标准[12], 每次选择
20 株, 调查嫁接和非嫁接棉花黄萎病的发病情况。
每次随机选取各处理样本植株 5 株, 去除根部(由于
接种方法的原因, 无法区别根部黄萎菌是附着在根
表面的还是定殖在根内部的), 将各样本分为茎基
部、茎下部(靠近自根苗子叶或嫁接苗接口下部茎
段)、茎上部(靠近自根苗子叶或嫁接苗接口上部茎
第 7期 郝俊杰等: 用相互嫁接和定量 PCR分析棉花对棉花黄萎病的抗性 1181


段)、叶片 4部分, 分别混合各部分样品, 称取 0.5 g,
立即放入液氮速冻, 置–80℃冰箱保存。
1.4 植物样品和真菌 DNA的提取及 qPCR分析
按照诺维森(北京)DNA 提取试剂盒(KP310)的
步骤, 分别提取棉花样品和棉花黄萎菌的 DNA。在
提取棉花样品DNA的过程中, 添加液氮研磨时加入
少量石英沙粉末, 使研磨更充分, 以便同时获得定
殖在棉花样品中的棉花黄萎菌 DNA。棉花黄萎菌菌
株 VD26在 PDA (马铃薯葡萄糖琼脂)培养基上生长
7 d后, 刮取菌丝来提取其 DNA。用 qPCR检测棉花
样本内棉花黄萎菌的量。
选用大丽轮枝菌特异性引物 ITS1-F (5′-AAAGT
TTTAATGGTTCGCTAAGA-3′)和 ITS1-R (5′-CTTG
GTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)扩增棉花黄萎菌 ITS
基因 ; 用引物 Act-F (5′-ATCCTCCGTCTTGACC
TTG-3′)和 Act-R (5′-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3′)
扩增棉花的内参 actin基因。qPCR的试剂为 TaKaRa
公司的 SYBR Green Real-time PCR Master Mix, 模板
终浓度为 10 ng μL–1, 反应体系为 20 μL, 反应程序为
三步法, 在延伸阶段收集荧光信号, 具体反应条件为
95℃ 2 min; 95℃ 15 s, 55℃ 15 s, 68℃ 20 s, 40个循环;
然后从 95℃开始下降到 55℃进行熔解曲线分析。每个
样本 3 次重复, 阳性对照为提取的棉花黄萎菌菌株
DNA, 阴性对照为无菌水, 得到各样本的 Ct值。
1.5 统计分析
参考Atallah等[13-14]的方法, 按照 IC=Ct寄主/Ct病原菌
计算侵染系数(infection coefficient, IC), 估算棉花黄
萎菌在不同部位中的定殖量 , 比值越高表示含菌
量越大, 侵染程度越严重。由 SAS 9.1 (SAS Institute,
Cary, NC)软件中的 GLM 程序进行方差分析, 并用
Duncan’s 新复极差法进行多重比较, 分析棉花黄萎
菌在各嫁接部位内分布的差异。
2 结果与分析
2.1 不同类型棉花对棉花黄萎菌的抗性
按照 0~4 级分级标准, 调查接种后不同时间段
各类型棉花黄萎病的发生情况(表 1)表明, 在接种后
7 d, 即使感病材料也没有发病症状。在接种后 14~35
d, 所有样本的病情指数均呈上升趋势, 感病对照冀
棉 11 自根苗(S)和自身嫁接苗(S/S)显著高于其他样
本。在 28 d, 虽然自根苗 S 的病指已经超过 50, 但
自身嫁接苗 S/S 的病指为 38.35, 二者差异显著; 在
接种后 35 d, 尽管 S和 S/S差异显著, 但 S/S的病指
已接近 50, 说明接种后 35 d各材料的病害发生程度
已能反映其对棉花黄萎病菌的抗性。
