全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(3): 389397 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(30872059, 31170650), 浙江省自然科学基金重点项目(Z3100473)和国家现代农业产业技术体系建设
专项(CARS-23)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 杨亚军, E-mail: yjyang@mail.tricaas.com; 王新超, E-mail: xcw75@mail.tricaas.com, Tel:
0571-86653162
第一作者联系方式: E-mail: haoxy2005@126.com
Received(收稿日期): 2012-07-20; Accepted(接受日期): 2012-11-16; Published online(网络出版日期): 2013-01-04.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20130104.1734.011.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00389
茶树生长素响应因子基因 CsARF1的克隆与表达分析
郝心愿 1,2 曹红利 2 杨亚军 1,2,* 王新超 2,* 马春雷 2 肖 斌 1
1 西北农林科技大学园艺学院, 陕西杨凌 712100; 2 中国农业科学院茶叶研究所 / 国家茶树改良中心 / 农业部茶树生物学与资源利
用重点实验室, 浙江杭州 310008
摘 要: 生长素响应因子(ARFs)是能够与生长素原初反应基因启动子区的生长素响应基元(TGTCTC)特异结合的一
类转录因子, 调控生长素应答基因的表达。采用 SMART-RACE-PCR技术, 获得茶树生长素响应因子基因 CsARF1的
全长 cDNA序列(GenBank登录号为 JX307853), 并进行了生物信息学分析和表达分析。CsARF1基因 cDNA全长 3222
bp, 包含 2463 bp的开放阅读框(ORF), 编码 820个氨基酸残基。编码蛋白的分子量为 49.35 kD, 具有保守的 N端 DNA
结合域 B3 和 C 端二聚化结构域 IAA_ARF, 中间区域富含谷氨酸、丝氨酸和亮氨酸, 是一个定位于细胞质的具有激
活转录功能的可溶性蛋白。相似性及系统进化分析表明, 该基因编码的氨基酸序列与葡萄 ARF8的相似性最高(83%),
与番茄 ARF8 的亲缘关系最近。利用实时荧光定量 PCR技术, 检测该基因在茶树越冬芽休眠到萌发后不同时期的表
达情况。结果显示 CsARF1 在茶树越冬芽深休眠和萌动期表达量较高, 表明该基因与茶树越冬芽的休眠维持及解除
密切相关。
关键词: 茶树; 休眠; 生长素响应因子; 表达分析
Cloning and Expression Analysis of Auxin Response Factor Gene (CsARF1) in
Tea Plant (Camellia sinensis [L.] O. Kuntze)
HAO Xin-Yuan1,2, CAO Hong-Li2, YANG Ya-Jun1,2,*, WANG Xin-Chao2,*, MA Chun-Lei2, and XIAO Bin1
1 College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2 Tea Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences,
National Center for Tea Improvement, Key Laboratory of Tea Plant Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008,
China
Abstract: Auxin response factors (ARFs) are transcription factors that bind to TGTCTC auxin response elements in promoters of
early/primary response genes and regulate the expression of auxin response genes. The full-length cDNA of one ARF gene named
CsARF1 (GenBank accession number JX307853) was firstly cloned from tea plant (Camellia sinensis [L.] O. Kuntze) by
SMART-RACE-PCR. The results indicated that the full-length cDNA of CsARF1 was 3222 bp containing 2463 bp ORF which
encoded 820 amino acid residues with a putative molecular mass of 49.35 kD. The soluble protein encoded by CsARF1 functioned
in the cytoplasm and consisted of an amino-terminal DNA-binding domain (B3), a carboxy-terminal dimerization domain
(IAA_ARF), and a Gln, Ser and Leu-rich middle region, which is proposed to function as an activation domain. Blast and phy-
logenetic analysis showed that the protein encoded by CsARF1 shared the highest identity (83%) with ARF8 in Vitis vinifera, and
had close genetic relationship with ARF8 in Solanum lycopersicum. The expression analysis of CsARF1 conducted by qRT-PCT
during the different phases of bud dormancy and bud break indicated that CsARF1 had a marked rise in the expression level at
deep dormant stage and sprouting stage, demonstrating that CsARF1 is relevant to the regulation of tea plant bud dormancy and
bud break.
