全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2015, 41(3): 507514 http://zwxb.chinacrops.org/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中国农业科学院创新工程项目资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 赵明, E-mail: zhaomingcau@vip.tom.com
第一作者联系方式: E-mail: zhangguifang@bnu.edu.cn
Received(收稿日期): 2014-05-09; Accepted(接受日期): 2014-12-19; Published online(网络出版日期): 2015-01-28.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20150128.1620.001.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2015.00507
稗草(Echinochloa crusgalli)根型 ppc基因对水稻的遗传
转化及其对光合速率的调节效应
张桂芳 1,2 丁在松 1 赵 明 1,*
1中国农业科学院作物科学研究所 / 农业部作物生理生态重点实验室, 北京 100081; 2北京师范大学生命科学学院 / 北京师范大学学
报(自然科学版)编辑部, 北京 100875
摘 要: 稗草(Echinochloa crusgalli)是稻田中的 C4光合型杂草, 为了探索稗草 ppc基因(Eppc)对水稻遗传转化的可行性
及其对光合速率的调节效应, 首次将含有稗草根型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)基
因 ppc cDNA的 2个植物表达载体 pUbi-Eppc、pRbcS-Eppc通过农杆菌介导法对水稻进行了遗传转化。对分化植株进行
的 PCR、RT-PCR、克隆测序和 Western 杂交等结果均表明稗草 ppc 基因已经整合到了水稻基因组中, 并且在转录和翻
译水平都得到了表达。转基因水稻 PEPC 活性和气体交换参数测定结果表明 T0代多数植株的 PEPC 活性高于对照, 最
高达到了对照的 5.85倍; T0代大多数转基因植株叶片的净光合速率(Pn)比对照提高了 20.00%, 最大地提高了 47.16%, 同
时叶片水分利用效率(WUE)也得到增强; T6代大部分转化植株的 PEPC 活性及 Pn仍保持高于对照, 本研究表明 C3根型
ppc基因过量表达也可以提高水稻的 Pn, 且证明稗草 PEPC对光合作用具有较强的调节作用。
关键词: 稗草; 根型 Eppc基因; 水稻; PEPC活性; 净光合速率; 水分利用效率
Transformation of Barnyardgrass (Echinochloa crusgalli) Root Type Phospho-
enolpyruvate Carboxylase Gene into Rice (Oryza sativa) Plants and Their Ef-
fects on Photosynthesitic Gas Exchange
ZHANG Gui-Fang1,2, DING Zai-Song1, and ZHAO Ming1,*
1 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of the Ministry of Agriculture Crop Physiology and Ecology,
Beijing 100081, China; 2 College of Life Science / Editorial Department of Journal of Beijing Normal University (Natural Science), Beijing
100875, China
Abstract: Barnyardgrass (Echinochloa crusgalli) is a C4 weed commonly found in rice field. To fully utilize the photosynthestic
potential of Barnyardgrass C4 gene, we transformed Barnyardgrass root Phosphoenolpyruvate Carboxylase gene into rice plant
with vectors contained promoters of Ubiqitin gene and Rubisco small unit gene by Agrobactirium- mediated transformation. Both
marker genes Hygr and ppc were detected by PCR in regenerated plants. RT-PCR and Western blot analysis confirmed that the ppc
gene was incorporated into rice plant and expressed with stable transcripts and proteins. PEPC activity as measured in most of the
transgenic rice plants was higher than that in control, being up to 5.85-fold of that in untransformed rice. At T0 generation, net
photosynthetic rate (Pn) in most of transgenic rice plants was 20.00% higher than that in untransformed rice, with the highest in-
crease of 47.16%. Water utilization efficiency (WUE) in transgenic rice was also improved. At T6 generation, PEPC activity and
Pn of transgenic lines remained higher than those of the wild type. These indicate that over-expressing C3 Eppc gene also can im-
prove rice photosynthesis.
Keywords: Echinochloa crusgalli; Root phosphoenolpyruvate carboxylase gene; Rice; PEPC activities; Net photosynthetic effi-
ciency; Water use efficiency
在 C4 植物的绿色组织中, 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶
(PEPC)是参与光合作用 CO2原初固定反应的酶。PEPC与
CO2有很强的亲和力, 其主要功能是在高温、强光下能把
大气中含量很低的 CO2 以四碳酸的形式固定下来, 进而
508 作 物 学 报 第 41卷