接种后 35 d, 自根苗 R1和 R2对棉花黄萎病均表
现抗病, 但二者的自身嫁接 R1/R1和 R2/R2的病指均
升高, 表现为耐病。对于嫁接苗感/抗类型来说, S/R1
表现耐病, 而 S/R2表现感病, 与感/感和抗/抗组合类
型均差异显著, 表明尽管R1和R2作为砧木均对棉花
黄萎菌有抑制作用, 但棉花黄萎菌仍能通过接口向
上扩展和定殖, 其上的感病接穗仍有发病症状。对
于抗/感类型来说, R1/S表现耐病, R2/S表现感病, 二
者的病指均小于感/感类型、大于抗/抗类型, 说明抗
病材料接口以上组织对棉花黄萎菌也有抑制作用 ,
但 R2的抑制能力小于 R1。

表1 不同棉花类型对棉花黄萎菌抗性反应
Table 1 Disease index and disease reaction of different types of cotton at days after inoculation with V. dahliae
病情指数 Disease index 棉花类型
Cotton type 14 d 21 d 28 d 35 d
抗性反应
Disease reaction
S 25.42 a 37.06 a 58.23 a 63.45 a 感 Susceptibility
R1 4.59 e 9.92 h 13.28 h 16.35 h 抗 Resistance
R2 5.26 de 10.95 gh 13.28 h 17.19 h 抗 Resistance
S/S 19.13 b 28.50 b 38.35 b 45.28 b 感 Susceptibility
R1/R1 5.20 de 11.75 fg 14.95 gh 23.11 g 耐 Tolerance
R2/R2 5.75 d 12.39 f 15.88 g 23.99 g 耐 Tolerance
S/R1 7.36 c 15.29 e 28.20 e 34.25 e 耐 Tolerance
S/R2 8.44 c 16.31 e 30.82 d 37.07 d 感 Susceptibility
R1/S 7.35 c 19.40 d 22.97 f 30.82 f 耐 Tolerance
R2/S 7.83 c 23.40 c 32.82 c 38.87 c 感 Susceptibility
同一列中平均数后不同字母表示在0.05的水平上差异显著。S: 冀棉11; R1: 海 7124; R2: Pima 90。嫁接棉花: 接穗/砧木。
Means in a column followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level. S: Jimian 11; R1: Hai 7124; R2: Pima 90.
Grafting cotton: scion/rootstock.
1182 作 物 学 报 第 39卷

通过抗病材料和感病材料的相互嫁接和自身嫁
接建立的试验系统, 可以发现棉花黄萎菌可以通过
接口在抗-感之间扩展 , 对于抗病材料海岛棉来说 ,
茎基部和接口上部茎均对棉花黄萎菌有抑制作用 ,
但茎基部以下的抑制作用大于其上部, 其中 R1的抑
菌能力强于 R2。
2.2 棉株内棉花黄萎菌的定量检测
2.2.1 对照棉株内棉花黄萎菌的检测 不同时期
各样本棉花 IC值的方差分析结果表明棉花类型间、
不同取样时期间、棉株不同部位间以及各变异间的
互作效应均达极显著水平(表 2), 说明可进一步对相
关变异间的差异进行多重比较。

