全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(6): 1132−1139 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2013AA102604), 国家自然科学基金项目(31171504, 31101122), 广西八桂学者、特
聘专家专项经费 , 广西自然科学基金创新团队项目(2011GXNSFF018002), 广西科学研究与技术开发计划项目(桂科产1123008-1, 桂
科攻 1222009), 广西 农 科 院 博士 后 研究 专项 (86420), 广西 农 科院 团队 项 目 (桂 农科 2011YT01)和 广 西自 然 科学 基 金
(2013GXNSFAA019082)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 邢永秀, E-mail: document126@126.com; 李杨瑞, E-mail: liyr@gxaas.net
第一作者联系方式: E-mail: weichunyan025@126.com
Received(收稿日期): 2013-10-13; Accepted(接受日期): 2014-03-04; Published online(网络出版日期): 2014-03-24.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1333.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.01132
绿色荧光蛋白基因标记的固氮菌 DX120E在甘蔗植株内的定殖
魏春燕 1 邢永秀 1,2,* 莫 遥 1 林 丽 2 杨丽涛 1,2,3 胡春锦 3 李杨瑞 1,2,3,*
1 广西大学农学院 / 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室, 广西南宁 530004; 2广西农业科学院 / 中国农业科学院甘蔗
研究中心 / 农业部广西甘蔗生物技术与遗传改良重点实验室 / 广西甘蔗遗传改良生物技术重点开放实验室, 广西南宁 530007; 3 广
西农业科学院微生物研究所, 广西南宁 530007
摘 要: 为了探索甘蔗固氮菌 DX120E 菌株侵入根的方式以及菌株在甘蔗植株内的定殖规律, 确定人工接种固氮菌适
宜的侵染浓度和定殖特点, 采用绿色荧光蛋白(GFP)标记的固氮菌 DX120E 接种甘蔗组培苗, 以荧光显微镜观察其侵染
和定殖情况, 以抗生素抗性标记法和平板分离计数法测定 DX120E菌株的种群动态。结果表明, 菌株 DX120E在 2个甘
蔗品种的根、叶鞘和叶内均能定殖, 定殖菌量依次均为根>叶鞘>叶; 不同接种浓度下, 最大定殖数量无显著差异, 1×102
CFU mL–1的接种量足够侵入甘蔗并积累定殖。DX120E从甘蔗根表面的裂隙、主根和侧根发生处及根的断裂处均可侵
入, 主要在根表面细胞间隙和细胞内大量定殖, 同时也可迁移到叶片的叶肉细胞和维管束细胞中定殖。
关键词: 固氮菌(Klebsiella sp.); 甘蔗; 接种浓度; 细菌数量; 定殖
Colonization of Nitrogen Fixing Bacterial Strain Klebsiella sp. DX120E Labeled
with Green Fluorescent Protein (GFP) Gene within Sugarcane Plants
WEI Chun-Yan1, XING Yong-Xiu1,2,*, MO Yao1, LIN Li2, YANG Li-Tao1,2,3, HU Chun-Jin3, and LI
Yang-Rui1,2,3,*
1 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources / College of Agriculture, Guangxi University, Nanning
530004, China; 2 Guangxi Academy of Agricultural Sciences / Sugarcane Research Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Labora-
tory of Sugarcane Biotechnology and Genetic Improvement (Guangxi), Ministry of Agriculture / Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Im-
provement, Nanning 530007, China; 3 Microbiology Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning 530007, China
Abstract: To explore the invasion patterns of N2-fixing bacteria strain Klebsiella sp. DX120E and its colonization in sugarcane,
and to determine the optimum concentrations of inoculum, we inoculated tissue culture seedlings of two sugarcane varieties
(GT21 and B8) with different concentrations of Klebsiella sp. bacteria strain DX120E labeled by green fluorescent protein (GFP)
gene, and with ddH2O as control. The results showed that the strain DX120E propagated in root, leaf sheath and leaf of sugarcane
seedlings, and bacteria quantities in different parts were root > leaf sheath > leaf. There were no differences in the maximum
propagation quantity under various inoculating concentrations, with the optimum concentration of 1×102 CFU mL–1. Fluores-
cence microscope observation indicated that the bacteria could invade root through the surface cracks, generating sites of main
root and lateral root, and root fracture, and intensively propagate in intercellular spaces and cells of the root, also transfer to
mesophyll cells and vascular bundle sheath cells in leaf.