Keywords: Tea plant (Camellia sinensis); Dormancy; Auxin response factor; Expression analysis
390 作 物 学 报 第 39卷
植物生长激素在植物生长发育的各个方面都发
挥着重要作用。通过胞内信号转导途径, 生长素参
与大量基因的调控 , 从而调节植物多种生命活动 ,
如细胞的伸长和分裂, 组织、器官的分化和形态建
成 , 向性运动等 [1]。目前在生长素相关基因中 , 对
Aux/IAA、GH3和 SAUR基因家族研究的最为透彻[2]。
这些基因家族中的大多数都属于原初反应基因, 即
可以对生长素处理做出快速反应而不需要新的蛋白
质合成。生长素响应基元(TGTCTC)是已知的一个与
生长素原初反应基因调控有关的启动子 DNA序列[3]。
依据该核心基元, Ulmasov等[4]1997年首次从拟南芥
中分离出能够与核心基元互作的转录因子, 并命名
为生长素响应因子(auxin response factor 1, ARF1)。
ARFs 能够与生长素响应基元特异结合从而激活或
抑制相关基因的表达, 在生长素信号转导中发挥重
要作用。
大多数的 ARFs含有一个 N端 DNA结合域, 一
个中间区域, 和一个 C 端二聚化结构域, 中间区域
又可以根据其功能分为活化结构域和抑制结构域[5]。
ARFs的 N端 DNA结合域和中间区域是决定其转录
活性的主要因素。研究发现具活化作用的中间区域
多富含谷氨酸、丝氨酸和亮氨酸, 而富含丝氨酸、
脯氨酸、亮氨酸和甘氨酸的中间区域则具有抑制转
录活性[3]。在拟南芥中, 除 ARF3/ENNIT、ARF13、
ARF17 和 ARF23 外, 其他 ARF 基因都有 C 端二聚
化结构域, 这个结构域与 Aux/IAA 蛋白编码基因的
核酸序列的第 3和第 4个基元存在相关性。Aux/IAA
蛋白是短命的核蛋白, 通常由生长素原初反应基因
编码[5]。酵母双杂交试验发现, ARFs的 C末端二聚
化结构域可选择地与 Aux/IAA蛋白发生同源和异源
二聚化反应[6]。当生长素处于低浓度时, Aux/IAA蛋
白作为反向调控因子可能并不与生长素响应基元结
合, 而是通过与具有促进转录活性的 ARF结合从而
作用于原初反应基因, 抑制其表达。当生长素浓度
升高时, Aux/IAA蛋白与 ARF水解分离[5,7-8]。Wang
等[9]对水稻(Oryza sativa)中生长素响应因子家族基
因进行表达及基因组分析, 并与拟南芥中生长素响
应因子家族基因进行对比分析。结果发现 ARFs在不
同的植物组织中均有表达, 而且在作为单子叶和双
子叶植物代表的水稻和拟南芥中, ARFs家族蛋白具
有很高的相似性。说明 ARFs 在单双子叶植物分化
以前就已存在。可见 ARFs家族基因在植物生命活动
中发挥着不可或缺的作用。
多年生植物在整个生命周期中会遇到不利的逆
境条件。植物的休眠机制则是植物抵御逆境的有效
手段。茶树的冬季休眠对茶树安全越冬有着十分重
要的意义, 但有关茶树冬季芽休眠机理的研究鲜有
报道。有研究发现, 生长素在植物芽休眠与解除中
发挥重要作用[10-11]。在本实验室构建的茶树萌动芽
与休眠芽抑制消减杂交文库中发现了大量与生长素
响应相关的基因片段[12]。为进一步揭示生长素在茶
树越冬芽休眠与解除中的作用, 本研究以生长素应
答基因的重要调控因子 ARF为切入点, 以文库中筛
选出的一条与 ARF 基因高度同源的表达序列标签
(EST)为基础, 用生物信息学方法综合分析, 以期为
研究生长素在茶树越冬芽休眠与萌发中的作用机制
提供一定的参考。
1 材料与方法
1.1 植物材料与试剂
选用种植于国家种质杭州茶树圃的国家级特早
生茶树品种龙井 43。参照王新超等[13]的采样方法及
所用试剂。
1.2 总 RNA提取