表 2 接种后不同时期各样本棉花 IC值的方差分析
Table 2 Analysis of variance for IC values of different plant
parts at days after inoculation in different cotton types
变异来源 Source of variation df MS F
棉花类型 Cotton type 9 0.313 2231.62**
时期 Time 4 0.385 2744.6**
部位 Part 3 0.194 1379.56**
棉花类型×时期
Cotton type × time
36 0.024 173.20**
棉花类型×部位
Cotton type × part
27 0.019 137.34**
时期×部位
Time × part
12 0.006 41.58**
棉花类型×时期×部位
Cotton type × time × part
108 0.004 28.78**
**表示0.01显著水平。
**Significant at the P = 0.01 probability level.

对于感病材料冀棉 11的自根苗(S), 在接种后 7
d, 棉株 4 个部位由下到上病原菌量逐渐减少, 茎基
部病原菌定殖量较多(表 3); 在 14 d以后各时间段由
茎基部向上 IC 值逐渐增大, 在茎上部达最大, 然后
减小, 其余 3部分在同一时间段的 IC值均与茎上部
差异显著; 同一部位 IC值在 7~28 d基本呈递增趋势,
28 d达到高峰, 35 d减小。抗病材料的自根苗海 7124
(R1)和 Pima 90 (R2), 在同一检测时段, 由下到上 4
部分的 IC值基本呈减小趋势, 除了 35 d的 R1以外,
其余任何时期的茎下部、茎上部和叶片的 IC值均显
著低于茎基部, 在抗性稳定的 35 d, 除了 R1的茎基
部与茎下部差别不显著外, R1和 R2的其他部位间均
差异显著。以上结果表明感病材料的各部位不能限
制病原菌的增殖和扩展, 进一步说明抗病材料的茎
基部在抑制病原菌扩展中起重要的作用。
对于嫁接材料来说 , 感病材料的自身嫁接苗
S/S在接种后 7 d, 茎基部的 IC值最大, 在 14 d以后
的每个检测时段, IC值的变化与 S的基本一致, 即由
下到上 IC值逐渐增大, 在茎上部达到高峰后变小。
抗病材料的自身嫁接 R1/R1和 R2/R2的 IC 值变化趋
势与自根苗 R1和 R2略有不同: 在接种后 7、14 和
35 d, R1/R1和 R2/R2由下到上 4部位的 IC值均表现
高-低-高-低的趋势; 在 21 d和 28 d, R1/R1的变化趋
势为由下到上逐渐减弱, 而 R2/R2 仍为高-低-高-低
趋势, 但在大多数情况下和其自根苗一样, 茎基部
的 IC值较大。抗病材料的自身嫁接苗和自根苗相比,
在接种后 28 d和 35 d, R1/R1和 R2/R2接口上面的茎
上部和叶片 IC值均大于其自根苗对应部位的 IC值,
同样在 28 d和 35 d, R1/R1和 R2/R2的病情指数大于
自根苗病指(表 1), 初步说明病原菌的量和发病的严
重程度有一定的关系。
2.2.2 相互嫁接棉株内棉花黄萎菌的检测 S/R1
和 S/R2嫁接接口以下的茎基部和茎下部为抗病部位,
接口以上的茎上部和叶片为感病部位, 接种后 7 d
的每次定量检测中, S/R1和 S/R2嫁接组合抗病砧木
表现为茎基部高于茎下部, 茎上部的 IC值虽然较茎
下部有所增加, 但远低于茎基部, 表明抗病砧木对
其上部的感病接穗抗性有一定的影响。R1/S 和 R2/S
接口以下的茎基部和茎下部为感病部位, 接口以上
的茎上部和叶片为抗病部位, 在发病初期(7~14 d),
病原菌主要集中在茎基部, 从 21 d 开始, 黄萎菌逐
渐在茎下部和茎上部积累, 接穗茎部较砧木茎部维
持在同一水平或略有降低。说明抗病接穗对病原菌
的繁殖有明显抑制作用; 感病和抗病部位相互嫁接
中, 抗病部位能够增强感病部位的抗性。此外, S/R1
和 S/R2比 S/S接口以上相应的茎上部和叶片的 IC值
均偏小, 表明作为抗病部位的砧木对病原菌具有抑
制作用, 但不能完全抑制, 仍能通过接口在接口以
上的感病部位中扩展和定殖。
2.2.3 不同类型棉花中相同部位间的比较 不同
时间段抗病自根苗 R1和 R2上同一部位的 IC值一般
小于感病自根苗 S, 且差异显著; 自根苗 R1同一部
位的 IC值大多小于 R2上相应部位的 IC值, 但大多
差异不显著, 比如在接种后 35 d 时, 只有茎上部和
叶片间差异显著(表 3)。对于自根苗 S和嫁接苗 S/S,
在接种后 14 d以后的不同时期, S/S上相应部位的 IC
值一般小于 S 上的, 这与相应时期其病情指数的发
病特征一致(表 1)。R1 和 R2 分别与其自身嫁接苗
R1/R1和 R2/R2相比, 在 21 d 以前, 可能由于嫁接苗



表3 接种后不同时期各样本棉花内黄萎菌的分布
Table 3 Distribution of V. dahliae of different plant parts at days after inoculation (DAI) in different cotton types
侵染系数 Infection coefficient (IC) 接种后天数
DAI
部位
Portion S R1 R2 S/S R1/R1 R2/R2 S/R1 S/R2 R1/S R2/S
I 0.74 j, b 0.66 c, e 0.65 d, e 0.78 hi, a 0.67 fg, de 0.60 h, f 0.73 c, cd 0.68 de, b 0.69 fg, cd 0.70 f, c
II 0.63 k, ab 0.61 de, c 0.61 ef, c 0.56 m, d 0.58 l, d 0.57 i, d 0.58 i, d 0.62 fg, bc 0.64 i, a 0.60 i, c