Keywords: Nitrogen fixing bacteria (Klebsiella sp.); Sugarcane; Inoculation levels; Bacteria quantites; Colonization
氮素是甘蔗最需要的营养元素 , 它的有效利用对甘
蔗高产量的获得具有重要意义。国内外的研究发现, 甘蔗
内生固氮菌的开发利用能够为甘蔗生产减少氮肥投入做
出贡献。研究不同固氮菌接种浓度在不同甘蔗品种体内的
第 6期 魏春燕等: 绿色荧光蛋白基因标记的固氮菌 DX120E在甘蔗植株内的定殖 1133


定殖规律 , 可以揭示固氮菌在甘蔗体内的固氮和促生潜
能, 为在甘蔗生产上应用固氮菌提供理论依据。早在20世
纪60年代 , Döbereiner[1]首次从甘蔗根部发现固氮菌后 ,
固氮菌的分离以及甘蔗生物固氮的研究便日新月异。研究
人员已经从甘蔗中分离到许多不同属的固氮菌 , 例如葡
糖醋酸杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、成团泛菌
(Pantoea spp.)、草螺菌(Herbaspirillum spp.)、克雷伯氏菌
(Klebsiella spp.)、巴西固氮螺菌(Azospirllum brasilense)、
假单胞菌(Pseudomonas spp.)等[2-6]。目前研究较多的是葡
糖醋酸杆菌、草螺菌和巴西固氮螺菌。葡糖醋酸杆菌最初
是从甘蔗[7]中分离到的, 后来发现除了能在甘蔗植株内定
殖外, 也能在水稻[8]、高粱和小麦[9]、玉米[10]中定殖。草
螺菌能在多种作物植株内定殖, 包括甘蔗、玉米、高粱以
及其他禾本科植物[11-12]。固氮菌能否侵入植物并在植株内
生存和定殖是植物与固氮菌互作并发挥固氮作用的先决
条件。研究表明, 固氮菌主要通过甘蔗的根尖、次生根发生
处的裂隙和根表皮的伤口以及受伤的气孔侵入甘蔗[12-14],
并能够在甘蔗根内的细胞间隙和木质部以及叶片的叶肉
细胞间隙中定殖[13-18]。
绿色荧光蛋白(GFP)是从水母(Aquoria victoria)中克隆
到的一种具有性能稳定、检测方便、灵敏度高的生物标记,
能够应用于观察细菌侵入植物的过程以及细菌在植物组织
中的具体定殖部位[19]。GFP标记与其他生物标记(如GUS等)
的区别在于GFP标记能在未经过任何导致组织死亡的化学
染色的活细胞中直接观察到[20]。克雷伯氏菌DX120E是从
广西本地主栽甘蔗品种新台糖22 (ROC22)的根内分离到的
一株具有高固氮酶活性的固氮菌, 它还具有分泌生长素和
铁载体以及溶解无机磷的特性 [21], 在甘蔗生物固氮方面
具有较好的应用潜力。本试验以DX120E不同的菌液浓度接
种2个固氮能力不同的甘蔗品种(B8和GT21)的组培苗, 研
究该菌的定殖能力以及同一接种浓度在不同时间和不同组
培苗部位的菌群动态变化, 同时比较不同菌液浓度在两种
甘蔗品种组培苗中的定殖数量, 以期为进一步研究该固氮
菌株与甘蔗的互作提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
菌株克雷伯氏菌DX120E (Klebsiella sp.), 携有绿色
荧光蛋白基因和四环素抗性基因标记 , 由本实验室分离
并保存。四环素使用浓度为15 μg mL–1。
1.2 甘蔗幼苗培养
选用广西主栽甘蔗品种之一的桂糖21 (GT21)和巴西
引进甘蔗品种B8 (由广西大学农学院甘蔗实验基地提供)
组培苗。在无菌操作的条件下切取2个甘蔗品种茎尖以上
约2~4 cm处的顶端分生组织接到含3.0 mg L–1 2,4-D的固
体MS培养基上诱导愈伤组织, 在完全黑暗的条件下培养
40 d后再把愈伤组织接到添加2.0 mg L–1 6-BA和0.2 mg L–1
NAA的固体MS培养基上进行苗分化培养。在添加 3.0
mg L–1 NAA和2.0 mg L–1 IBA的固体MS培养基上诱导分
化苗生根, 生根后转入添加有1.0 mg L–1NAA和1.0 mg L–1
IBA的液体MS培养基中进行壮苗培养, 从苗分化阶段开
始, 以上各阶段的传代培养周期均为30 d。培养条件为白天
28℃ 16 h, 夜间25℃ 8 h, 光照强度为36 μmol m–2 s–1。对培
养基进行高压灭菌(121℃, 20 min)前将其pH值调到5.8。
1.3 菌悬液的制备及接菌处理
将携带绿色荧光蛋白基因的细菌菌株DX120E从–80℃
超低温冰箱中取出, 用LB液体培养基(10 g L–1蛋白胨、5 g
L–1酵母提取物、5 g L–1 NaCl, 高压灭菌前将pH值调到7.0),
37℃、200转 min–1过夜培养至培养基浑浊, 取10 μL菌悬
液到50 mL加有抗生素的LB液体培养基中, 37℃、200转
min–1过夜培养至在600 nm下的吸光度为1.0左右 , 离心
(4000×g, 10 min, 4℃), 收集菌体, 用无菌的pH值为7.4的
磷酸缓冲液(PBS)悬浮至1×109 CFU mL–1, 再用磷酸缓冲
液稀释到1×108、1×106、1×104和1×102 CFU mL–1等接种