运输到维管束鞘细胞叶绿体中供 C3途径利用。将 C4植物
的 C4型 ppc基因导入 C3作物如水稻中以提高水稻的光合
能力已有多例报道[1-5]。例如, 来源于玉米和谷子的 ppc
基因都被成功地导入了水稻 , 在一定程度上改善了水稻
的光合作用[1,6]。而稗草作为与水稻共生的主要 C4型野生
植物, 比水稻具有更强的生长优势, 其 ppc 基因的利用还
鲜有报道。在 C3植物及 C4植物的其他非光合组织中, 还
存在其他形式的 PEPC同工酶, 这些同工酶起着碳骨架回
补作用, 参与植物的多种生理过程如气孔开放、种子发育
与萌发、果实发育等[7-8]。C3和 C4型 PEPC除了具有不同
的表达特征外, 其蛋白还具有不同的变构调控特征, 以适
应其参与的不同生理过程。已有的研究均是将来源于 C4
植物的 C4型 ppc基因导入 C3植物, 而将来源于 C4植物的
C3型 ppc基因导入水稻中尚未见报道。
我们前期从稗草中克隆了一个属于 C3根型的 ppc 基
因 [9], 将该基因的 cDNA 分别与 Ubiquitin 基因启动子
pUbi和 1,5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基基因启动
子 pRbcS融合构建了 2个表达载体, 通过农杆菌介导转化
中花 8 号水稻品种, 建立了稗草根型 ppc 基因(Eppc)对水
稻的转化体系, 获得了一批转基因中花 8号水稻植株并对
其 PEPC活性和气体交换特征进行了检测。
1 材料与方法
1.1 试验材料
用于遗传转化的水稻品种中花 8号、菌株、质粒及载
体等均由中国农业科学院作物科学研究所实验室保存 ;
试剂中的酶类购自 TaKaRa 公司; 抗生素类购自 Sigma;
乙酰丁香酮购自 Aldrich。
1.2 方法
1.2.1 根癌农杆菌 LBA4404 的转化 2 个植物表达载
体 pUbi-Eppc和 pRbcS-Eppc中, 连接稗草根型 ppc基因的
启动子分别为 pUbi和 pRbcS、终止子为 nos, 采用三亲杂
交法将 pUbi-Eppc、pRbcS-Eppc 分别转入根癌农杆菌
LBA4404。
1.2.2 水稻的遗传转化 水稻种子去除颖壳后, 用次
氯酸钠消毒 30 min; 然后接种于诱导培养基(NB 培养基,
脯氨酸 500 mg L–1、谷氨酰铵 500 mg L–1、酪蛋白水解物
300 mg L–1、蔗糖 30 g L–1、2,4-D 2 mg L–1、植物凝胶 2.6
g L–1、pH 5.8)诱导愈伤组织生长, 每 10 d继代 1次。按
照 Toki的方法[10]进行水稻的遗传转化。
1.2.3 GUS 报告基因组织化学检测 取转化处理后待
分化的愈伤组织块和新分化苗(T0 代)的幼根(切段), 在新
配置的GUS染色液中 37℃浸泡 1~2 h, 观察颜色变化情况。
1.2.4 PCR扩增和测序鉴定 提取转基因 T0代植株总
DNA, 对标记基因潮霉素抗性基因 (Hygr)用引物 Shyg
(5-AAA AAG CCT GAA CTC ACC GC-3)和 Ahyg (5-ACT
TCT ACA CAG CCA TCG GT-3)扩增; Eppc基因用引物
P1C (5-ATC CGC AGA ACC CCT CCC ACT CCT CAA
G-3)和 P2C (5-GGC GTT TCT CCT CCG ACC ACT CAG
CAT A-3)扩增。将扩增后的目的基因片段切胶并回收测序。
1.2.5 RT-PCR 检测 分别提取转基因 T0 代水稻植株
和非转基因中花 8 号(作对照)的总 RNA, 进行反转录
(Reverse Reaction) PCR扩增, 同样以 P1C和 P2C为扩增目
的基因引物, 同时以 Sactin (5-CCC TCC CAC ATG CTA
TTC T-3)和 Aactin (5-AGA GCC TCC AAT CCA GAC A-3)
为引物扩增 Actin基因作为内参。
1.2.6 Western 杂交 提取转基因 T0 代水稻植株总可
溶性蛋白, 通过 SDS-PAGE电泳分离不同大小蛋白质, 转
移至硝酸纤维素膜上依次用一抗(大豆 PEPC)和二抗(碱性
磷酸酶标记羊抗兔 IGg)进行杂交, NBT/BCIP显色。
1.2.7 叶片 PEPC活性的测定 采用分光光度计法, 反
应体系总体积 1 mL, 组分为: 100 mmol L–1 Tris-HCl (pH
8.0), 5 mmol L–1 MgCl2, 3 mmol L–1 PEP, 0.2 mmol L–1
NADH, 10 mmol L–1 NaHCO3, 10 U MDH, 以加入 20 μL
酶粗提物来启动反应, 检测 340 nm的吸光值下降的速率,
以单位质量可溶性蛋白来标定 PEPC活性。
1.2.8 气体交换参数测定 用 LI-COR-6400 型光合系
统测定, 设定光强为 1200 μmol m–2 s–1, 环境温度 30℃左
右。分别测得净 CO2同化速率(Pn)、气孔导度(Gs)、细胞
间隙 CO2浓度(Ci)、蒸腾速率(E)。叶片水分利用效率(WUE)
为同步测定的 Pn与 E的比值。
2 结果与分析
2.1 水稻转化
接种在诱导培养基上的脱颖壳消毒后的成熟种子根伸
长至 3 cm左右时, 愈伤组织块在根部形成(图 1-A); 转化后
接种在筛选培养基上的大部分愈伤组织在短时间内发生褐
化, 部分愈伤组织块约 4 周左右有新的黄色愈伤组织生成
(图 1-B); 经过抗性筛选后的愈伤组织接种至分化培养基上
光照培养 1周后产生绿色分化组织, 继续培养数周分化出绿
色小幼苗(图 1-C); 将幼苗转移到壮苗培养基上培养 2 周(图
1-D)后成为具有根茎叶的完整水稻植株。2个载体 pUbi-Eppc
和 pRbcS-Eppc分别获得转基因水稻植株 18株和 16株。
2.2 Gus基因表达的组织化学检测
分化前挑取愈伤组织块在 GUS 染色液处理后大部分
愈伤组织出现了面积大小不同的蓝色晕斑; 对所获得的
T0代 34 株水稻苗幼根进行 Gus 基因组织化学检测发现:
转入 2个载体 pUbi-Eppc和 pRbcS-Eppc的幼苗分别有 16
株和 14 株呈蓝色。表明带有目的基因的表达载体已转入
水稻, 报告基因在所检测 88.2%的中花 8号转化苗中得到
了的表达。
2.3 转基因水稻的分子鉴定
对 Gus 报告基因检测呈阳性的所有植株进一步的
PCR鉴定发现, 30株均能扩增出约 1000 bp的筛选标记基
因 Hygr的片段(图 2 为部分植株的 PCR 检测结果), 而未
转基因的对照(WT: 中花 8号)均无目的条带。
第 3期 张桂芳等: 稗草(Echinochloa crusgalli)根型 ppc基因对水稻的遗传转化及其对光合速率的调节效应 509



