全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(2): 224−231 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET-04-0740)
作者简介: 曹景林(1967−), 男, 在读博士研究生, 遗传育种专业。
* 通讯作者(Corresponding author): 张献龙, 男, 教授, 博士生导师。E-mail: xlzhang@mail.hzau.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-07-16; Accepted(接受日期): 2007-09-20.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00224
棉花高效体细胞胚发生及同步控制培养体系研究
曹景林 张献龙* 金双侠 杨细燕 朱华国 付莉莉
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 湖北武汉 430070)
摘 要: 棉花体细胞胚胎发生的频率低, 且体细胞胚的发育存在着不同步性, 给体细胞胚胎发生发育过程的生理学、
生物化学和分子生物学的研究带来许多困难。本研究以陆地棉品种 Coker201为材料, 建立了一种简单有效的棉花体
细胞胚高频率发生和同步发育的培养体系。经过多次继代获得的胚性愈伤, 首先在液体培养基中振荡培养 2 d使其分
散, 然后过 30目筛去除大的颗粒, 重新悬浮于同样的液体培养基中。悬浮培养 14 d后, 过 50目筛, 将筛上的胚性愈
伤重悬浮于新鲜的培养基中, 并用吸管吸取悬浮液, 将其均匀地接种在表面垫有滤纸的同成分固体培养基(附加 2.46
μmol L−1 IBA和 0.70 μmol L−1 kinetin)上。培养 21 d后, 用垫有滤纸的相同的固体培养基继代培养。利用这种培养体
系, 获得的体细胞胚数量分别是单纯悬浮培养和固体培养(不垫滤纸)的 16.5倍和 4.0倍。其中, 球形胚、鱼雷形胚和
子叶胚的同步发生率分别为 70.2%、52.3%和 73.0%。
关键词: 棉花; 体细胞胚胎发生; 同步控制; 培养体系
An Efficient Culture System for Synchronization Control of Somatic
Embryogenesis in Cotton (Gossypium hirsutum L.)
CAO Jing-Lin, ZHANG Xian-Long*, JIN Shuang-Xia, YANG Xi-Yan, ZHU Hua-Guo, and FU Li-Li
(National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China)
Abstract: Low efficiency of somatic embryogenesis and asynchronous embryo development brings a lot of difficulties to the
physiological, biochemical, and molecular biological studies of embryogenesis processes in cotton. In the present study, a simple
and efficient method was developed to improve somatic embryogenesis frequency and synchronous development of mass somatic
embryos from cultured cells of Gossypium hirsutum cv. Coker 201. The embryonic calli obtained after several rounds of subcul-
ture were scattered in liquid medium by shaking for 2 d and then resuspended in the same liquid medium after discarding the lar-
ger callus aggregates over 30 mesh-size-sieve. The suspensions cultured for 14 d were filtered through 50 mesh-size-sieve and
then the aggregates over the sieve were inoculated onto the surface of Whatman filter paper placed on the solid medium contain-
ing 2.46 μmol L−1 IBA and 0.70 μmol L−1 kinetin to culture for 21 d followed by subculturing. The somatic embryo amount ob-
tained by using new system was 15.5-fold higher than that by suspension culture and 3-fold higher than that by solid culture
(without filter papers) at the same culture period, and in the different stages of somatic embryo development, 70.2% for globular,
52.3% for torpedo-shaped and 73.0% for cotyledonary embryos were obtained respectively during the culture. Suspension culture
combined with solid culture with filter paper were considered to be beneficial for synchrony of somatic embryogenesis and mass
embryo development.
Keywords: Cotton; Somatic embryogenesis; Synchronization control; Culture system
高等植物的体细胞胚发生过程在形态学水平和
分子水平上都非常类似于合子胚发生过程, 它是细
胞全能性的重要体现。自从Steward等 [1]和Reinert[2]
分别独立报道从胡萝卜(Daucus carom L.)愈伤细胞
中获得体细胞胚以来, 体细胞胚胎发生被认为是植
物材料离体繁殖的有效方式, 并为研究胚胎发生机
制和分离胚胎发育相关特异蛋白、基因等提供了一
个良好的替代体系。然而, 在组织培养过程中, 植物
第 2期 曹景林等: 棉花高效体细胞胚发生及同步控制培养体系研究 225