III 0.60 l, d 0.62 de, bc 0.61 ef, bcd 0.72 k, a 0.60 jk, cd 0.62 g, bc 0.63 gh, b 0.63 f, b 0.60 j, cd 0.62 h, bc
7 d
IV 0.58 l, ab 0.58 fg, ab 0.57 hi, bc 0.59 l, a 0.56 m, c 0.58 i, ab 0.56 i, c 0.56 h, c 0.56 l, c 0.57 j, b
I 0.86 gh, a 0.71 ab, cd 0.70 b, cd 0.76 ij, b 0.69 e, d 0.71 c, c 0.77 b, b 0.69 de, cd 0.70 f, cd 0.70 fg, cd
II 0.88 gh, a 0.66 c, d 0.61 f, fg 0.76 ij, b 0.59 kl, gh 0.63 g, ef 0.64 fgh, de 0.73 c, c 0.61 j, fg 0.58 ij, h
III 0.94 def, a 0.60 ef, fg 0.58 gh, g 0.91 b, b 0.65 fgh, e 0.65 f, e 0.73 c, c 0.68 de, d 0.62 j, f 0.60 i, fg
14 d
IV 0.83 i, a 0.56 g, d 0.56 i, d 0.83 e, a 0.61 ijk, bc 0.57 i, d 0.63 gh, b 0.61 g, c 0.62 j, bc 0.60 ij, c
I 0.86 gh, a 0.72 a, d 0.70 b, d 0.75 j, c 0.71 e, d 0.71 c, d 0.78 ab, b 0.77 b, b 0.77 c, b 0.68 g, e
II 0.88 g, a 0.69 b, e 0.66 cd, f 0.75 j, b 0.67 f, f 0.63 g, g 0.74 cb, c 0.70 d, d 0.66 hi, f 0.73 de, cd
III 0.99 b, a 0.65 c, g 0.67 c, f 0.87 cd, b 0.64 gh, g 0.66 ef, fg 0.78 ab, c 0.76 b, d 0.67 gh, f 0.73 d, e
21 d
IV 0.95 cde, a 0.63 d, de 0.59 g, f 0.86 d, b 0.65 gh, d 0.65 f, d 0.64 fg, de 0.67 e, c 0.58 k, f 0.57 j, f
I 0.91 f, a 0.73 a, f 0.76 a, de 0.78 hi, c 0.73 d, f 0.72 c, f 0.81 a, b 0.77 b, cd 0.72 e, f 0.74 de, f
II 0.94 def, a 0.65 c, f 0.65 d, f 0.81 fg, b 0.63 ij, g 0.68 d, e 0.65 fg, f 0.70 d, d 0.78 bc, c 0.82 b, b
III 1.12 a, a 0.58 fg, h 0.62 efg, h 0.95 a, b 0.63 hi, g 0.72 bc, ef 0.69 d, f 0.76 b, cd 0.74 d, de 0.78 c, c
28 d
IV 0.96 cd, a 0.56 g, g 0.58 ghi, g 0.92 b, b 0.61 ijk, f 0.66 ef, e 0.62 h, f 0.69 d, ed 0.69 f, cd 0.71 ef, c
I 0.85 hi, a 0.73 a, c 0.75 a, c 0.80 gh, b 0.84 a, a 0.73 b, c 0.81 a, b 0.80 a, b 0.81 a, b 0.80 b, b
II 0.94 def, a 0.73 a, e 0.71 b, e 0.82 ef, c 0.78 b, d 0.72 bc, e 0.66 ef, f 0.77 b, d 0.81 a, c 0.85 a, b
III 0.97 bc, a 0.61 de, f 0.65 d, e 0.96 a, a 0.83 a, b 0.77 a, cd 0.75 c, d 0.76 b, d 0.79 b, c 0.85 a, b
35 d
IV 0.92 ef, a 0.56 g, f 0.63 e, e 0.88 c, b 0.75 c, c 0.67 de, d 0.68 de, d 0.63 f, e 0.68 fg, d 0.77 c, c
I: 茎基部; II: 茎下部; III: 茎上部; IV: 叶片。逗号前的不同小写字母表示各列数值在0.05水平上差异显著, 逗号后不同小写字母表示各行数值在0.05水平上差异显著。S: 冀
棉11; R1: 海 7124; R2: Pima 90。嫁接棉花: 接穗/砧木。
DPI: days post inoculation. I: basal stem; II: lower stem; III: upper stem; IV: leaf. Values followed by different letters before comma are significantly different among a column at P = 0.05,
and those followed by different letters after comma are significantly different among a row at P = 0.05. S: Jimian 11; R1: Hai 7124; R2: Pima 90. Grafting cotton: scion/rootstock.