图 1 愈伤组织诱导、转化及培养
Fig. 1 Calli induction, transformation and cultivation
A: 成熟胚愈伤组织诱导; B: 转化愈伤组织的筛选;
C: 幼苗分化; D: 壮苗与生根。
A: calli inducement from mature embryo; B: calli transformation
and selection; C: growth of regenerated plants; D: Rooting
and seedling strengthening.

图 2 筛选标记基因 Hygr的 PCR检测
Fig. 2 PCR detection of Hyg resistance gene in transgenic rice
泳道 1~7为 pUbi-Eppc载体的转基因植株, 8~14为 pRbcS-Eppc
载体的转基因植株; M为标准 DNA长度, 依次为 300、500、1000、
1500、2000和 2500 bp, WT为未转化的品种中花 8号。
Lane 1–7: Transformants of vector pUbi-Eppc; Lane 8–14:
Transformants of vector pRbcS-Eppc; M: DNA marker, being 300,
500, 1000, 1500, 2000, 2500 bp in length; WT: untransformed
Zhonghua 8.

对导入的目的基因 Eppc的 PCR扩增发现, 30株 Gus
检测和 Hygr扩增检测呈阳性的植株多数能扩增出 Eppc基
因 0.8 kb的片段, 2个载体 pUbi-Eppc和 pRbcS-Eppc分别
有 13株和 12株呈阳性(图 3显示了载体 pRbcS-Eppc转基
因植株的 PCR 扩增结果), 对扩增条带回收后测序发现序
列与 GenBank 数据库中已登录的稗草 ppc 基因[8]序列完
全吻合。说明扩增出的片段的确为 Eppc 基因片段, 进一
步证明 Eppc基因已经整合到了水稻基因组内。

图 3 转基因水稻中 Eppc基因的 PCR扩增检测
Fig. 3 PCR detection of Eppc gene in transgenic rice
泳道 1~12为 pRbcs-Eppc转基因水稻样本扩增产物, WT为对照,
M为 DNA标准长度, 依次为 500、1000、2500、5000、7500 bp)
Lane 1–12: Transformants of vector pRbcS-Eppc; M: DNA marker,
being 500, 1000, 2500, 5000, 7500 bp in length; WT: untransformed
Zhonghua 8.

在已扩增出 Eppc 基因的转化水稻中(pRbcS-Eppc),
随机取其中 7株的 RNA样本进行 RT-PCR检测, 7株转基
因样品 Eppc基因的表达量存在差异, 且都明显比对照高,
6 号样品的扩增量相对比其他样品稍低, 但高于对照; 内
参基因 Actin的表达量在转基因样品和对照中花 8号(WT)
之间基本无差别(图 4)。

图 4 转基因水稻中 Eppc基因的 RT-PCR检测
Fig. 4 RT-PCR analysis of Eppc in transgenic rice
泳道 1~7为不同的转 pRbcS-Eppc基因水稻植株,
WT为对照中花 8号。
Lane 1–7: transformants of vector pRbcS-Eppc;
WT: untransformed Zhonghua 8.