体细胞胚胎发生的频率往往较低, 特别是从胚性愈
伤组织中诱导体细胞胚时, 不同发育阶段的体细胞
胚常常高度共存。这给体细胞胚胎发生的生理学、
生物化学和分子生物学的研究带来许多困难。因此,
为了获得同一发育阶段的体细胞胚, 采用了一定大
小的玻璃柱结合离心[3]、差示沉降结合不同孔径筛
子筛选[4]、植物胚性细胞团分选仪分选[5]、不同孔径
大小筛盘过滤[6]、对各种悬浮培养物低温处理并结
合过筛[7]等方法。但是, 这些方法都不适合体细胞胚
发育早期、极早期的同步化调控, 而且在较迟的阶
段, 难以单独分离直径相似的不同发育阶段的胚。
其中, 低温处理法还会改变胚胎发育中的代谢。这
些方法均有一定局限性。近年来, 利用悬浮培养使
初始细胞群体均一, 使胚胎发生同步进行的方法得
到了发展。Nadel等[8]和Torres等[9]采用脱落酸(ABA)
预处理法来调控体细胞胚同步发生。Hutchinson和
Saxena[10]采用乙酰水杨酸(ASA)处理与噻苯隆(TDZ)
处理相结合的方法来促进体细胞胚的同步发育。
Kumar和Tuli[11]采用肌醇饥饿法来调节体细胞胚的
同步发生。但是, 这些方法能够影响胚性培养物的
生理状态, 改变体细胞胚胎发生和胚胎发育过程中
的代谢, 因此, 不利于直接获得体细胞胚胎发育机
制的真实信息, 可能会给有关研究的结果分析带来
困难。此外, Osuga等[12]和Tonon等[13]使用Ficoll不连
续密度梯度离心结合过筛法获得初始胚性细胞或细
胞团, 进而实现体细胞胚胎发生的同步化。遗憾的
是, 这种方法不仅增加了劳动强度, 而且反复过滤
和离心增大了污染的风险。
开展棉花体细胞胚胎发生的研究工作, 对于拓
宽棉花种质资源和培育棉花品种具有重要意义[14]。
目前, 关于棉花体细胞胚胎发生过程的生理、生化
和分子方面的信息仍是十分有限的。为了进一步了
解棉花体细胞胚胎发生的机理, 进而充分利用体细
胞胚胎发生, 因此有必要建立一个高频率的同步的
体细胞胚胎发生培养体系。自从 Davidonis 和
Hamilton[15]报道通过体细胞胚胎发生获得陆地棉品
种Coker 310再生植株以来, 已经有多种培养体系产
生[16-34]。虽然棉花体细胞胚胎发生和再生技术得到
了明显改进, 但仍存在着胚胎发生频率和胚胎发育
同步性相对较低的问题。最近, Kumar和 Tuli[11]报道
了陆地棉品种 Coker 312 胚胎发生的同步调控培养
体系, 但该体系依赖于悬浮培养中一个周期的肌醇
饥饿, 很容易改变胚胎发生和发育中的代谢状况,不
利于直接获得体细胞胚胎发育机制的真实信息。因
此, 本实验室在已建立的棉花体细胞培养体系[34-35]
基础上, 进一步对棉花胚性愈伤组织体细胞胚的发
生及同步控制进行了研究。建立的棉花体细胞胚胎
发生及同步控制的培养体系可望有助于生理生化和
分子水平上的棉花体细胞胚胎发生机制研究。
1 材料与方法
1.1 供试材料
陆地棉品种 Coker201, 由本实验室保存, 每年
在华中农业大学的试验地种植, 经自交保纯后收获
种子用作试验材料。
1.2 棉花愈伤组织的诱导和继代培养
种子经硫酸脱绒后剥去棉籽壳, 浸泡于 0.1%升
汞溶液 10 min, 再用无菌水冲洗 4 次, 然后种植在
MS0培养基上, 于(28±1)℃下暗培养 7 d左右, 获无
菌苗。取无菌苗下胚轴切成 0.5 cm左右的小段, 平
放于 MS1培养基上。35 d左右将愈伤组织转入 MS2
培养基, 每 28 d 继代一次, 直至愈伤组织发生胚分
化。把胚性愈伤组织转入 MS3培养基, 完成体细胞
胚的发生和成熟。选择小米粒状米黄色愈伤组织 ,
每 28 d继代一次。
组织培养各阶段所用培养基如表 1。所有的激
素和氨基酸在灭菌前加入, 并用 1 mol L−1 NaOH调
节 pH值, 高温高压灭菌 15 min。
除无菌苗培养外 , 所有培养物均于 (28±2) , ℃
光照强度(冷光源)135 μmol m−2 s−1, 每天光照 14 h
表 1 棉花组织培养所用培养基
Table 1 Media used during cell culture in cotton
培养基
Medium
基本成分
Basic component
pH值
pH value
MS0 1/2MS[36]大量元素 + 1.5% (W/V) glucose + 0.25% (W/V) Phytagel 6.0
MS1