浓度。
选取长势基本一致的已生根的甘蔗组培单苗转到装
有50 mL的1/10 MS液体培养液的500 mL培养瓶中, 培养
基不含维生素也未添加任何激素。每个品种分5组处理(每
个处理10瓶, 每瓶4株苗), 各组的接种剂量均为每瓶1 mL,
分别为A (接种1×108 CFU mL–1菌悬液)、B (接种1×106
CFU mL–1菌悬液)、C (接种104 CFU mL–1菌悬液)、D (接
种1×102 CFU mL–1菌悬液)和CK (接同样剂量的无菌水)。
1.4 标记菌株在甘蔗组培苗内的定殖动态测定
取甘蔗组培苗分为根、叶鞘和叶片等部分, 用无菌滤
纸轻轻吸干水分后分别称取质量。先将各部分浸泡在75%
酒精中1 min, 再用1%的次氯酸钠表面消毒2 min, 无菌水
漂洗4次, 每次1 min。用无菌滤纸吸干水分后, 放到经过
高压灭菌的研钵中研磨成匀浆并加9 mL灭菌的磷酸缓冲
液(pH 7.4)混匀并转移到无菌的试管中, 用无菌水进行10
倍系列稀释(盛有样品的悬液为原液, 其稀释度为0次方),
分离根、叶鞘和叶片内的标记菌株。分离用的培养基为含
15 μg mL–1四环素的固体LB培养基。分别取每种稀释浓度
的悬液100 μL加到有抗生素的LB平板中, 均匀涂布后用
封口膜封好, 放到37℃的培养箱中倒置培养24 h后计数。
每浓度均3个重复, 选取菌落数在30~300个范围内的平板
统计每皿菌落数, 计算平均每克根、叶鞘和叶片(鲜重)内
标记菌株的数量 , 同时把最后一次漂洗的无菌水以及对
照不接菌的根、叶鞘和叶的匀浆涂到同样的抗性平板上检
查是否有菌落出现。
1.5 甘蔗植株内细菌定殖的荧光显微检测
分别在接种后1、2和15 d取甘蔗组培苗的根和叶片(每
1株苗为一个重复, 3次重复), 用无菌水洗去根表面上附
着的标记菌株DX120E的细菌。按照上述方法表面灭菌后,
将叶片的徒手横切片或整体根放在无菌水中 , 小心铺展
1134 作 物 学 报 第 40卷


于载玻片上, 盖上盖玻片, 置荧光显微镜下由低倍到高倍
观察并照相。荧光显微镜是德国生产的莱卡DM4000B, 相
机型号为DFC425C, 观察绿色荧光的滤片是I3 (激发Ex波
段是450~490 nm, 分色镜DM是505 nm, 发射Em波段是
LP 510 nm)。
1.6 数据分析
用Microsoft Excel和SPSS15.0分析数据。
2 结果与分析
2.1 不同接菌水平下液体培养基中标记菌株 DX120E 的
群体密度
从图 1可以看出, 当接种浓度为 1×102 CFU mL–1时, 2
个甘蔗品种培养基中的菌落数都表现为接种后 10 d 比接
种后 5 d 高; 而在高于 1×102 CFU mL–1 的接种浓度时
(1×104、1×106 和 1×108 CFU mL–1), 均表现出接种后
10 d低于接菌 5 d后的细菌量或基本维持不变。对于甘蔗
品种 B8, 接种不同浓度的固氮菌后, 培养基中的菌落数
差异在 2次测定时间内各处理间都达到显著水平, 且接菌
浓度为 1×106 CFU mL–1时培养基中的标记菌量始终显著
高于其他的接菌浓度 , 而 GT21 在各处理接种后 5 d,
1×106和 1×108 CFU mL–1处理间差异不显著, 说明 1×104、
1×106和 1×108 CFU mL–1这 3个接菌浓度与 GT21品种共
培养时, 培养基中的标记菌量水平相当。固氮菌 DX120E
能利用培养基中的少量营养以及组培苗的根系分泌物生
存和繁殖。2 个甘蔗品种在接种浓度为 1×104 CFU mL–1
以上时均表现接种后 10 d的细菌数量低于接种后 5 d, 而
接种浓度为 1×102 CFU mL–1时, 在接种 10 d后培养基中
的细菌量仍表现出增长的趋势。总体上看 , 固氮菌
DX120E在 GT21组培苗培养基中的总活菌量的下降速度
比在 B8的培养基中慢。

图 1 不同接菌水平下液体培养基中的细菌 D×120E数量动态变化
Fig. 1 Population dynamics of strain DX120E bacteria in liquid medium under different inoculation levels
A: 甘蔗品种 B8; B: 甘蔗品种 GT21。图中数据为对数转换数据, 误差线示标准误。同一处理时间内, 标有不同字母的
处理间在 0.05水平差异显著。
A: sugarcane variety B8; B: sugarcane variety GT21. Data present in the figures are the logarithmic transformation. Error bars in
the figures indicate the standard errors. Bars superscriptedby different letters are significantly different among the treatments
at 0.05 probability level at the same day.