采用植物总 RNA 提取试剂盒(Tiangen Biotech,
Beijing)提取茶芽不同休眠阶段的总 RNA。用 Nano-
Drop ND100 微量核酸蛋白测定仪(Pittsburgh, PA,
USA)测定 RNA 浓度, 用 1.0%变性琼脂糖凝胶电泳
检测总 RNA质量。于–80℃保存所得 RNA备用。
1.3 目的基因的克隆
以本实验室构建的茶树休眠芽和萌动芽 SSH-
cDNA 文库中 1 条与生长素响应因子基因中间序列
高度同源的 EST 序列为基础, 依据其他植物中已知
ARF 基因序列, 在保守区设计 RT-PCR 引物(表 1),
扩增中间片段并测序。根据测序结果, 按照 Clontech
公司 SMART RACE cDNA synthesis kit的要求设计
3′-和 5′-RACE特异引物(表 1), 以龙井 43腋芽 RNA
为材料, 依照试剂盒说明进行 3′-RACE和 5′-RACE,
获得目的基因的 3′和 5′端。回收纯化 PCR 产物, 连
接至载体 pCR2.1, 转化大肠杆菌 DH5α, 鉴定并测
序。为保证测序的准确性, 每个 PCR 连接产物测序
3 个。采用 DNAStar 软件拼接测序所得的 3′端和 5′
端序列与原有的 EST序列, 得到全长 cDNA序列。
1.4 目的基因的序列分析
利用 NCBI 数据库的 Blast 比对分析同源性,
DNAStar 软件查询开放阅读框, PROSTIE 软件进行
第 3期 郝心愿等: 茶树生长素响应因子基因 CsARF1的克隆与表达分析 391
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequences
引物
Primer
引物序列
Primer sequences (5′–3′)
用途
Function
CsARF1-S TTTAGAGGAGAAACTGGAGAGC 中间片段上游引物 Forward primer for middle fragment of gene
CsARF1-A CATAGATAGAACCAAAAGGCAA 中间片段下游引物 Reverse primer for middle fragment of gene
CsARF1-3′ AAAGGGATGAATACCAGTGGGAGTG 3′-RACE基因特异引物 Gene specific primer for 3′ end
CsARF1-5′ GTCCAACCGATCCCGACTTGTAAACC 5′-RACE基因特异引物 Gene specific primer for 5′ end
CsARF1-QS AGGCTGGCAGCTTGTATTCGT 荧光定量上游引物 Forward primer for real-time PCR
CsARF1-QA CCACTGGTATTCATCCCTTTCG 荧光定量下游引物 Reverse primer for real-time PCR
18S-F TCTCAACCATAAACGATGCCGACCAG 荧光定量内参上游引物 Forward primer of reference gene for real-time PCR
18S-R TTTCAGCCTTGCGACCATACTCCC 荧光定量内参上游引物 Reverse primer of reference gene for real-time PCR
结构域分析, ProtParam计算蛋白质的相对分子量和
理论等电点, SignalP 4.0预测信号肽, ClustalX 2.0软
件进行多序列对齐和排序, GenDOC 软件输出同源
比对和进化树构建结果, GOR 4进行二级结构分析,
SOSUI分析亲水性/疏水性, PSORT进行亚细胞定位,
NetPhos 2.0 Serve分析蛋白磷酸化位点, Tmpred预