从转入 2 个表达载体 pUbi-Eppc 和 pRbcS-Eppc 的水
稻植株中分别取 4株进行Western杂交检测, 结果如图 5。
8个转化株的 PEPC蛋白的表达量存在很大的差异。其中
2 号和 6 号样品比对照(WT, 中花 8 号)略低, 其他 6 个转
基因样品的 PEPC表达量均明显高于对照, 7号样品最高。

图 5 转基因水稻 PEPC蛋白的 Western检测
Fig. 5 Western analysis of PEPC in transgenic rice plants
泳道 1~4和 5~8分别为 pUbi-Eppc和 pRbcS-Eppc载体的转基因
植株, WT为对照中花 8号。
Lane 1–4: transformants of vector pUbi-Eppc; Lane 5–8: transfor-
mants of vector pRbcS-Eppc; WT: untransformed Zhonghua 8.

2.4 转基因水稻的 PEPC活性
测定了 25 株(Eppc PCR 检测为阳性)转基因水稻(T0
代)的 PEPC活性(表 1)。除 2株(uZH8-2和 uZH8-3)的 PEPC
活性(分别为 0.0389 和 0.0358 μmol mg–1 min–1)低于 WT
(0.0405 μmol mg–1 min–1)外, 其余 22株的 PEPC活性均高
于 WT, 其中 PEPC 活性最大的 1 株(编号: uZH8-7)为
0.2371 μmol mg–1 min–1, 达到了对照的 5.85倍。如图 6所
510 作 物 学 报 第 41卷


表 1 转 Eppc基因水稻的 PEPC活性和气体交换参数
Table 1 PEPC activity and gas exchange parameters of transgenic rice plants
植株编号
Code of plants
PEPC活性
PEPC activity
(μmol mg–1 min–1)
净光合速率
Pn (μmol m–2 s–1)
气孔导度
Gs (mol m–2 s–1)
胞间 CO2浓度
Ci (μL L–1)
蒸腾速率
E (μmol m–2 s–1)
水分利用效率
WUE
uZH8-1 0.0571 24.7 0.332 209 6.66 3.714
uZH8-2 0.0389 26.9 0.325 198 6.66 4.039
uZH8-3 0.0358 16.7 0.180 181 4.31 3.880
uZH8-4 0.0487 22.1 0.263 201 6.22 3.549
uZH8-5 0.1918 23.5 0.296 210 6.18 3.805
uZH8-6 0.1637 20.3 0.213 182 5.24 3.863
uZH8-7 0.2371 22.8 0.332 230 6.14 3.717
uZH8-8 0.0619 22.3 0.247 191 5.58 3.989
uZH8-9 0.0749 24.8 0.277 195 5.87 4.221
uZH8-10 0.0456 23.0 0.284 205 5.82 3.946
uZH8-11 0.1797 21.8 0.282 211 5.44 4.000
uZH8-12 0.0918 23.1 0.253 187 5.32 4.335
uZH8-13 0.0795 23.5 0.335 225 5.99 3.920
rZH8-1 0.0766 18.1 0.215 203 5.15 3.515
rZH8-2 0.0947 22.8 0.269 212 4.59 4.964
rZH8-3 0.1165 26.3 0.293 185 6.41 4.109
rZH8-4 0.1208 25.3 0.310 210 4.99 5.075
rZH8-5 0.0881 25.2 0.301 203 4.71 5.349
rZH8-6 0.1037 21.3 0.268 255 5.31 4.014
rZH8-7 0.0689 18.8 0.189 194 3.68 5.109
rZH8-8 0.1106 20.7 0.212 271 4.72 4.375
rZH8-9 0.0656 21.6 0.208 185 4.17 5.174
rZH8-10 0.0544 20.8 0.244 206 4.51 4.622
rZH8-11 0.0513 24.0 0.311 211 4.82 4.980
rZH8-12 0.1213 18.6 0.248 228 4.39 4.244
WT 0.0405 18.3 0.330 251 6.01 3.040
uZH8-n: pUbi-Eppc的转化苗; rZH8-n: pRbcS的转化苗; WT: 中花 8号。
uZH8–n: transformants of vector pUbi-Eppc; rZH8-n: transformants of vector pRbcS-Eppc; WT: untransformed Zhonghua 8.