2.2 不同接菌水平下甘蔗组培苗不同时间不同部位标记
菌株的数量
由图 2可知, 用不同浓度梯度的菌液(从 1×102到 1×108
CFU mL–1菌悬液)接种 2个品种的甘蔗组培苗, DX120E菌
株均能进入植株根部并在根部生存和定殖, 同时能向植株
地上部分迁移并积累定殖。4 个接菌浓度接种 B8 和 GT21
两品种组培苗均表现出根内的细菌定殖量要比地上部分
(叶鞘和叶)内部定殖的菌群数高出 1~2 个数量级, 表明在
本试验的条件下标记菌株 DX120E 细菌更适合在甘蔗植
株的根内生存和定殖。对于品种 B8, 4个菌液浓度(1×102、
1×104、1×106和 1×108 CFU mL–1)接种组培苗后, 根和地
上部分均在接种后 7 d或 15 d达到最高定殖水平, 其中在
根中能达到 1×106 CFU g–1 FW, 地上部分能达到 1×105
CFU g–1 FW, 而品种 GT21的根和地上部分的标记菌株最
高定殖量部分接种浓度需要在接种后 30 d 才能达到, 说
明固氮能力较强的甘蔗品种 B8对标记菌株做出响应的时
间比品种 GT21快些。总体上, 从标记菌株在植株体内的
定殖量来看, 不同接菌浓度的差异并不明显, 低浓度和高
浓度接种 2个甘蔗品种组培苗后, 根和地上部分最终能达
到的最高定殖量均为同一数量级, 只是表现在不同的接种
后天数。
2.3 标记菌株 DX120E在甘蔗品种 B8和GT21组培苗体
内各组织的群体动态
在限菌(接菌浓度为 1×108 CFU mL–1)条件下, 在接菌
后不同时间(0~35 d)通过平板计数分离法检测组培苗不同
部位培养标记菌株的群体密度。图3表明, 固氮菌DX120E
在 2个甘蔗品种中的群体动态图呈相似的的趋势, 即植株
的根、叶鞘和叶内标记菌株 DX120E的群体密度在初始(2
d)时短暂迅速上升后维持不变或缓慢下降 , 叶中固氮菌
数量均在接种后 2 d 达到一个高峰 , 或者在接种后
第 6期 魏春燕等: 绿色荧光蛋白基因标记的固氮菌 DX120E在甘蔗植株内的定殖 1135



图 2 不同接菌水平下甘蔗各组织中的 DX120E细菌数量动态变化
Fig. 2 Population dynamics of strain DX120E bacteria in sugarcane tissues under ifferent inoculation levels
A: 甘蔗品种 B8根; B: 甘蔗品种 B8地上部分; C: 甘蔗品种 GT21根; D: 甘蔗品种 GT21地上部分。图中数据为对数转换数据, 误差
线示标准误。同一处理时间内, 标有不同字母的处理间在 0.05水平差异显著。
A: roots of sugarcane variety B8; B: aerial part of sugarcane variety B8; C: roots of sugarcane variety GT21; D: aerial part of sugarcane
variety GT21. Data present in the figures are the logarithmic transformation. Error bars in the figures indicate the standard errors. Bars
superscripted by different letters are significantly different among the treatments at 0.05 probability level at the same day.

图 3 菌株 DX120E细菌在甘蔗组培苗不同部位的数量动态变化
Fig. 3 Population dynamics of bacteria strain DX120E in difference parts of sugarcane seedlings
A: 甘蔗品种 B8最初接种浓度为 1×108 CFU mL–1; B: 甘蔗品种 GT21最初接种浓度为 1×108 CFU mL–1。图中数据为对数转换数据, 误
差线示标准误。同一处理时间内, 标有不同字母的处理间在 0.05水平差异显著。
A: sugarcane variety B8, the inoculation level is 1×108 CFU mL–1; B: sugarcane variety GT21, the inoculation level is 1×108 CFU mL–1.
Data present in the figures are the logarithmic transformation. Error bars in the figures indicate the standard errors. Bars superscripted by
different letters are significantly different among the treatments at 0.05 probability level at the same day.