1184 作 物 学 报 第 39卷

正在调整恢复其生长发育, IC 的变化没有一定的规
律性, 在接种后 28 d和 35 d, 嫁接苗上相应部位的
IC值多数大于其自根苗, 特别是在病情稳定的 35 d,
其茎上部和叶片的 IC值差异显著, 这与 35 d R1/R1
和 R2/R2 的病情指数分别大于其自根苗病指一致。
R1/R1和 R2/R2两个抗病材料在 28 d以前同一部位的
IC值变化没有规律性, 在接种后 35 d, R1/R1 4个部
位的 IC 值分别高于 R2/R2的相应部位, 而 R1/R1和
R2/R2在不同阶段的病情指数差别一直不显著。
感/抗组合 S/R1和 S/R2与感病对照 S/S 相比(表
3), 具有共同的感病接穗 S, 但感/抗组合接穗部分
即茎上部和叶片部位的 IC值均小于 S/S的相应部位,
其病情指数也明显低于 S/S, 表明选用抗病材料作
为砧木, 对病原菌向上扩展定殖具有一定的抑制作
用。感/抗组合 S/R1和 S/R2分别与其抗病对照 R1/R1
和 R2/R2 相比, 具有共同的砧木, 但感/抗组合接穗
部分的 IC值多数大于 R1/R1和 R2/R2相应部位, 说明
抗病砧木不能完全抑制病原菌向上扩展, 病原菌仍
能通过接口在感病接穗中定殖, 感病材料作为接穗
其抑制病原菌繁殖能力明显弱于抗病材料。S/R1 和
S/R2 相比具有不同的砧木, 共同的接穗, 二者相应
的茎上部和叶片部位的 IC值相比没有规律性。
抗/感组合 R1/S和 R2/S与感病对照 S/S相比, 具
有共同的砧木 S, 不同的接穗, 其接穗的 IC 值均小
于 S/S相应部位的 IC值(表 3), 说明抗病材料接口以
上的部位也具有抑制病原菌增殖的作用。R1/S 和
R2/S 分别与 R1/R1和 R2/R2相比, 具有不同的砧木,
共同的接穗, R1/S 和 R1/R1中相同接穗上的 IC 值相
比没有规律性, 而 R2/S和 R2/R2相比, 在 28 d和 35 d,
前者接穗部分 IC 值分别大于后者的相应部位; R1/S
和 R2/S 相比具有共同的砧木, 不同的接穗, 二者接
穗的 IC值在 21 d前没有规律性, 同样在 28 d和 35 d,
前者小于后者, 表明R1和R2的接口以上部分对病原
菌的抑制能力不同, 相比而言 R1强于 R2。
2.3 病情指数与 IC值的关系
根据棉苗的形态结构特征, 除分别比较 4 个部
位的 IC 值与病情指数的关系以外, 也比较了接口
下、接口上、茎部等部位平均 IC值与病情指数的相
关性(表 4), 结果表明在接种后 14 d以后的不同时期,
4 个部位的平均 IC 值与病情指数均极显著相关; 茎
基部 IC值在接种后 21 d和 35 d与病情指数显著相
关(P<0.05), 在接种后 14 d和 35 d时分别呈极显著
相关(P<0.01)。其余的茎下部、茎上部、叶片以及接
口上部、接口下部或茎部的平均 IC值, 在 14 d以后
的不同检测时期与病情指数均极显著正相关
(P<0.01), 说明寄主体内的病原菌侵染量与发病严
重度有密切的关系。

表4 接种后不同时期不同棉株部位的平均IC值与病情指数的
相关系数
Table 4 Correlation coefficients between disease index and
average IC of different plant parts in different types of cotton