示的转 ppc基因水稻叶片的 PEPC相对活性, 2种启动子中
以Ubiquitin启动子启动的 ppc基因表达效率更高, 相当一
部分转化株的 PEPC活性比对照提高 4倍以上, 而Rubisco
小亚基启动子提高的活性不超过 3倍。
2.5 转基因水稻的气体交换参数
25株 T0代转基因水稻植株的气体交换参数 Pn、Gs、
Ci及 E都存在差别(表 1); 其中 4株的 Pn与对照的差异小
于 10%, 绝大多数植株(共计 15 株)的 Pn 都比对照提高
20%以上。说明 PEPC活性的增加确实提高了水稻的 Pn。
分析 T0代光合速率的增加幅度与 PEPC 活性增加程
度并没有显著的相关性(图 7)。由 Pn/E 计算得到的 WUE
在所有 T0代转基因植株中都得到了不同程度的增加。
经过逐代选育 , 测定了 10 株 T6 代转基因水稻的
PEPC 活性(表 2), 发现 10 株的 PEPC 活性均高于 WT,
PEPC 活性最大的 1 株达到了对照的 6.676 倍。相应编号
T6代花后 20 d植株的气体交换参数测定结果见表 2, 10株
中只有 1株(rZH8-12)的 Pn低于对照, 其他 9株的 Pn均高
于对照, 其中 Pn最高的植株 rZH8-4 (17.9 μmol m–2 s–1)比
对照提高了 38.76%左右, 此结果证明转稗草根型 ppc 基
因水稻在高代仍保持较高的光合速率。
3 讨论
植物的 PEPC由多基因家族编码。植物的不同组织如
根、茎、叶、果实、种子等器官[11-13]都存在着不同类型的
PEPC 同工酶, 并通过组织特异性表达调节着细胞的各种
生理过程。C4光合型 ppc基因主要在叶肉细胞中表达, 受
光照的调控[14], 在光合组织中主要执行原初 CO2 固定的
功能; 而非光合类型同工酶还具有为硝酸盐同化后的合成
氨基酸提供碳骨架、维持细胞质 pH 和离子渗透平衡、参
与种子形成与萌发、果实发育过程中物质代谢、调节气孔
第 3期 张桂芳等: 稗草(Echinochloa crusgalli)根型 ppc基因对水稻的遗传转化及其对光合速率的调节效应 511



图 6 转稗草 ppc基因植株的 PEPC相对活性
Fig. 6 Relative PEPC activity improved by transgenic of Eppc in the control of different promoters
uZH8–n: pUbi-Eppc的转化苗; rZH8-n: pRbcS-Eppc的转化苗; WT: 中花 8号。
uZH8–n: transformants of vector pUbi-Eppc; rZH8-n: transformants of vector pRbcS-Eppc; WT: untransformed Zhonghua 8.

表 2 转 Eppc基因水稻的 PEPC活性及气体交换参数(T6代)
Table 2 PEPC activity and Gas exchange parameters of transgenic rice plants (T6 generation)
植株编号
Code of plants
PEPC活性 PEPC activity
(μmol mg–1 min–1)
净光合速率
Pn (μmol m–2 s–1)
气孔导度
Gs (mol m–2 s–1)
胞间 CO2浓度
Ci (μL L–1)
蒸腾速率
E (μmol m–2 s–1)
水分利用效率
WUE
WT 0.03150.0075 12.91.0 0.2430.054 28415 5.841.00 2.250.31
uZH8-7 0.21030.0125 15.11.7* 0.2830.030 28410 6.550.50 2.310.20
uZH8-10 0.04250.0102 16.02.5* 0.3250.060 2888 6.960.96 2.300.18
uZH8-11 0.15790.0167 16.61.5** 0.3130.048 28010 7.430.93 2.250.23
uZH8-12 0.10180.0124 15.10.7** 0.2760.037 27916 6.540.67 2.320.30
uZH8-13 0.06850.0112 13.71.5ns 0.2670.045 2885 6.110.74 2.250.11
rZH8-3 0.10760.0127 17.22.1* 0.3100.053 2798 7.050.84 2.440.15
rZH8-4 0.13010.0153 17.92.2* 0.3060.040 2738 6.670.58 2.680.18
rZH8-7 0.06050.0088 14.41.6* 0.3510.042 30212 7.580.71 1.920.25
rZH8-11 0.05360.0069 15.11.7* 0.2650.016 27711 5.770.33 2.620.28
rZH8-12 0.11950.0135 11.11.5ns 0.2170.027 2907 5.140.49 2.150.15
uZH8-n: pUbi-Eppc的转化苗; rZH8-n: pRbcS的转化苗; WT: 中花 8号; *P<0.05, **P<0.01, ns: 无差异。
uZH8–n: transformants of vector pUbi-Eppc; rZH8-n: transformants of vector pRbcS-Eppc; WT: untransformed Zhonghua 8; *P<0.05,
**P<0.01, ns: no significant difference.
512 作 物 学 报 第 41卷



图 7 PEPC活性与净光合速率的关系
Fig. 7 Relationship of PEPC activities and Pn
缩写同图 6。
Abbreviations as the same as those given in Table 6.