10 d达到最低点, 而后又开始逐渐上升直到试验结束。标
记菌株DX120E在 2个甘蔗品种植株体内各部分的菌群密
度均表现为根>叶鞘>叶, 说明内生固氮菌在甘蔗中的定
殖是一个动态分布的过程, 由根部入侵后从植物体内上
升迁移到叶鞘和叶, 并能在各组织中定殖且维持一定的群
体密度。B8根、叶鞘和叶中的固氮菌群体密度与 GT21品
种相似, 说明标记菌株在不同的甘蔗品种中具有相同的内
生和迁移定殖能力, 对不同的甘蔗基因型不具有特异性。
2.4 标记菌株 DX120E在甘蔗组培苗根和叶中的定殖
携带GFP标记的菌株DX120E, 在固体培养基上培养时,
1136 作 物 学 报 第 40卷


以荧光显微镜可直接观察到绿色荧光。荧光显微镜观察表明,
在接种 1×108 CFU mL–1菌液后 1 d, 标记菌株在根毛附近大
量聚集(图 4-B), 接菌后 2 d在主根边缘以及主根与次生根连
接处大量聚集并从细胞裂隙侵入根内(图 4-C, 4-D, 4-F), 同
时也可从侧根断裂处伤口聚集并侵入根内(图 4-E)。接菌
后 15 d, 标记菌株在根表皮细胞的细胞间隙中定殖(图 4-I),
同时也在根边缘细胞和根表皮细胞内定殖并充满整个细胞
(图 4-G, 4-H)。接菌后 15 d, 观察叶片横切面发现标记菌株
能在叶片的维管束鞘细胞以及叶肉细胞内定殖(图 4-K,
4-L)。在对照的根和叶片横切面中, 均未观察到标记菌株

图 4 以荧光显微镜观察克雷伯氏菌 DX120E在甘蔗根和叶中的定殖
Fig. 4 Fluorescent micrographs showing colonization of Klebsiella sp. DX120E in sugarcane roots and leaves
A: 对照未接菌根毛区; B: 标记菌株在根毛附近(箭头)大量聚集(接种后 1 d); C, D: 标记菌株在主根和侧根连接处聚集(箭头)并由边缘
裂隙处(箭头)侵入根内(接种后 2 d); E: 标记菌株在侧根断裂处(箭头)聚集并由伤口进入根内(接种后 2 d); F: 标记菌株在主根的边缘处
(箭头)大量聚集(接种后 2 d); G: 标记菌株在根表面边缘细胞内(箭头)定殖(接种后 15 d); H: 标记菌株从根边缘细胞的裂隙侵入根细胞
内(箭头)并充满整个细胞(接种 15 d后); I: 标记菌株在主根的细胞间隙中(箭头)聚集和定殖(接种后 15 d); J: 对照叶片横切面; K, L: 标
记菌株在叶片中的维管束细胞(箭头)和叶肉细胞中(箭头)的定殖(接菌后 15 d)。叶片横切面图中 bs表示维管束鞘, s表示厚角组织, m
表示叶肉组织。比例尺示 30 μm。接种浓度为 1×108 CFU mL–1。
A: root hair zone without inoculation; B: labeled bacteria DX120E accumulated near to the root hairs (arrows) in root hair zone (one day after
inoculation); C, D: labeled bacteria DX120E accumulated in the conjunction between tap lateral roots (arrows, two days after inoculation); E:
labeled bacteria DX120E accumulated in the wounded spot (arrows) and entered roots (two days after inoculation); F: labeled bacteria
DX120E accumulated next to the edge of main roots (two days after inoculation); G: labeled bacteria DX120E propagated substantially inside
the edge cell of root surface (arrows, 15 days after inoculation); H: labeled bacteria DX120E invaded into cell from the cracks (arrows) and
filled up the cell in root (15 days after inoculation); I: labeled bacteria DX120E accumulated and propagated in cell intervals (arrows, 15 days
after inoculation). J: transverse section of control leaf; K, L: labeled. bacteria DX120E propagated inside the vascular bundle sheath and
mesophyll cells (arrows, 15 days after inoculation). In the transverse section of leaf, bs indicates vascular buddle sheath, m indicates
mesophyll, s indicates schlerenchyma. The scale is 30 μm, and the inoculation concentration was 1×108 CFU mL–1.
第 6期 魏春燕等: 绿色荧光蛋白基因标记的固氮菌 DX120E在甘蔗植株内的定殖 1137


(图 4-A, 4-J)。本试验条件下, 固氮菌 DX120E在 2个甘蔗品
种组培苗的根和叶内具有相似的定殖模式。
3 讨论
固氮菌作为理想的植物促生菌不仅要求有高的固氮
活性, 而且要求生活能力强, 能在寄主植株根和叶中成功
定殖。本研究表明, 克雷伯氏菌的菌株 DX120E 可进入
2个甘蔗品种 GT21和 B8的根、叶鞘和叶中, 且具有较强
的持久定殖能力。DX120E能够从甘蔗根表面的裂隙、主
根和侧根发生处及根的断裂处伤口进入根内并在根内细
胞间隙和细胞内大量定殖 , 也能够经由植株根系向叶鞘
和叶部迁移 , 在叶鞘中和叶片的叶肉细胞和维管束细胞
中定殖。本研究结果与前人报道的其他固氮菌的定殖模式
相似[22-25]。国内外已有关于固氮菌在植物根和茎的木质部
中定殖的报道 [26-28], 并且被认为这是内生菌从根往地上
部移动的可靠路径。根据 Elbeltagy等[29]研究, 内生菌由根
向茎中迁移可能是由于根表面细胞间隙形成的“侵染线”
一直沿着侧根和不定根延伸造成的。Zakria等[30]认为内生
菌的运动性在细菌入侵植物以及细菌在植物内部的迁移
中起重要作用 , 因此内生菌能通过生长介质直接进入植