测蛋白跨膜结构, SWISS-MODEL Workspace在线工
具对目的蛋白预测三维结构, 在 PyMol 软件中编辑
图形, 最后得到三维结构模型[14]。
1.5 目的基因在茶树芽休眠和萌发后不同阶段
的表达分析
以茶树 18S 基因作为内参基因, 根据目的基因
序列设计荧光定量 PCR 引物(表 1)。以休眠初期(11
月 5日)、深休眠期(12月 25日)、膨大期(1月 16日)、
萌发期(2 月 20 日)、鱼叶期(3 月 10 日)和一芽一叶
期(3月 16日)的总RNA为材料, 按照 PrimeScript RT
reagent (TaKaRa, 大连)试剂盒中操作方法合成 cDNA,
参照王新超等[14]方法设定反应体系及程序, 稀释 5
倍做模板, 在 ABI PRISM 7500实时定量 PCR仪上
反应, 每个反应设 3次重复, 采用 2–ΔΔCT算法分析结
果[15]。
2 结果与分析
2.1 生长素响应因子基因 CsARF1的克隆
依据文库中获得的 EST 片段设计引物(表 1)进
行 RT-PCR 扩增, PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测
后回收、克隆并测序, 经 GenBank 比对获得长度为
1406 bp的 ARF中间序列(图 1-A)。根据中间序列设
计RACE反应的特异引物, 采用 SMART RACE技术
获得长度为 455 bp的 3′片段和长度为 2500 bp的 5′
片段(图 1-B, C)。采用 DNAstar软件拼接中间序列与
3′端和 5′端序列, 获得全长 cDNA 序列, 总长度为
3222 bp。其中开放阅读框(ORF) 2463 bp, 编码由
820个氨基酸组成的目的蛋白(图 2)。
图 1 茶树生长素响应因子基因 RT-PCR(A)、3′-RACE(B)和 5′-RACE(C)电泳结果
Fig. 1 Results of RT-PCR(A), 3′-RACE (B), and 5′-RACE (C) in CsARF1 gene
392 作 物 学 报 第 39卷
图 2 茶树生长素响应因子全长 cDNA的核苷酸序列和推测氨基酸序列
Fig. 2 Full length cDNA and putative amino acid sequences of CsARF1 in tea tree
开放阅读框用下画线标出, 保守区域用阴影标出。
The open reading frame was underlined, the conserved domains were shaded.
2.2 CsARF1序列同源性分析
经氨基酸序列比对, CsARF1属于生长素响应因
子超家族。利用 PROSTIE软件进行结构域分析, 结
果显示 CsARF1的 N端具有高等植物转录因子特有
的 B3-DNA 结合域(第 127~229 位氨基酸), 且在 C
端具有二聚化结构域 AUX_IAA(第 712~794 位氨基
酸)。氨基酸序列比对表明, ARF1与其他植物的生长
素响应因子氨基酸序列相似性很高。其中与葡萄
(XP_002266678)的相似性最高 , 达 83%; 与番茄
(NP_001234783)、杨树(XP_002305917)、大豆(XP_
003519308)、蓖麻(XP_002526195)的相似性分别为
78%、78%、77%和 79%。
在 NCBI 上筛选出与 CsARF1 氨基酸序列相似
性较高的 15 种植物的 15 个生长素响应因子, 其多
序列比较分析显示, CsARF1的N端和 C端氨基酸序
列均非常保守, 相似程度较高, 而非保守的中间区域
相似性较低。这与已知的 ARF 序列特征相吻合。从
序列比较分析中还看出, 单子叶植物和双子叶植物
的 ARF 序列相似性有所不同, 但都具有相似的保守