运动、为根瘤共生固氮过程提供碳骨架等多种功能[7,15-19]。
由于栽培作物玉米和谷子的C4光合型ppc基因导入水
稻后 , 能使转基因水稻的光合效率不同程度地改善 [1-6],
而稗草是稻田中最常见的C4型野生植物, 与玉米、谷子等
栽培作物相比, 其更能适应水、旱2种生存环境条件, 具有
更强的生长优势, 因此, 本研究选定稗草PEPC基因对水
稻进行转化。根型PEPC同工酶主要在根组织表达, 根型
PEPC同工酶活性的增加可提高氨的同化能力[8]。本研究
将稗草根型ppc基因分别由强组成型表达的启动子pUbi和
受强光调控在叶组织特异性表达的启动子pRbcS调控下 ,
在转基因水稻叶组织中的表达研究发现: T0代92%的转基
因水稻Pn高于对照 , 比对照提高30%以上的植株占28%;
通过逐代选育, 到T6代检测的大部分植株Pn仍高于对照,
Pn最高的植株比对照提高了38.76%左右, PEPC活性也保
持高于对照。表明转稗草根型ppc基因水稻在高代大多数
植株仍能保持高的光合速率 , 此结果也证明C4植物根型
PEPC与叶组织表达的C4型PEPC一样可以对C3植物光合
作用具有调节作用。国内学者凌丽俐等利用从美国华盛顿
州立大学引进的转C4光合酶基因的水稻, 经过世代繁殖、
检测、选择, 得到第8代稳定的种质, 其PEPC活性经测定
与第6代种质的PEPC活性相近, 他们的结果也说明PEPC
基因可以稳定遗传并高表达[20]。可见在改善C3作物光合
作用方面, 与转PPDK、NADP-ME等酶基因水稻植株的光
合特性相比, PEPC起到了很关键的作用 [21], 而转PEPC+
PPDK双基因水稻植株也未表现比转PEPC基因 [22-23]水稻
植株有明显的光合优势[24-25]。我们转入水稻的是稗草根型
PEPC基因, 我们将继续关注根型PEPC对水稻光合生理特
性的改善以及在其他代谢方面的调控功能。
由气体交换参数计算得到的WUE可以反映叶片的生
理抗旱能力。本研究获得的 25株 T0代转基因水稻的WUE
均高于对照。在玉米中导入高粱 C4型 ppc基因的研究也证
实 WUE和抗旱能力得到了提高[26]。我们前面的研究也已
发现导入玉米和谷子 C4型 ppc 基因的水稻抗旱能力得到
了增强[6,27-29]。本研究导入了 C4 植物的根型(非光合型)
ppc 基因, 同样也可能提高水稻的抗旱能力, 由表 1 数据
可知, Pn高于对照的转基因水稻中, 78.3%植株的 E反而低
于对照, 因而提高了WUE, 推断稗草根型 PEPC同时也可
能调节转基因水稻的羧化能力与气孔运动。但转基因植株
的叶面积、绿叶面积的持续期及植株的干重等方面与对照
没有明显差异。
转基因水稻的 PEPC 活性增加的同时的确也提高了
水稻的 Pn, 但分析结果显示 Pn增加的幅度与 PEPC 活性
增加的程度并没有显著的相关性, 表明 PEPC活性的提高
被限制在一定水平内可同时提高 Pn, PEPC活性的过高或
过低反而对 Pn 的增加或降低影响不明显, 可能是与细胞
质内苹果酸的代谢和运转[30]以及苹果酸对 PEPC 的反馈
调节作用有关[31]。
References
[1] Ku M S B, Agarie S, Nomura M, Fukayama H, Tsuchida H, Ono K,
Hirose S, Toki S, Miyao M, Matsuoka M. High-level expression of
maize phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic rice plants.
Nat Biotechnol, 1999, 17: 76–80
[2] Fukayama H, Imanari E, Tsuchida H, Izui K, Matsuoka M. In vivo
activity of maize phosphoenolpyruvate carboxylase in transgenic
rice plants. Plant Cell Physiol, 2000, 41: S112
[3] Matsuoka M, Fukayama H, Tsuchida H, Nomura M, Agari S, Ku M
S B, Miyao M. How to express some C4 photosynthesis genes at
high levels in rice. In: Sheehy J E, Mitchell P L, Hardy B, eds. Re-
designing Rice Photosynthesis to Increase Yield. Proceedings of the
Workshop on the Quest to Reduce Hunger: Redesigning Rice Pho-
tosynthesis, 30 November to 3 December 1999, Los Banos, Philip-
pines. International Rice Research Institute and Amsterdam: El-
sevier Science BV, 2000. pp 167–175
[4] Agarie S, Miura A, Sumikura R, Tsukamoto S, Nose A, Arima S,
Matsuoka M, Miyao-Tokutomi M. Overexpression of C4 PEPC
caused O2-insensitive photosynthesis in transgenic rice plant. Plant
Sci, 2002, 162: 257–265
[5] Fukayama H, Hatch M D, Tamai T, Tsuchida H, Sudoh S, Furbank
R T, Miyao M. Activity regulation and physiological impacts of
maize C4-specific phosphoenolpyruvate carboxylase overproduced
in transgenic rice plants. Photosynth Res, 2003, 77: 227–239
[6] Ding Z S, Huang S H, Zhou B Y, Sun X F, Zhao M.
Over-expression of phosphoenolpyruvate carboxylase cDNA from
C4 millet (Seteria italica) increase rice photosynthesis and yield
under upland condition but not in wetland fields. Plant Biotechnol
Rep, 2013, 7: 155–163
[7] O’Leary B, Park J, Plaxton W C. The remarkable diversity of plant
PEPC (phosphoenolpyruvate carboxylase): recent insights into the
physiological functions and post-translational controls of
non-photosynthetic PEPCs. Biochem J, 2011, 436: 15–34
[8] Setién I, Vega-Mas I, Celestino N, Calleja-Cervantes M E,
González-Murua C, Estavillo J M, González-Moro M B. Root
phosphoenolpyruvate carboxylase and NAD-malic enzymes active-
ty increase the ammonium-assimilating capacity in tomato. J Plant
Physiol, 2014, 171: 49–63
第 3期 张桂芳等: 稗草(Echinochloa crusgalli)根型 ppc基因对水稻的遗传转化及其对光合速率的调节效应 513