物茎基部并随后往植物的其他组织中迁移。关于固氮菌
DX120E 是通过什么方式从根部往其他组织中迁移还有
待进一步探讨。
关于植物内生固氮菌的分离以及定殖动态变化研究,
特别是醋酸杆菌、草螺菌和固氮螺菌在水稻[30]、甘蔗[31]、
高粱[9]、玉米[32]等作物中的研究较多。大多研究所使用的
接菌浓度为 1×102 CFU mL–1与 1×108 CFU mL–1, 并且认
为 1×108 CFU mL–1是比较适合的内生菌侵染浓度。目前
关于系统研究不同浓度固氮菌接种宿主植物的比较研究
少有报道。本实验表明不同的接菌浓度下克雷伯氏菌
DX120E细菌均能从经过表面消毒的根、叶鞘和叶的匀浆
中分离到, 说明DX120E能在甘蔗组培苗的各个组织器官
中定殖 , 但根与地上部存在一定的菌群数量差异。Luna
等[9]报道用醋酸杆菌接种小麦和高粱的种子后能在其根、
茎和叶中重新分离到一定细菌数量 , 并且接菌浓度对定
殖数量没有太大影响 , 即少量的固氮菌便能进入植株体
内并在体内定殖。Reis等[33]认为内生菌接种甘蔗组培苗后
需要短期繁殖后才能在植物体内定殖。Zakria等[30]用 2个
浓度的草螺菌接种水稻苗后也发现在接种后 30 d, 菌株
在根内定殖的细菌量才达到最大值, 茎内则是接菌后 45 d
细菌的定殖量达到最大, 在叶中则一直检测不到菌株, 并
指出高浓度的菌液有利于草螺菌在水稻中定殖。本研究发
现两个甘蔗品种在接菌后 2 d, 其根、叶鞘和叶内定殖的
细菌量均达到高峰, 表明克雷伯氏菌DX120E的细菌能在
短期内迅速进入植株根内并往根以上组织迁移和定殖, 这
可能是不同菌株定殖能力不同或接种技术不同造成的。
Njoloma 等[31]用草螺菌接种 2 个甘蔗品种的组培苗, 发现
相同的接种浓度在不同甘蔗品种的组织中定殖的细菌量
有较大的区别 , 且高的接种浓度比低的接种浓度有更强
的定殖能力。在本实验条件下, 少量细菌接种到在含微量
营养元素的 1/10 MS液体培养基中培养的组培苗后, 细菌
能利用培养基中的少量营养元素及植物根系分泌物繁殖,
且进入到植物组织器官后能利用组织器官中的营养物质
继续积累繁殖, 因此, 在本实验条件下, 较低的接菌浓度
(1×102 CFU mL–1)便可有足够数量的固氮菌进入植物体内
并稳定繁殖。
内生固氮菌接种甘蔗不仅能提高甘蔗的生物固氮能
力, 同时也能通过分泌植物激素、溶解无机磷和提高甘蔗
吸收营养元素的能力来促进甘蔗生长和提高产量[13,34]。本
研究中所用的固氮菌DX120E不仅具有高固氮酶活性, 且
具有分泌生长素和溶解无机磷的特性 , 因此研究接种甘
蔗后其固氮基因在甘蔗体内的表达情况以及接种后甘蔗
的生物固氮能力是开发其应用潜力所必需的。已有研究表
明克雷伯氏菌能提高甘蔗[35]和小麦[36]的固氮能力。在本
研究中, 从甘蔗品种 ROC22 根系分离得到的克雷伯氏菌
DX120E 能在健康的其他甘蔗品种体内定殖并未表现出
任何的病症, 而且本研究的甘蔗品种是制糖用的原料蔗,
制糖过程中的高温将把所有微生物杀灭。不过, 部分克雷
伯氏菌株对动物和人具有致病作用, 因此, 在我们后续的
研究中将进一步鉴定固氮菌 DX120E 对动物和人是否具
有致病作用。本研究的接种方法能在很大程度上降低菌液
的使用量, 且操作方法方便可行, 尤其是将固氮菌引入甘
蔗组培苗 , 提供具有固氮作用的健康种苗方面具有更广
阔的应用前景。关于此接种方法对甘蔗组培苗后期移栽的
生长生理影响仍需要进一步研究。同时本试验是在严格控
制试验条件且无菌的条件下进行的 , 在田间使用固氮菌
接种甘蔗的定殖模式还有待研究。本研究结果可为研究固
氮菌与寄主的互作提供参考依据 , 同时为应用有益固氮
菌作为生物菌肥的研究提供理论依据。
References
[1] Dôbereiner J. Nitrogen-fixing bacteria of the genus Beijerinckia
derxin the rhizosphere of sugar cane. Plant Soil, 1966, 15:
211–216
[2] Asis C A, Kubota M, Ohta H, Arima Y, Chebotar V K, Tsuchiya
K, Alzao S. Isolation and partial characterization of endophytic
diazotrophs associated with Japanese sugarcane cultivar. Soil Sci
Plant Nutr, 2000, 46: 759–765
[3] Govindarajan M, Kwon S W, Weon H Y. Isolation, molecular
characterization and growth-promoting activities of endophytic
sugarcane diazotroph Klebsiella sp. GR9. World J Microbiol Bio-
technol, 2007, 23: 997–1006
[4] 罗霆, 欧阳雪庆, 杨丽涛, 李杨瑞. 一株有固氮能力的甘蔗克
雷伯氏菌的分离鉴定及固氮特性. 热带作物学报, 2010, 31:
972–978
Luo T, Ou-Yang X Q, Yang L T, Li Y R. An endophytic nitro-
gen-fixing bacterium Klebsiella sp. strain L03 from sugarcane:
1138 作 物 学 报 第 40卷


isolation, identification and characterization. Chin J Trop Crops,
2010, 31: 972–978 (in Chinese with English abstract)
[5] Taulé C, Mareque C, Barlocco C, Hackembruch F, Reis V M, Si-
cardi M, Battistoni F. The contribution of nitrogen fixation to
sugarcane (Saccharum officinarum L.), and the identification and
characterization of part of the associated diazotrophic bacterial
community. Plant Soil, 2012, 356: 35–49
[6] 胡春锦, 林丽, 史国英, 汪茜, 王钱崧, 李杨瑞. 广西甘蔗根
际高效联合固氮菌的筛选及鉴定 . 生态学报 , 2012, 32:
4745–4752
Hu C J, Lin L, Shi G Y, Wang Q, Wang Q S, Li Y R. Screening