区域。相邻连接法绘制的进化树显示, CsARF1与番
茄和牵牛花的 ARF8关系较近(图 3)。根据比对结果可
以确定所获全长基因为茶树的生长素响应因子基因。
2.3 CsARF1蛋白质特征分析及 3D结构预测
2.3.1 CsARF1氨基酸组成及理化性质分析 CsARF1
第 3期 郝心愿等: 茶树生长素响应因子基因 CsARF1的克隆与表达分析 393
图 3 茶树与其他植物生长素响应因子蛋白氨基酸序列的进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic tree of CsARF1 of C. sinensis and other plant species
氨基酸残基数为 820, 经 Protparam预测, 其分子量为
91 590.7 Da, 理论等电点(PI)5.82, 含量最丰富的氨
基酸有 Ser 10.7%、Leu 9.3%和 Gln 8.7%, 带负电荷
的氨基酸数为 79, 带正电荷的氨基酸数为 62。
CsARF1 中间非保守区域(从第 400 位到第 700 位氨
基酸)含量最丰富的氨基酸为 Gln 15.3%、Ser14.0%
和 Leu9.6%, 表明 CsARF1 是一个具有促进转录活
性的转录因子。
2.3.2 CsARF1 蛋白亲水/疏水性分析 蛋白质
亲水性氨基酸和疏水性氨基酸的组成是蛋白质折叠
的主要驱动动力 , 影响蛋白质的结构和特性。经
SOSUI 分析, CsARF1 蛋白的平均疏水性为–0.446,
属水溶性蛋白。经 ProtScale Sever在线分析软件, 采
用 Hyhob/Kyte& Doolittle 的方法进一步验证(图 4)
显示, 最大正值为 1.844, 最小负值为–2.989, 表明
CsARF1为亲水蛋白。
2.3.3 CsARF1 蛋白信号肽预测 利用 SignalIP-
4.0软件分析 CsARF1蛋白信号肽, 并预测信号肽位
置及切割位点 , 结果显示平均分(mean score)小于
0.5。利用最大 Y 值(Y-score maximum)预测表明 ,
CsARF1 蛋白不存在信号肽及剪切位点, 属于非分
泌蛋白。
2.3.4 CsARF1 蛋白卷曲螺旋结构预测与分析
利用 GOR4软件预测蛋白二级结构显示, CsARF1蛋
白由 20.98%的 α-螺旋, 21.71%的延伸链和 57.32%的
随机卷曲 3种结构模块组成。SOPMA进一步验证获
得相似的结果。
2.3.5 CsARF1 蛋白磷酸化位点预测与分析 利
用 NetPhos 2.0 Serve软件预测 CsARF1基因翻译后
修饰, 结果显示 CsARF1 有可能发生磷酸化的位点
共有 48 个(图 5)。色氨酸(Ser)有可能发生磷酸化的
位点有 36个, 分别在肽链的第 6、9、134、137、143、
201、238、241、242、272、293、308、330、352、
383、454、472、543、547、549、551、563、578、
394 作 物 学 报 第 39卷
图 4 CsARF1的亲水性/疏水性预测
Fig. 4 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of CsARF1
图 5 CsARF1蛋白氨基酸序列翻译后磷酸化修饰位点预测
Fig. 5 Prediction of phosphorylation site modification in amino acid sequence of CsARF1 protein
594、597、611、619、667、719、721、729、732、
733、792、806、808位。苏氨酸(Thr)有可能发生磷
酸化的位点有 8个, 分别在肽链的第 57、98、229、
233、343、427、623、630 位。络氨酸(Tyr)有可能