MS无机盐 + B5有机物[37] + 0.45 μmol L−1 2,4-D + 0.46 μmol L−1 KT + 0.1% (W/V) MgCl2·6H2O + 3% (W/V)
glucose +0.25% (W/V) Phytagel
5.8

MS2

MS无机盐(KNO3加倍) + B5有机物 + 0.23 μmol L−1 2,4-D + 0.46 μmol L−1 KT + 0.1% (W/V) MgCl2·6H2O +
3% (W/V) glucose +0.25% (W/V) Phytagel
5.8

MS3

MS无机盐(KNO3加倍, 去掉 NH4NO3) + B5有机物 + 2.46 μmol L−1 IBA + 0.70 μmol L−1 KT +0.1% (W/V) Glu
+0.1% (W/V) Asn + 3% (W/V)glucose +0.25% (W/V) Phytagel
5.9

226 作 物 学 报 第 34卷

的条件下进行培养。
1.3 棉花体细胞胚胎发生培养基的优化
以 MS3培养基为基础, 设计了 6种培养基, M1
为 MS3+0.1% (W/V) KCl; M2 为 MS3+1.5% (W/V)
glucose; M3 为 MS3+0.02 % (W/V) CaCl2; M4 为
MS3+0.1% (W/V) KCl+1.5% (W/V) glucose; M5 为
MS3+0.1% (W/V) KCl+0.02 % (W/V) CaCl2; M6为
MS3+0.02 % (W/V) CaCl2+1.5% (W/V) glucose。将在
MS3 培养基上连续继代 5 次的胚性愈伤组织分别转
入这 6种培养基, 以 MS3培养基为对照。每种培养
基 5次重复, 每重复继代一瓶(每瓶继代 200 mg ± 10
mg胚性愈伤组织)。继代培养至 28 d时考察各培养
基单位重量(g)胚性培养物中各类型体细胞胚的数量,
其中统计球形胚和心形胚借助 Leica MZ FLⅢ体视显
微镜。采用新复极差测验法(LSR法)分析所得数据。
1.4 棉花体细胞胚胎发育的同步化控制
将在MS3培养基上连续继代 6次的胚性愈伤组
织转入以 MS3 为基础的优化培养基(不含激素)悬浮
培养。首先选取生长稳健、状态疏松的小米粒状米
黄色胚性愈伤组织约 2 g转入盛有 40 mL优化培养
基的 100 mL锥形瓶中, 温度(28±2)℃、120 r min−1
振荡培养 2 d, 以获得分散的细胞培养物, 然后过 30
目筛。滤液更换新鲜培养基后, 继续在温度(28±2)℃
下, 120 r min−1振荡避光培养。每周更换悬浮培养液
1 次。培养 14 d 后, 过 50 目筛, 收集筛上部分, 重
新悬浮于新鲜优化培养基中, 用一个长而尖嘴的吸
管吸取含愈伤组织的悬浮液均匀喷布在垫衬于固体
优化培养基表面的滤纸(Whatman/Grade 1, 直径 7
cm)上。每瓶悬浮培养物仅取部分继代 1培养皿, 共
继代 30 培养皿。继代后用封口膜密封 , 然后于
(28±2)℃、光照强度(冷光源)135 μmol m−2 s−1、每天
光照 14 h的条件下进行培养。培养 21 d后, 一半培
养皿中的体细胞胚仍继续在原培养基上培养, 以观
察胚状体后来的发育状况, 并分别于培养的 14、21、
28、35 d随机取 3培养皿考察单位重量(g)胚性物中
各类型体细胞胚的数量。其余培养皿中的球形胚被
转入新的垫有滤纸的固体优化培养基上继代培养 ,
并在继代培养的 14 d和 21 d随机取 3培养皿统计整
个培养皿内各类型体细胞胚的数量。在用上述培养
方式进行培养的同时, 采用优化培养基, 将在 MS3
培养基上同样连续继代 6 次的胚性愈伤组织分别只
进行悬浮培养(先过 30 目筛去除大颗粒后再悬浮)和
固相培养基(不衬垫滤纸)培养, 并于 28 d 时考察单
位重量(g)胚性培养物中各类型体细胞胚的数量(悬
浮培养愈伤组织先用滤纸吸水后再称重), 以比较不
同培养方式的效果。
2 结果与分析
2.1 陆地棉品种 Coker201 胚性培养物在连续继
代培养过程中的表现
将陆地棉品种Coker201无菌苗的下胚轴平放于
MS1 培养基中诱导愈伤组织, 一般 5 d 左右下胚轴
两端即开始膨大, 10 d左右就可见愈伤组织。愈伤组
织出现后 35 d左右将愈伤组织转入MS2培养基, 并
每 28 d继代一次, 一般继代 2次后就可见到胚性愈
伤组织出现。将胚性愈伤组织转入 MS3培养基中培