and identification of associative nitrogen fixation bacteria in
rhizosphere of sugarcane in Guangxi. Acta Ecol Sin, 2012, 32:
4745–4752 (in Chinese with English abstract)
[7] Cavalcante VA, Döbereiner J. A new acid-tolerant nitrogen-fixing
bacterium associated with sugarcane. Plant Soil, 1988, 108:
23–31
[8] Cocking E C, Stone P J. Davey M R. Intracellular colonization of
roots of Arabidopsis and crop plants by Gluconacetobacter
diazotrophicus. In Vitro Cell Dev Plant, 2006, 42: 74–82
[9] Luna M F, Galar M L, Aprea J, Molinari M L, Boiardi J L. Coloni-
zation of sorghum and wheat by seed inoculation with Gluconace-
tobacter diazotrophicus. Biotechnol Lett, 2010, 32: 1071–1076
[10] Adriano-Anaya M L, Salvador-Figueroa M, Ocampo J A,
García-Romera I. Hydrolytic enzyme activities in maize (Zea
mays) and sorghum (Sorghum bicolor) roots inoculated with
Gluconacetobacter diazotrophicus and Glomus intraradices. Soil
Biol & Biochem, 2006, 38: 879–886
[11] Baldani J L, Baldani V L D, Seldin L, Döbereiner J. Characteri-
zation of Herbaspirillum seropedicae gen. nov., a root associated
nitrogen-fixing bacterium. Int J Syst Bacteriol, 1986, 36: 86–93
[12] Olivares F L, Baldani V L D, Reis V M, Baldani J I, Döbereiner J.
Occurrence of the endophytic diazotrophs Herbaspirillum spp. in
root, stems, and leaves, predominantly of gramineae. Biol Fertil
Soils, 1996, 21: 197–200
[13] James E K, Olivares F L. Infection and colonization of sugarcane
and other graminaceous plants by endophytic diazotrophs. Crit
Rev Plant Sci, 1998, 17: 77–119
[14] James E K, Reis V M, Olivares F L, Baldani J I, Döbereiner J.
Infection of sugarcane by the nitrogen-fixing bacterium Aceto-
bacter diazotrophicus. J Exp Bot, 1994, 45: 757–766
[15] James E K, Olivares F L, Oliveira A L M, Reis F B, Silva L G.
Reis V M. Further observations on the interaction between sugar
cane and Gluconacetobacter diazotrophicus under laboratory and
greenhouse conditions. J Exp Bot, 2001, 52: 747–76
[16] Dong Z, Canny M J, McCully M E, Roboredo M R, Cabadilla C
F, Ortega E, Rodes R. A nitrogen fixing endophyte of sugarcane
stems: a new role for the apoplast. Plant Physiol, 1994, 105:
1139–1147
[17] Dong A, Heydrich M, Bernard K, McCully M E. Further evi-
dence that N2 fixing endophytic bacterium from the intercellular
spaces of sugarcane stems in Acetobacter diazotrophicus. Appl
Environ Microbiol, 1995, 61: 1843–1846
[18] Dong Z, Mccully M E, Canny M J. Does Acetobacter diazotro-
phicus live and move in the xylem of sugarcane stems? Ana-
tomical and physiological data. Ann Bot, 1997, 80: 147–158
[19] Haseloff J, Siemering K R. The uses of green fluorescent protein
in plants. In: Chalfie M, Kain S, eds. Green Fluorescent Protein:
Properties, Applications and Protocols. Hobokem, New Jersey:
John Wiley&Sons. Inc., 1998. pp 191–220
[20] Singh M K, Kushwaha C, Singh R K. Studies on endophytic
colonization ability of two upland rice endophytes, Rhizobium sp.
and Burkholderia sp., using green fluorescent protein reporter.