发生磷酸化的位点有 4个, 分别在肽链的第 94、111、
688、817位。
2.3.6 CsARF1 蛋白的跨膜结构预测与分析 利
用在线软件 Tmpred预测 CsARF1蛋白跨膜结构, 显
示该蛋白可能存在两个 N-端向外的强跨膜螺旋, 总
得分为 1832 (图 6)。分别在多肽链 24~46 位和
245~263 位之间, 得分分别为 1052 和 780, 均大于
500。因此, CsARF1蛋白存在两个跨膜结构域, 属于
跨膜蛋白, 在胞内将发生跨膜运动。
2.3.7 CsARF1 蛋白的亚细胞定位 蛋白的亚细
胞定位与蛋白的功能密切相关。利用 PSORT软件预
测表明, CsARF1 蛋白位于细胞质中的可能性最大,
说明 CsARF1蛋白是一种细胞质蛋白。
2.3.8 CsARF1 蛋白的三维结构预测 利用 SWISS-
MODEL Workspace 在线预测 CsARF1 蛋白的三维结
构, PyMol 软件编辑预测结构, 获得其三维结构模型
(图 7)。结果显示, CsARF1 蛋白具有与 RAV1 的 B3
DNA结合域高度相似的溶解结构, 是典型的启动子。
第 3期 郝心愿等: 茶树生长素响应因子基因 CsARF1的克隆与表达分析 395
图 6 CsARF1蛋白跨膜区预测
Fig. 6 Prediction model for transmenbrane domain of CsARF1 protein
图 7 CsARF1蛋白的三维结构
Fig. 7 3-D structure of CsARF1 protein
2.4 CsARF1在茶芽发育不同时期的表达特性分析
以茶树龙井 43为材料, 利用实时荧光定量 PCR
技术分析了 CsARF1 从秋季茶芽进入休眠到春季茶
芽萌发期间不同时间点的表达情况(图 8)。结果显示
CsARF1 在茶芽发育的不同阶段都有一定量的表达,
且在茶芽深休眠及萌动期表达量较高。在茶芽深休
眠阶段 CsARF1 的表达量几乎是休眠初期的 2 倍。
而在茶芽萌动期 CsARF1 的表达量较其他时期达到
最高。说明该基因可能参与了茶芽的生长发育及休
眠的调控。
图 8 ARF1基因在茶树芽的不同发育阶段的表达水平
Fig. 8 Relative expression of ARF1 gene at different
development stages of tea buds
A: 休眠初期; B: 深休眠; C: 膨大期; D: 萌动期; E: 鱼叶期;
F: 一芽一叶期。
A: initial dormant stage; B: deep dormant stage; C: expanding stage;
D: sprouting stage; E: fish leaf stage; F: one bud and one-leaf.
3 讨论
3.1 茶树 CsARF1基因的克隆与编码蛋白的结构
分析
ARF 是调控生长素原初反应基因表达的转录因
子, 属超基因家族, 一般都具有保守的 N端 DNA结
合域和Ｃ端二聚化结构域[5]。这与其在调控基因转
录时的功能相一致。ARF 的 N 端 DNA 结合域能够
与生长素响应基元(TGTCTC)结合 , 从而调控相关
396 作 物 学 报 第 39卷
基因的转录表达 [3]。其 C 端二聚化结构域则与
Aux/IAA 蛋白的第 3 和第 4 个基元存在相关性, 因
此 ARF能够与 Aux/IAA蛋白发生二聚化作用[6]。二
聚化反应的发生影响 ARF的启动转录功能。ARF中
间的非保守区域富含氨基酸种类的不同往往决定其
转录活性: 中间区域富含谷氨酸、丝氨酸和亮氨酸
的具有激活转录活性, 而中间区域富含丝氨酸、脯氨
酸、亮氨酸和甘氨酸的则具有抑制转录活性[5,16-17]。
ARF 能够依据胞内生长素浓度的不同发挥促进或抑