养, 并选择小米粒状米黄色愈伤组织每 28 d继代培
养一次。在初始的几次继代培养中, 愈伤组织分化
胚的能力较强, 鱼雷形胚和子叶胚出现的时间较早,
各类型体细胞胚高度共存, 甚至很快出现小苗, 胚
状体的形态相对较大 , 但呈现出明显的不同步性 ;
随着培养时间的延长和继代次数的增加, 体细胞胚
的发生能力降低, 且发生的胚状体也相对变小, 大
多数体细胞胚停留在球形胚阶段。
2.2 棉花体细胞胚胎发生培养基的优化
在以前的文章中, 我们已经描述了 MS3培养基
对棉花体细胞胚胎发生的诱导效应[34]。正如本研究
中的结果一样, 虽然采用MS3培养基每 28 d继代一
次能够实现体细胞胚胎的完全发育, 但体细胞胚胎
发生的频率往往较低 , 而且随着继代次数的增加 ,
大多数体细胞胚停留在球形胚阶段。为了改善体细
胞胚的发育和成熟, 根据以前的研究[14,32]和别的报
道[38-39], 我们以 MS3 培养基为基础, 设计了 6 种培
养基。试验结果(表 2)表明, 在供试的几种培养基中,
球形胚、鱼雷形胚和子叶胚数都存在显著的差异
(P<0.05), 而心形胚和总胚数没有显著差异, 这说明
在 MS3培养基中单独或复合添加 0.1% KCl, 0.02%
CaCl2 和 1.5% glucose 对于总胚数的诱导能力与
MS3 培养基相似, 但对于诱导球形胚向鱼雷形胚和
子叶胚阶段发育的能力不同。进一步的分析表明 ,
在这些培养基中, 培养基 M1 的鱼雷形胚和子叶胚
数最多, 而球形胚数最少, 且培养基 M1 和 MS3 在
球形胚、鱼雷形胚和子叶胚数量上表现出明显的差
异, 而培养基 M2、M3、M4、M5 和 M6 与培养基
MS3 间在球形胚、鱼雷形胚和子叶胚数上没有明显
的差异。这说明, 在 MS3 继代培养基中单独添加
0.1% KCl能在一定程度上促进陆地棉品种Coker201
连续继代多次的胚性愈伤组织中球形胚向鱼雷形胚
第 2期 曹景林等: 棉花高效体细胞胚发生及同步控制培养体系研究 227


表 2 不同培养基对陆地棉品种 Coker201体细胞胚发生的效应
Table 2 Effects of different media on somatic embryogenesis in Coker201 (No. of embryos g−1 callus)
培养基
Medium
总胚数
No. of total embryos
球形胚数
No. of globular em-
bryoids
心形胚数
No. of heart-shaped
embryoids
鱼雷形胚数
No. of torpedo-shaped
embryoids
子叶胚数
No. of cotyledonary
embryoids
MS3 56.6±5.7271 a 37.0±7.1414 a 3.4±1.1402 a 7.8±2.2804 b 8.4±2.5100 b
M1 58.4±4.9295 a 25.8±4.7117 b 3.2±0.8367 a 14.4±4.1593 a 15.0±4.7958 a
M2 58.0±4.3012 a 31.8±6.5345 ab 3.4±1.8166 a 11.2±3.4928 ab 11.6±2.7928 ab
M3 57.2±4.0866 a 35.0±7.4027 a 3.6±1.5166 a 10.4±2.9665 ab 8.2±2.0736 b
M4 61.0±5.0497 a 34.4±6.5038 a 3.2±1.0954 a 12.4±4.3359 ab 11.0±2.2361 ab
M5 55.6±4.2778 a 30.2±6.4576 ab 3.4±1.1402 a 11.8±3.9623 ab 10.2±1.9235 b
M6 56.0±4.6904 a 33.6±6.1074 ab 3.0±1.0000 a 10.6±3.6469 ab 8.8±1.9235 b
每列数据后面标注有相同字母表示根据 LSR值差异不显著, P<0.05。每处理 5次重复, 每重复一瓶。
Means followed by the same letter within a column are not significantly different from each other at P<0.05 according to LSD test.
There were 5 replicates for each treatment and one flask per replicate in the experiment.

