全 文 ：武汉植物学研究
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! ∀# ∃ %  &一
∋ ∋
( ) ∗ +, − . )/ 0 ∗ 1− , 2 ) 3− , 45 − . 6 5 7 5− +8 1
6 丁一9: 6 联合一步法扩增
; 蛋白 − 亚基基因的开放阅读框
彭艳华 ’ 黄永秀
∀武汉大学病毒系分子病毒室
齐义鹏
武汉 ! < ∋ ∋& # ∃
提 要 报道逆转录一多聚酶链式反应 ∀6 = 一9: 6 ∃联合一步程序 , 扩增大于 >? ≅ 的拟南芥菜
; 蛋白 Α 亚基基因的开放阅读框 。 该程序中 , 当 6 Β Χ 模板和 引物变性 , 并在 同 一管中加入
9: 6 缓冲液 、 ! 种 Δ Β = 9 底物 、逆转录酶和 = −Ε Φ Β Χ 聚合酶之 后 , 就不需其它手 工操 作步
骤 , 因而可同时进行大批量样品的操作 。 实验结果证明 Χ Γ Η ∀鸟类骨髓性白血病病毒 ∃逆转
录酶对 = − Ε Φ Β Χ 聚合酶的活性没有抑制作用 。 这种 6 = 一9: 6 联合 一步法可从 。Ι ϑ 拌Κ 的 总
6 Β Χ 中快速地扩增长于
Ι ∋ ?≅ 的 : Φ Β Χ 片段 。
关键词 逆转录一多聚酶链式反应 , 信使核糖核酸 , 开 放阅读框 , ; 蛋 白 − 亚基基 因 , 拟 南芥菜
虽然 = −Ε Φ Β Χ 和 = 31 Φ Β Χ 聚合酶 能够直接进 行以 6 Β Χ 为模板 的转录〔, , # 〕 , 但
Χ Γ Η 和 Γ 一Γ Λ Η 逆转录 酶是首先用于将 6 Β Χ 转录为 。Φ Β Χ 第一链 的酶 , 然后 才经
9: 6 扩增产生 。Φ Β Χ 。 由于逆转录酶的对热稳定性和它使 = −Ε Φ Β Χ 聚合酶失活的潜在
可能性 〔<〕, 使 6 = 一9: 6 联合一步法的使用大为推迟 。 用同一缓冲液进行逆转录和多聚酶
链式反应 , 于
 Μ Μ 年 由Γ ∗ +−? − Ν 及 同事首次报道 , 但与其他报道一样 , 这些方法仅适于
扩增较短的 8 Φ Β Χ 片段 , 因而只能用作基因表达的检测〔‘〕。
人们希望有一种简单有效的程序从相对少的转录本或含 6 Β Χ 酶较 多的材料的转录
本 中扩增较长的 。Φ Β Χ 。 近年 ∀
  ! 年 ∃已有报道用 6 = 一9: 6 联合一步法从老 鼠组织扩增
促黄体激素受体 8 Φ Β Χ 的全长开放阅读框 〔ϑ , 〕。 我们报道改进了的 6 = 一9: 6 联合一步法
扩增拟南芥菜 ; 蛋 白 。 亚基基 因的
Ι
ϑ ? ≅ 的开放 阅读框川 , 这一程序特别适合于含
6 Β Χ 酶极为丰富的幼嫩植物材料 。

材料和方法

Ι
材料
拟南芥菜 ∀Χ +− ≅. Δ )Ο 74 31 −. .− .Π− ∃种子由美国冷泉港实验室马红教授赠送 。
收稿 日 %
 ϑ ∋ ϑ一
 , 修回日 %
  ϑ 一
∋ 一
Μ 。 第一作者 % 女 , 来 中国科学院武汉植物研究所定向博士生 。
武 汉 植 物 学 研 究 第
! 卷

Ι # 方法
将灭菌的种子置于无激素的
Θ# Γ Ρ 培养基上生长 ,
∋ Δ 后 , 用改进 了的异硫氰酸肌
法提取幼苗中的总 6 Β Χ 〔的 。 取材
∋ Σ Κ 以下 , 加入裂解液之后 , 用 电动匀浆器 ∀微型 ∃匀
浆
∋ ϑ , 或用
# 号针头的注射器来回剪切 #∋ 次 , 以减少溶液粘度 , 使 Φ Β Χ 彻底与 6 Β Χ
分开 , 并进 入提取液的有机相 , 达到完全除去 Φ Β Χ 的目的 。
将上述方法获得的总 6 Β Χ 直接作为 6 = 一9: 6 反应中的转录本样品 , 在
Ι ϑ Σ Λ 离
心管中依次加入反应物质 , 其程序如下 %
总 6 Β Χ 样品 < 拌Λ
无菌双蒸水∀加 Τ) ∗ 小Λ 6 Β Χ 7 4, 拌Λ
引物 Υ爱窝ς%%黔比
告
正 向引物为 ϑ 气= : Χ = Χ Χ Χ Χ ; ; : : Χ ; : : = : : Χ 一< ‘
反向引物为 ϑ 气Χ = ; ; ; : 尸+= Χ : = : = ; : Χ ; = Χ ; 一< ‘
变性 ∀
∋ ∋ : , # Σ 4, ∃
于冰上
寺

∋ 倍 9: 6 ≅ ∗ ΩΩ5 + 7 拌Λ )
· 7Σ ) .Θ Λ Ξ : >, Ψ· .Σ ) .广Λ = + 47 一Ζ : >∀Ο Ζ Ρ · < ∃〕