制转录功能, 进而调控复杂的生长素反应。
本研究从茶树腋芽中克隆出的茶树 CsARF1 基
因具有 ARF 基因家族典型的序列特征。CsARF1 蛋
白的 N 端和 C 端分别具有 ARF 家族非常保守的
DNA结合域和二聚化结构域。中间的非保守区域富
含谷氨酸、丝氨酸和亮氨酸, 表明 CsARF1 应具有
促进转录活性。CsARF1蛋白与葡萄 ARF8的氨基酸
序列相似性最高(83%), 与番茄 ARF8的亲缘关系最
近, 表明本研究所克隆的基因为茶树生长素响应因
子基因。生物信息学方法分析表明, CsARF1基因编
码蛋白不存在信号肽及剪切位点, 属于非分泌的水
溶性蛋白。CsARF1蛋白被定位于细胞质中, 且具有
两个跨膜螺旋结构, 在胞内将发生跨膜运动。可见
CsARF1 蛋白是在细胞质中被合成, 经跨膜运动进
入细胞核, 在核内发挥转录因子的功能。三维结构
分析发现, CsARF1蛋白具有高等植物转录因子特有
的 B3 DNA结合域。
3.2 CsARF1基因表达与茶芽休眠和萌发的关系
植物生长素参与植物大多数的生命活动, 与植
物的类休眠密切相关[18]。研究发现生长素还可能通
过抑制芽对细胞分裂素的信号感受来改变其细胞周
期, 从而控制芽的生长发育[10]。从本实验室构建的
茶树休眠芽和萌发芽抑制消减杂交文库中发现, 很
多与激素相关的差异表达序列片段(EST)都与生长
素信号通路有关[12]。作为调节生长素相关基因表达
的重要转录因子, CsARF1可能在茶树越冬芽休眠的
形成和维持中发挥重要作用。实时荧光定量 PCR对
CsARF1 在茶树越冬芽发育不同时期表达量的检测
结果显示, CsARF1在深休眠及萌动期都有较高的表
达。Tiwari 等[5]研究发现, 在低生长素浓度下, ARF
会与反向调控因子 Aux/IAA 发生二聚化作用, 生长
素原初反应基因的表达被抑制。而在高生长素浓度
下, Aux/IAA经蛋白酶体途径被快速降解, ARF的转
录功能得以发挥。但当 ARF与自身发生二聚化作用
形成二聚体之后, 其转录功能将得到增强且不受外
界生长素浓度的影响。在冬季茶芽深休眠期, 胞内
游离态的生长素浓度较低[19], 此时 CsARF1 的高表
达可能与其增强启动生长素原初反应基因有关。在
萌动期, 腋芽的大量生命活动需要生长素相关基因
的参与, 这与此时 CsARF1的高表达相一致。而在萌
动期之后, 腋芽中生长素浓度会因生长素的极性运
输而升高, Aux/IAA的抑制作用将被部分解除, CsARF1
的表达水平降低。由此可见, CsARF1可能参与了茶
芽休眠维持及萌发的调控。CsARF1作为具有活化作
用的转录因子, 其在休眠期的高表达也进一步说明
生长素相关基因可能在茶树越冬芽的休眠维持中发
挥重要作用。这为深入揭示生长素调控茶树越冬芽
休眠的分子机理的提供了理论依据。
CsARF1 虽为调控茶树生长素相关基因转录的
一个重要转录因子 , 但生长素信号通路相当复杂 ,
而且茶树中的生长素响应因子基因应该还存在其他
家族成员。因此要全面阐明生长素在茶树越冬芽休
眠中的作用, 还应将 ARF 基因家族其他成员的表达
与茶树越冬芽中的生长素水平变化结合起来, 从基
因功能及信号转导通路方面深入揭示生长素调控茶
树越冬芽休眠的作用机制。
4 结论
在茶树中克隆了生长素响应因子 CsARF1 的全
长 cDNA。CsARF1编码蛋白具有 ARF家族保守的 N
端DNA结合域和 C端二聚化结构域, 且中间区域富
含谷氨酸、丝氨酸和亮氨酸, 是一个定位于细胞质
的具有激活转录功能的可溶性蛋白, 与番茄 ARF8
的亲缘关系最近。CsARF1在茶树越冬芽深休眠和萌
动期表达量较高, 表明该基因与茶树越冬芽的休眠
维持及解除密切相关。
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