和子叶胚阶段的发育, 显著改善大多数体细胞胚停
留在球形胚阶段的状况,表明培养基 M1 比其他几种
培养基更适合于体细胞胚的发育。这可能与棉花是
一种需钾作物有关。此外, 在 MS3 继代培养基中单
独添加 1.5% glucose也有一定效果, 但不显著。单独
添加 0.02% CaCl2 没有观察到明显的作用。而当在
MS3 继代培养基中同时增加这 3 种物质的 2 种时,
球形胚向鱼雷形胚和子叶胚阶段的发育也没有表现
出累加效应, 相互之间也没有明显的效果差异。我
们还尝试了在 MS3 培养基中补加 0.05% GLn(谷氨
酰胺)和 0.05% ASn(天门冬酰胺), 其效果也不明显,
但当在 MS3 培养基中去除 GLn 和 ASn 时, 则胚性
物出现严重褐化, 生长缓慢, 体细胞胚胎的发生和
成熟受到一定的抑制。根据这些实验结果, 我们确
定了体细胞胚发生和成熟的优化培养基为 M1 培养
基, 即 MS3+0.1% KCl。
2.3 陆地棉品种 Coker201 体细胞胚胎发生和成
熟的不同培养方式的比较
诱导棉花体细胞胚胎发生和成熟通常采用固体
培养方式, 然而在我们的试验体系中, 采用固体培
养方式尽管通过改善培养基配方能够在一定程度上
促进陆地棉品种Coker201的球形胚向鱼雷形胚和子
叶胚阶段发育, 但总体上看来, 体细胞胚的发生率
不高, 同步性也差(图 1-A)。其中球形胚、心形胚、
鱼雷形胚和子叶胚的数量分别占总胚数的 43.4%、
6.3%、24.5%和 25%。为了使选取的胚性愈伤组织在
细胞分裂、分化和获得营养上最大可能保持一致性,
我们同时尝试了悬浮培养方式。首先将在 MS3培养
基上连续继代 6 次获得的胚性愈伤组织过 30 目筛,
然后将小颗粒部分悬浮于液体培养基(不含激素)中
进行培养。悬浮培养 28 d后, 只发现有少量的体细
胞胚产生, 仅为固体培养的 1/4, 且主要处于球形胚
阶段 , 占总胚数的 90%, 没有观察到子叶胚 (图
1-B)。将悬浮培养时间延长至 70 d, 仍没有观察到体
细胞胚明显增加。为了提高体细胞胚的发生率和实



图 1 不同培养方式对陆地棉品种 Coker201体细胞胚
胎发生的效应
Fig. 1 Effects of different culture methods on somatic
embryogenesis in Coker201
(A)胚性愈伤组织在固相培养基上(不垫滤纸)培养; (B)胚性愈伤
组织悬浮培养; (C)经30目筛过滤后的胚性愈伤组织悬浮培养后
再过50目筛, 筛上物转到固体培养基(上垫滤纸)上培养。每个观
察值表示培养28 d后每克鲜重培养物中各种体细胞胚的平均数。
3次重复, 每重复1瓶或1皿。
(A) Embryonic calli were cultured on solid medium (without filter
parer) alone; (B) Embryonic calli were cultured in suspension me-
dium; (C) Embryonic calli filtered through 30 mesh-size-sieve were
sieved through 50 mesh-size-sieve after suspension culture and then
the masses on the filter were transferred to solid medium (with filter
parer on the medium). The values represent the average number of
every sort of somatic embryos per gram fresh embryonic calli in a
given culture method after 28 d of culture. There were 3 replicates
and one flask or dish per replicate for each treatment.
228 作 物 学 报 第 34卷