ϑ Σ Σ ) .Θ Λ Γ Κ :
# , ∋ Ι ∋
[ 2 Ρ Χ 夕
! 种 Δ Β = 9 混合物 ∀浓度各 . )Σ Σ ). Θ Λ ∃ , ! 拜Λ
Χ Γ Η 逆转录酶
∗ , # 拜Λ
= − Ε Φ Β Χ 聚合酶 7 ∗ , # 拌Λ
无菌 双蒸水 # 拜Λ
反应 总体积 ϑ∋ 拜Λ
所有反应物质小心混合 , 加盖一层矿物油 , 逆转录条件为 !# : , . 1 。 ϑ : 变性 ϑ Σ 4, ,
接 着在 9: 6 仪上进行 <∋ 个 9: 6 热循环 。 每个循环条件为 ! : , <∋ ϑ 变性 Π引物退火为
ϑ & : ,
Σ 4, Π 延伸反应为 & # : , # Σ 4, , 最后一次加
∋ Σ 4, 延伸 。 扩增产物在加有 ∴ 2 的
∋ Ι & [的琼脂糖凝胶上进行电泳 , 并在紫外灯下检测 、 照相 。
结果
# Ι
不同含量的总 6 Β Χ 对 6 = 一9: 6 反应特异产物的影响
图
显示不同量的总 6 Β Χ 对拟南芥菜 ; 蛋 白 − 亚基基因的 Ψ 6 ] 扩增的影响 。 总
6 Β Χ 为 ∋Ι ϑ 拌Κ 时 , ∀逆转录酶和 = −Ε Φ Β Χ 聚合酶保持不变 , 分别为
∗ 和 7 ∗ ∃ , 经 6 = ⊥
9 :6 反应后 , 其扩增产物经琼脂糖电泳之后 , 紫外灯下可清楚地观察到特异的扩增带 ∀图

% 第
泳道 ∃ 。 总 6 Β Χ 在
∋ 拼Κ 的范围内 ,特异扩增带强度随总 6 Β Χ 量增加而加强 , 但
当 6 Β Χ 量超过
∋ 胖Κ 之后 , 特异扩增产物量下降 ∀见图
% # 、 < 、 ! 泳道 ∃ 。
# Ι # 逆转录酶和 = − Ε Φ Β Χ 聚合酶浓度对 6 = 一9 : 6 产物的影响
当 = − Ε Φ Β Χ 聚合酶量一定 ∀ϑ ∗∃ , 总 6 Β Χ 量为
∋ 拼Κ 时 , 6 = 一9: 6 体 系中逆转录酶
量增加 , 特异性扩增产物显著增加 ∀图 # % − ∃ 。 只有当总 6 Β Χ 量增加到 #∋ 陀 时 , 这种随
6 Β Χ 量增加扩增产物增加 的效应才被消除 。 另一方面 , 在逆转录酶一定 ∀
∗∃ 时 , 增加
= − Ε Φ Β Χ 聚合酶量则导致特异扩增产物量明显下降 ∀图 # % ≅ ∃ 。 这种随 = −Ε Φ Β Χ 聚合酶
浓度升高而反应的特异产物下降的效应 , 在增加模板 6 Β Χ 量之后又被消除 。
武 汉 植 物 学 研 究 第
! 卷

Ι # 方法
将灭菌的种子置于无激素的
Θ# Γ Ρ 培养基上生长 ,
∋ Δ 后 , 用改进 了的异硫氰酸肌
法提取幼苗中的总 6 Β Χ 〔的 。 取材
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将上述方法获得的总 6 Β Χ 直接作为 6 = 一9: 6 反应中的转录本样品 , 在
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心管中依次加入反应物质 , 其程序如下 %
总 6 Β Χ 样品 < 拌Λ
无菌双蒸水∀加 Τ) ∗ 小Λ 6 Β Χ 7 4, 拌Λ
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无菌 双蒸水 # 拜Λ
反应 总体积 ϑ∋ 拜Λ
所有反应物质小心混合 , 加盖一层矿物油 , 逆转录条件为 !# : , . 1 。 ϑ : 变性 ϑ Σ 4, ,
接 着在 9: 6 仪上进行 <∋ 个 9: 6 热循环 。 每个循环条件为 ! : , <∋ ϑ 变性 Π引物退火为
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结果
# Ι
不同含量的总 6 Β Χ 对 6 = 一9: 6 反应特异产物的影响
图
显示不同量的总 6 Β Χ 对拟南芥菜 ; 蛋 白 − 亚基基因的 Ψ 6 ] 扩增的影响 。 总
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9 :6 反应后 , 其扩增产物经琼脂糖电泳之后 , 紫外灯下可清楚地观察到特异的扩增带 ∀图

% 第
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∋ 拼Κ 的范围内 ,特异扩增带强度随总 6 Β Χ 量增加而加强 , 但
当 6 Β Χ 量超过
∋ 胖Κ 之后 , 特异扩增产物量下降 ∀见图
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# Ι # 逆转录酶和 = − Ε Φ Β Χ 聚合酶浓度对 6 = 一9 : 6 产物的影响
当 = − Ε Φ Β Χ 聚合酶量一定 ∀ϑ ∗∃ , 总 6 Β Χ 量为
∋ 拼Κ 时 , 6 = 一9: 6 体 系中逆转录酶
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浓度升高而反应的特异产物下降的效应 , 在增加模板 6 Β Χ 量之后又被消除 。

∋ ∋ 武 汉 植 物 学 研 究 第 以 卷
参 考 文 献
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