Curr Microbiol, 2009, 59: 240–243
[21] Lin L, Li Z G, Hu C J, Zhang X C, Chang S P, Yang L T, Li Y R,
An Q L. Plant growth-promoting nitrogen-fixing enterobacteria
are in association with sugarcane plants growing in Guangxi,
China. Microbes Environ, 2012, 27: 391–398
[22] James E K, Gyaneshwar P, Mathan N, BarraquioW L, Reddy P M,
Iannetta P P M, Olivares F L, Ladha J K. Infection and coloniza-
tion of rice seedlings by the plant growth-promoting bacterium
Herbaspirillum seropedicae Z67. Mol Plant Microbe Interact,
2002, 15: 894–906
[23] Roncata-Maccari L D B, Ramos H J O, Pedrosa F O, Alquini Y,
Chubatsu L S, Yates M G, Rigo L U, Steffens M B R, Souza E M.
Endophytic Herbaspirillum seropesicae expresses nif genes in
gramineous plants. FEMS Microbial Ecol, 2003, 45: 39–47
[24] Chi F, Shen S H, Cheng H P, Jing Y X,Youssef G Y, Frank B D.
Ascending migration of endophytic rhizobia, from roots to leaves,
inside rice plants and assessment of benefits to rice growth
physiology. Appl Environ Microbiol, 2005, 71: 7271–7278
[25] Liu X M, Zhao H X, Chen S F. Colonization of maize and rice
plants by strain Bacillus megaterium C4. Curr Microbiol, 2006,
52: 186–190
[26] Hurek T, Reinhold-Hurek B, Montagu M V, Kellenberger E. Root
colonization and systemic spreading of Azoarcus sp. Stain BH72
in grasses. J Bacteriol, 1994, 176: 1913–1923
[27] 吕泽勋, 李久蒂, 朱至清. 用绿色荧光蛋白基因(gfp)标记产酸
克雷伯氏菌 SG-11 研究其在水稻苗期根部的定殖. 农业生物
技术学报, 2001, 9: 13–18
Lu Z X, Li J D, Zhu Z Q. Klebsiella oxytoca SG-11 labeling by
green fluorescent protein gene (gfp) and its colonization in rice
seedling roots. J Agric Biotechnol, 2001, 9: 13–18 (in Chinese
with English abstract)
[28] 陶艳会, 林会, 赵斌. 内生固氮菌 HAUM10 对水稻的侵染定
殖规律及促生效应. 湖北农业科学, 2012, 51: 1257–1262
Tao Y H, Lin H, Zhao B. Infection and colonization of endo-
phytic diazotroph HAUM10 on rice seedlings and its plant
growth-promoting role. Hubei Agric Sci, 2012, 51: 1257–1262 (in
Chinese with English abstract)
[29] Elbeltagy A, Nishioka K, Sato T, Suzuki H, Ye B, Hamada T,
Isawa T, Mitsui H, Minamisawa K. Endophytic colonization and
in planta nitrogen fixation by a Herbaspirillum sp. isolated from
wild rice species. Appl Environ Microbiol, 2001, 67: 5285–5293
[30] Zakria M, Njoloma J, Saeki Y, Akao S. Colonization and nitro-
gen-fixing ability of Herbaspirillum sp. Strain B501 gfp1 and as-
sessment of its growth-promoting ability in cultivates rice. Mi-
crobes Environ, 2007, 22: 197–206
[31] Njoloma J, Tanaka K, Shimizu T, Nishiguchi T, Zakria M, Akashi
R, Oota M, Akao S. Infection and colonization of aseptically mi-
cropropagated sugarcane seedling by nitrogen-fixing endophytic
bacterium, Herbaspirillum sp. B501 gfp1. Biol Fertil Soils, 2006,
第 6期 魏春燕等: 绿色荧光蛋白基因标记的固氮菌 DX120E在甘蔗植株内的定殖 1139


43: 137–143
[32] Liu Y, Chen S F, Li J L. Colonization pattern of Azospirillum
brasilense Yu 62 on maize roots. Acta Bot Sin, 2003, 45: 748–752
[33] Reis V M, Olivares F L, Oliveira A L M, Reis F B, Baldani J I,
Döbereiner J. Technical approaches to inoculate micropropagated
sugar cane plants with Acetobacter diazotrophicus. Plant Soil,
1999, 206: 205–211
[34] Suman A, Gaur A, Shrivastava A K, Yadav R L. Improving sugar-
cane growth and nutrient uptake by inoculating Gluconacetobacter
diazotrophicus. Plant Growth Regul, 2005, 47: 155–162
[35] 罗霆, 欧阳雪庆, 杨丽涛, 李杨瑞. 15N同位素稀释法研究固氮
菌接种对甘蔗生物固氮的影响 . 核农学报 , 2010, 24:
1026–1031
Luo T, Ou-Yang X Q, Yang L T, Li Y R. Effect of nitrogen-fixing
bacteria inoculation on biological nitrogen fixation in sugarcane
by 15N isotope dilution technique. J Nucl Agric Sci, 2010, 24:
1026–1031 (in Chinese with English abstract)
[36] Iniguez A L, Dong Y, Triplett E W. Nitrogen fixation in wheat
provided by Klebsiella pneumonia 342. Mol Plant Microbe
Interact, 2004, 17: 1078–1085