现体细胞胚发育的同步性, 我们尝试了将悬浮培养
与固体培养结合起来并在固体培养基上增垫滤纸的
培养方式。首先将胚性愈伤组织在液态的优化培养
基(不含激素)中振荡培养 2 d, 然后过 30目筛去除大
颗粒, 接着悬浮于新鲜的培养基中继续振荡培养。
悬浮培养 14 d后, 再过 50目筛。将筛上的愈伤组织
重新悬浮于新鲜的培养基中, 随后用吸管吸取含有
愈伤组织的悬浮液均匀地接种在垫有滤纸的固体培
养基上进行培养。两周左右便可观察到少量的体细
胞胚, 随后体细胞胚数量不断增加, 至 28 d 时其体
细胞胚总数是单独悬浮培养的 16.5 倍, 是单独固体
培养的 4 倍, 各类型体细胞胚的数量也都比二者有
显著提高(图 1-C)。其中球形胚的数量占总胚数的
55%, 是悬浮培养的 15.4倍, 是固体培养的 5.1倍。
心形胚和鱼雷形胚的数量分别占总胚数的 5.6%和
26%, 是悬浮培养的 10 倍和 87 倍, 是固体培养的
3.6倍和 4.3倍。子叶胚的数量占总胚数的 14.1%, 是
固体培养的 2.1倍。可见, 采用将愈伤组织悬浮培养
14 d后再转移到衬垫滤纸的固体培养基上培养是提
高体细胞胚发生率的有效方式。
2.4 陆地棉品种 Coker201 体细胞胚胎发生的同
步调控效果
将在 MS3 培养基上连续继代 6 次的 Coker201
胚性愈伤组织(图 2-A)先振荡培养 2 d使其充分分散,
用 30目筛过滤除去大颗粒后, 继续悬浮培养 14 d(图
2-B)。再用 50 目筛筛选, 将留在筛上的愈伤组织重
新悬浮于新鲜培养基中, 随后用长而尖的吸管吸取
悬浮液均匀地喷布到垫在固体培养基上的滤纸表面,
继续培养。一周后, 观察到愈伤量明显增多(图 2-C)。
14 d左右便可见有少量体细胞胚发生(图 3)。21 d左
右球形胚大量发生, 占总胚数的 70.2% (表 3), 且部
分球形胚已经进入鱼雷形胚和子叶胚阶段(图 2-D,
图 3), 二者分别为总胚数的 19.6%和 2.1% (表 3)。
随后总体细胞胚数量继续增加 , 球形胚数量逐渐
减少 , 鱼雷形胚和子叶胚数量逐渐增加 , 但球形
胚仍占主要地位(图 3)。球形胚、鱼雷形胚和子叶胚
的数量至 28 d 时分别为总胚数的 55%、26%和
14%, 至 35 d时分别为总胚数的 50%、28%和 17%。
同时我们也注意到, 在垫有滤纸的固体培养基上培
养 21 d 后, 总胚数的增加开始缓慢, 至 28 d 后基
本停滞, 球形胚向鱼雷形胚和子叶胚阶段的发育也
出现缓慢甚至停滞, 且畸形胚显著增加, 这可能与
营养的供给能力有关。当培养至 21 d时, 将球形胚
移到新配制的垫有滤纸的培养基上继续培养 (图
4-A), 能够使胚的发育状况得以改善, 大部分胚都



图 2 陆地棉品种 Coker201胚胎发生培养中发育同步化的诱导
Fig. 2 Induction of developmental synchrony in
embryogenic cultures of Coker201
(A)从非胚性愈伤中继代培养 5次的胚性愈伤组织; (B)30目筛过
滤后的胚性愈伤组织悬浮培养; (C)经 50目筛选择后的悬浮培养
物在垫有滤纸的固体培养基上培养 7 d; (D)经 50目筛选择后的
悬浮培养物在垫有滤纸的固体培养基上培养 21 d(球形胚阶段)。
Leica MZ FLⅢ体视显微镜照相。
(A)Embryonic calli obtained by subculture for 5 times from non-
embryonic calli; (B) Embryonic calli after filtration through a
screen of 30 mesh-size-sieve were cultured in suspension; (C) Em-
bryonic calli in suspension culture filtered through 50
mesh-size-sieve were inoculated on solid medium with filter paper
for 7 d; (D) Embryonic calli in suspension culture filtered through
50 mesh-size- sieve were inoculated on solid medium with filter
paper for 21 d (globular stage). Pictures were taken under Leica MZ
FL stereo microscopy.Ⅲ