[9] 张桂芳, 赵明, 丁在松, 张丽, 肖俊涛. 稗草磷酸烯醇式丙酮酸
羧化酶(PEPCase)基因的克隆与分析 . 作物学报 , 2005, 31:
1365–1369
Zhang G F, Zhao M, Ding Z S, Zhang L, Xiao J T. Cloning and
characterization of phosphoenolpyruvate carboxylase gene from
Echinochloa crusgalli. Acta Agron Sin, 2005, 31: 1365–1369 (in
Chinese with English abstract)
[10] Toki S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation
in rice. Plant Mol Biol Rep, 1997, 15: 16–21
[11] Kawamura T, Shigesada K, Yanagisawa S, Izui K. Phosphoenolpy-
ruvate carboxylase prevalent in maize roots: Isolation of cDNA
clone and its use for analysis of the gene and the gene expression. J
Biochem (Tokyo), 1990, 107: 165–168
[12] Kawamura T, Shigesada K, Toh H, Okumura S, Yanagisawa S, Izui
K. Molecular evolution of phosphoenolpyruvate carboxylase for C4
photosynthesis in maize: comparison of its cDNA sequence with a
newly isolated cDNA encoding an isozyme involved in the anaple-
rotic function. J Biochem (Tokyo), 1992, 112: 147–154
[13] Hudspeth R L, Grula J W. Structure and expression of the maize
gene encoding the phosphoenolpyruvte carboxylse isozyme in-
volved in C4 photosynthesis. Plant Mol Biol, 1989, 12: 579–589
[14] Westhoff P, Svensson P, Ernst K, Blasing O, Bruscheidt J, Stock-
haus J, von Caemmerer S, Furvank R T. Molecular evolution of C4
phosphoenolphyruvate carboxylase in the genus Flaveria. Aust J
Plant Physiol, 1997, 24: 429–436
[15] Gowik U, Westhoff P. C4-phosphoenolpyruvate carboxylase. In:
Raghavendra A S, Sage R F. C4 Photosynthesis and Related CO2
Concentrating Mechanisms. Advances in Photosynthesis and Res-
piration. Dordrecht: Springer, 2011, 32: 257−275
[16] Guillet C, Just D, Bénard N, Destrac-Irvine A, Baldet P, Hernould
M, Causse M, Raymond P, Rothan C. A fruit-specific phosphoe-
nolpyruvate carboxylase is related to rapid growth of tomato fruit.
Planta, 2002, 214: 717−726
[17] Rolletschek H, Borisjuk L, Radchuk R, Miranda M, Heim U, Wo-
bus U, Weber H. Seed-specific expression of a bacterial phosphoe-
nolpyruvate carboxylase in Vicia narbonensis increases protein
content and improves carbon economy. Plant Biotech J, 2004, 2:
211−219
[18] 张占琴, 王金梅, 王学军, 汪凯华, 袁春新, 麻浩. 油菜籽粒发
育过程中 PEPCase 活性与油脂、蛋白及亚基积累的特点. 中国
油料作物学报, 2009, 31: 14–18
Zhang Z Q, Wang J M, Wang X J, Wang K H, Yuan C X, Ma H.
The characteristics of PEPCase activity and accumulation of oil,
protein and major protein subunits during seed development of rape
(Brassica napus). Chin J Oil Crop Sci, 2009, 31: 14–18 (in Chinese
with English abstract)
[19] Pan L J, Yang Q L, Chi X Y, Chen M N, Yang Z, Chen N, Wang T,
Wang M, He Y N, Yu S L. Functional analysis of the phosphoe-
nolpyruvate carboxylase on the lipid accumulation of peanut (Ara-
chis hypogaea L.) seeds. J Integr Agric, 2013, 12: 36–44
[20] 凌丽俐, 林宏辉, 焦德茂. 转 PEPC基因水稻种质的稳定光合生
理特性. 作物学报, 2006, 32: 527–531