inoculated with V. dahliae at days after inoculation
接种后天数 Days after inoculation 部位
Part 14 d 21 d 28 d 35 d
I+II+III+IV 0.97** 0.87** 0.96** 0.88**
I 0.87** 0.65* 0.86** 0.70*
II 0.91** 0.85** 0.89** 0.78**
III 0.95** 0.90** 0.95** 0.86**
IV 0.96** 0.79** 0.90** 0.83**
III+IV 0.96** 0.87** 0.93** 0.85**
I+II+III 0.96** 0.87** 0.97** 0.88**
I+II 0.93** 0.81** 0.96** 0.83**
II+III 0.96** 0.89** 0.94** 0.87**
I: 茎基部; II: 茎下部; III: 茎上部; IV: 叶片。*表示 0.05
显著水平; **表示 0.01 显著水平。
I: basal stem; II: lower stem; III: upper stem; IV: leaf.
*Significant at the P = 0.05 probability level; **Significant at the P
= 0.01 probability level.

3 讨论
前人对油菜的研究表明黄萎菌(V. dahliae)通过
植株根的表皮或伤口侵入, 穿过根的内皮层, 进入
木质部中定殖, 借助菌丝扩展或是孢子随蒸腾作用
在维管束系统内运输, 产生系统侵染, 导致黄萎病
症状产生, 在其整个侵染过程中, 病原菌绝大部分
生命周期都处在寄主植物的维管系统中[15]。本文借
助相互嫁接的方法, 将感病和抗病材料组合在一起;
该方法已应用在棉花的早衰机制[16]、microRNA 和
RNA的长距离运输[6-8]、植物抗病性[9]等多项研究中,
其最大的优点是人为地将极端或相反类型的材料组
合在一起[5], 从而得到一些新的结果。
本文通过比较病情指数, 发现棉花黄萎菌可以
通过接口在抗病和感病部位之间扩展, 抗病材料海
岛棉的茎基部和接口上部均对棉花黄萎菌有抑制作
用, 体现全株抗性, 但茎基部以下的抑制作用大于
其上部, 但海 7124和 Pima 90之间有差别。郝俊杰
等[4]在连作多年且发病较重的棉田研究感/抗嫁接类
型对棉花黄萎病的影响, 发现嫁接棉花黄萎病明显
第 7期 郝俊杰等: 用相互嫁接和定量 PCR分析棉花对棉花黄萎病的抗性 1185


减轻, 说明海岛棉茎基部以下对病原菌具有抑制作
用。而本文通过抗-感材料间的相互嫁接, 进一步发
现海岛棉接口以上部位对病原菌同样具有抑制作
用。文婷等[17]也利用嫁接研究了棉花对棉花黄萎病
的抗性, 认为海岛棉抗病品种的关键抗病部位为茎
部, 而陆地棉抗病品种为根部; 结合我们的研究方
法和结果, 认为该结论值得商榷, 因为文婷等没有
对根部进行组织学或分子检测分析, 并且中植棉 2
号是一个按照抗棉花黄萎病指标审定的棉花品种 ,
没有达到高抗或免疫的级别, TM-1/中植棉 2号嫁接
组合的病情指数为 18.5, 同样说明病原菌仍能通过
接口, 而不是抑制在根部。Vallad和 Subbarao [18]用
转绿色荧光蛋白(GFP)的黄萎菌侵染抗病和感病植
物莴苣, 借助激光共聚焦显微镜下观察, 发现黄萎
菌对感、抗病莴苣侧根的侵染没有差别, 但是抗病
莴苣能够将黄萎病菌限制在侧根内, 从而阻止其向