图 3 陆地棉品种 Coker201胚性愈伤组织悬浮培养 14 d后转移
到固相培养基上衬垫滤纸培养的体细胞胚的发育
Fig. 3 Development of somatic embryos from embryonic
calli of Coker201 on solid medium with filter paper
after suspension culture for 14 d
每个观察值表示每克鲜重培养物中各种体细胞胚的平均数。
3次重复, 每重复 1皿。
The values represent the average number of every sort of somatic
embryos per gram fresh embryonic calli. There were 3 replicates
and one dish per replicate for each treatment.
第 2期 曹景林等: 棉花高效体细胞胚发生及同步控制培养体系研究 229


能正常发育成熟(图 4-B, 4-C)。当继代培养 7 d后能
够观察到少量的鱼雷形胚和子叶胚。继代培养至 14
d时, 大量的胚都已进入鱼雷形胚和子叶胚阶段, 其
中鱼雷形胚占主导地位(图 4-B), 占总胚数的 52.6%
(表 3)。继代培养 21 d后, 大部分胚进入子叶胚阶段
(图 4-C), 占总胚数的 73.0%(表 3)。

表 3 陆地棉品种 Coker201在垫有滤纸的固体培养基上不同培养时期各种体细胞胚的发生频率
Table 3 Frequency of various somatic embryos from Coker201 at different culture periods on solid medium with filter paper
培养方式
Culture
method
培养时期
Culture
period
总胚数
No. of total
embryos
球形胚
Globular
embryoid(%)
心形胚
Heart-shaped
embryoid(%)
鱼雷形胚
Torpedo-shaped
embryoid(%)
子叶胚
Cotyledonary
embryoid(%)
A 21 d 578 70.2 8.1 19.6 2.1
14 d 705 19.0 3.1 52.3 25.5
B
21 d 766 5.5 1.1 20.5 73.0
A：悬浮培养后在垫有滤纸的固体培养基上培养。B：在垫有滤纸的固体培养基上继代培养。每个培养时期统计 3培养皿中各种
体细胞胚总数。
A: culture on solid medium with filter parer after suspension culture. B: subculture on solid medium with filter paper. Total number of
various somatic embryos were from 3 culture dishes at a given culture period.



图 4 陆地棉品种 Coker201在垫有滤纸的固体培养基上继代培养的体细胞胚的发育
Fig. 4 Development of somatic embryos of Coker201 subcultured on the solid medium with filter paper
(A)继代培养当天; (B)继代培养 14 d; (C)继代培养 21 d。Leica MZ FL Ⅲ 体视显微镜照相。
(A) On the day of initial subculture; (B) 14 d after subculture; (C) 21 d after subculture. Pictures were taken under Leica MZ FL stereo Ⅲ
microscopy.