Ling L L, Lin H H, Jiao D M. The stable photosynthetic character-
istics of a PEPC transgenic rice germplasm. Acta Agron Sin, 2006,
32: 527–531 (in Chinese with English abstract)
[21] Jiao D M, Huang X Q, Li X. Characteristics of carbon assimilation
and tolerance to photooxidation in transgenic rice expressing C4
photosynthesis enzymes. In: PS2001 Proceedings, 12th Interna-
tional Congress on Photosynthesis. Brisbane: CSIRO Publishing,
2001, S33-004, 1–6
[22] 焦德茂, 李霞, 黄雪清, 迟伟, 匡廷云, 古森本. 转PEPC基因水
稻的光合 CO2 同化和叶绿素荧光特性. 科学通报, 2001, 46:
414–418
Jiao D M, Li X, Huang X Q, Chi W, Kuang T Y, Gu S B. The char-
acteristics of CO2 assimilation of photosynthesis and chlorophyll
fluorescence in transgenic PEPC rice. Chin Sci Bull, 2001, 46:
414–418
[23] 焦德茂, 匡廷云, 李霞, 戈巧英, 黄雪清, 郝乃斌, 白克智. 转
PEPC 基因水稻具有初级 CO2浓缩机制的生理特点. 中国科学,
2003, 33: 33–39
Jiao D M, Kuang T Y, Li X, Ge Q Y, Huang X Q, Hao N W, Bai K
Z. Physiological characteristics of the primitive CO2 concentrating
mechanism in PEPC transgenic rice. Sci China, 2003, 33: 33–39
[24] Huang X Q, Jiao D M, Chi W, Ku M S B. Characteristics of CO2
exchange and chlorophyll fluorescence of transgenic rice with C4
genes. Acta Bot Sin, 2002, 44(4): 405–412
[25] 张边江, 华春, 周峰, 周泉澄, 陈全战, 王荣富, 焦德茂. 转
PEPC+PPDK双基因水稻的光合特性. 中国农业科学, 2008, 41:
3008–3014 (in Chinese with English abstract)
Zhang B J, Hua C, Zhou F, Zhou Q C, Chen Q Z,Wang R F, Jiao D
M. Photosynthetic characteristics of transgenic rice with
PEPC+PPDK gene. Sci Agric Sin, 2008, 41: 3008–3014 (in Chi-
nese with English abstract)
[26] Jeanneau M, Gerentes D, Foueillassar X, Zivy M, Vidal J, Toppan
A, Perez P. Improvement of drought tolerance in maize: towards the
functional validation of the Zm-Asr1 gene and increase of water use
efficiency by over-expressing C4-PEPC. Biochimie, 2002, 84:
1127–1135
[27] 丁在松, 赵明, 荆玉祥, 李良璧, 匡廷云. 玉米 ppc 基因过表达
对转基因水稻光合速率的影响. 作物学报, 2007, 33: 717–722
Ding Z S, Zhao M, Jing Y X, Li L B, Kuang T Y. Effect of overex-
pression of maize ppc gene on photosynthesis in transgenic rice
plants. Acta Agron Sin, 2007, 33: 717 – 722 (in Chinese with Eng-
lish abstract)
[28] 方立锋, 丁在松, 赵明. 转 ppc 基因水稻苗期抗旱特性研究. 作
物学报, 2008, 34: 1220−1226
Fang L F, Ding Z S, Zhao M. Characteristics of drought tolerance in
ppc overexpressed rice seedlings. Acta Agron Sin, 2008, 34:
1220−1226 (in Chinese with English abstract)
[29] 周宝元, 丁在松, 赵明. PEPC 过表达可以减轻干旱胁迫对水稻
光合的抑制作用. 作物学报, 2011, 37: 112–118
Zhou B Y, Ding Z S, Zhao M. Alleviation of drought stress inhibi-
tion on photosynthesis by overexpression of PEPC gene in rice.
Acta Agron Sin, 2011, 37: 112–118 (in Chinese with English ab-
stract)
[30] Scheibe R. Malate valves to balance cellular energy supply.
Physiol Plant, 2004, 120: 21–26
[31] Andreo C S, Gonzalez D H, Iglesias A A. Higher plant
phosphoenolpyruvate carboxylase: structure and regulation.
FEBS Lett, 1987, 213: 1–8