主根扩展, 这是莴苣的抗黄萎病机制; Bachman 和
Nickell [10]利用嫁接系统证明了大豆对 Phialophora
gregata 的抗性体现在根部; Mueller 等[11]利用嫁接发
现对镰刀菌(Fusarium solani f. sp. glycines)具有部分
抗性的大豆品种并不表现根系抗性。而棉花则不同,
本文感 /抗嫁接组合说明抗病材料的茎基部在抑制
病原菌扩展中起重要的作用, 而抗/感类型说明抗病
材料接口以上的部位也具有抑制病原菌增殖的作
用。总的说来, 抗病海岛棉无论作为砧木还是接穗,
都能够有效抑制病菌的繁殖, 说明抗病海岛棉全株
体现抗性, 但茎基部在抑制病原菌扩展中起重要的
作用; 同样, 以感/抗和抗/感组合类型也说明感病材
料的各个部位均不能抑制病原菌的增殖和扩展, 病
情指数与不同部位 IC 值显著相关进一步说明上述
结论。
本文相互嫁接的结果还表明砧木和接穗间能够
相互影响, 感/抗和抗/感组合类型分别与其感/感和
抗/抗对照相比, 其病情指数介于两对照之间; 另外,
相互嫁接组合各个部位的 IC 值也多介于两对照相
应之间, 主要表现为抗病部位能够增强感病部位的
抗性。这可能与大分子信号物质通过维管束在抗、
感材料间的穿梭有关。比如 Kim 等[6]发现番茄嫁接
体中Me砧木特异表达的 PFP-LeT6 mRNA转移到了
Xa 接穗中; Park 等[9]利用嫁接系统发现水杨酸甲酯
在接穗和砧木中的移动, 认为水杨酸甲酯是植物获
得性抗性重要的分子信号。嫁接棉花间是否存在一
些抗病因子, 如抗病基因、蛋白、相关激素等通过
接口转移, 或是通过诱导抗性从而增强感病材料对
病原菌的抵御能力需要进一步研究。
目前应用于棉花黄萎病检测的方法中, 传统的
半选择性培养基菌落计数法能方便直观地对感染植
物组织内黄萎菌定量[1-3], 但较为粗略且耗时耗力。
血清学技术可以快速、灵敏地检测棉花各部位是否
携带黄萎菌[4], 但在定量上仍然缺乏可信度。近几年
来, 基于 qPCR 技术对马铃薯[19]、苜蓿[20]、橄榄[21]
等植物以及土壤样品 [22]中的黄萎菌等相关研究。
Larsen 等[20]利用 qPCR 对苜蓿中的病原菌进行定量
分析, 发现许多外部没有发病症状的苜蓿中也存在
病原菌 , 这与本文中关于海岛棉的检测结果相似 ,
说明通过调查病情指数或检验维管束是否变褐与植
物是否受到侵染存在差别。Dan 等[19]对马铃薯表现
有类似黄萎病发病症状的病株, 进行 qPCR检测, 除
了极个别污染外, 大多数病株内并没有发现存在黄
萎病菌, 这很可能是植株衰老或缺水造成的。但目
前还没有利用 qPCR 技术分析棉花黄萎菌在棉花不
同抗性部位中定殖的相关报道。本文利用相互嫁接
和 qPCR 技术对棉花黄萎病菌定量分析, 并通过计
算侵染系数衡量棉花黄萎菌在不同抗性部位的定殖,
分析棉花的抗病机制。这种方法在检测病原菌含量
以及病原菌分布状况方面, 都具有优越性。并可为
抗病棉花品种的筛选、棉花黄萎病的早期诊断等研
究提供检测方法。
4 结论
棉花黄萎菌可以通过相互嫁接棉花接口在抗、
感部位之间扩展, 抗病海岛棉无论作为砧木还是接
穗, 都能有效抑制病菌的繁殖, 说明抗病海岛棉对
棉花黄萎菌体现全株抗性, 但茎基部在抑制病原菌
扩展中起重要的作用; 同样, 感/抗和抗/感组合类型
也说明感病材料的各个部位均不能抑制病原菌的定
殖和扩展。
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