3 讨论
本文针对棉花体细胞胚胎发生频率低, 且随继
代次数增加大多数体细胞胚停留在球形胚阶段这一
情况, 试图通过优化培养基来改善体细胞胚胎发生
和发育的状况; 尽量使选取的胚性愈伤组织在细胞
分裂、分化和获得营养上保持一致, 以促使体细胞
胚胎发生的同步性, 并尽可能避开可能对体细胞胚
胎发生中生理代谢产生影响的物理或化学因素, 以
利直接获得棉花体细胞胚发育机制的真实信息。
张献龙等[14,32]的研究表明, 在分化培养基中补
加 0.1% KCl或者 0.02% CaCl2可以促进棉花愈伤组
织分化成胚。但本实验表明, 当发育培养基 MS3 中
添加 0.1% KCl时, 对胚胎的发生数量没有显著影响,
而能明显促进球形胚向鱼雷形胚和子叶胚阶段的发
育。当 MS3 中添加 0.02% CaCl2时, 不仅对胚胎发
生没有显著影响, 而且对胚胎的成熟发育也没有明
显的促进效应。糖类对诱导植物体细胞胚胎发生是
不可缺少的重要成分。Glucose (3%)适合于棉花体细
胞胚的诱导和成熟 [25,31,33], 与其他碳源相比, 能够
大大降低畸形胚的发生率[33]。含有高浓度糖的培养
基能够促进体细胞胚的发育和成熟, 如培养基中加
6%的蔗糖能促进大豆(Glycine max L. Merr.)体细胞
胚成熟[38], 加 6%或 9%的麦芽糖可促进黑松(Pinus
nigra Arn)细胞系 E15体细胞胚成熟[39]。但在本研究
中, 没有发现含 4.5% glucose 的培养基对体细胞胚
胎发生和发育比含 3% glucose的培养基具更明显的
促进效应。
关于陆地棉Coker201的胚胎发生和发育以前有
过不少的报道 [16,24-26,32,34], 固体培养的体细胞胚胎
发生率低和胚胎发育的不同步是个共同存在的问
题。悬浮培养对棉花体细胞胚胎发生是有效
的[17-18,20-22,24,27-28,30,33]。它与固体培养相比, 胚性愈
伤组织能够更充分更均匀地吸收营养[21-22,28], 有利
于体细胞胚胎发生和发育的同步性[17,21]。但我们的
试验表明单独的悬浮培养比固体培养的体细胞胚胎
发生率低。在一些植物中, 悬浮培养往往和 ABA处
理[8-9]、ASA+TDZ处理[10]、肌醇饥饿[11]、密度梯度
离心结合过筛[12-13]等方法结合起来使用, 来实现体
230 作 物 学 报 第 34卷

细胞胚胎的高频率发生和同步发育。一般认为, 悬
浮培养可作为促进棉花胚胎发育成熟的中间步
骤[18,20,24,27-28,30]。因此, 本研究将悬浮培养与垫有滤
纸的固体培养结合起来使用。本实验室以前的工作
已经表明, Coker201 的胚性愈伤细胞的生长在悬浮
培养 15 d就进入稳定状态, 适于进行细胞生长的调
控[40]。此时, 将悬浮培养物转移到固体培养基上继
续培养, 仅经过 30~60目筛网的愈伤组织能够比其他
愈伤组织产生更大更成熟的胚[24]。因此, 我们在试
验中, 首先将胚性愈伤组织通过振荡培养 2 d 使其
分散后过 30目筛, 然后再悬浮培养 14 d, 及用 50目
筛进行筛选, 以得到均一的胚性细胞。据报道, 当体
细胞胚[31]或不经过悬浮培养的胚性愈伤组织[29]直接
在铺垫一层滤纸的固体培养基上培养时, 由于改善
培养物的通气状况[29], 而有利于体细胞胚的发育和
成熟。本研究中, 悬浮培养并经筛选的胚性愈伤组
织在固体培养基上培养时, 也采用了滤纸, 以利悬
浮培养物在固体培养基上均匀喷布, 使其与培养基
均匀接触, 同时也有利于吸去悬浮培养物带入的多
余水分。固体培养体系通常存在愈伤组织与培养基
接触不充分且不均匀的问题, 导致胚胎零星发生和
不可控[21]。试验表明, 我们的方案是有效的。按照
这个培养程序, 我们获得的胚数是悬浮培养的 16.5
倍, 是固体培养的 4 倍。当将悬浮培养物在垫滤纸
的固体培养基上培养 21 d 时, 可得到 70.2%的球形
胚。将球形胚继代培养 14 d时可得到 52.3%的鱼雷形
胚, 继代培养 21 d时, 可得到 73.0%的子叶胚。
与其他体细胞胚胎发生同步化的方法[8-13]相比,
本研究建立的同步化培养体系不需要反复离心重悬
浮,并减少了过筛次数, 步骤简单, 降低了受污染的
风险; 减少了物理因素和外源物质对胚性培养物的
生理状态的影响, 有利于更直接地获得棉花体胚发
育机制的真实信息。
棉花胚性愈伤组织的体细胞胚胎发生与大多数
双子 叶植物一样, 依次经过球形胚、心形胚、鱼雷
形胚及子叶形胚等阶段。但是在本试验中始终没有
观察到相对典型的大量心形胚产生时期, 这可能由
于心形胚阶段时间较短, 当新的心形胚产生时, 原
来产生的心形胚已经进入鱼雷形胚阶段。这也说明,
体细胞胚胎发生的同步性只是相对的, 尽管悬浮培
养结合过筛能够改善细胞间的均一性, 但仍不能做
到培养细胞之间在细胞分裂和分化方面的完全一
致。此外, 我们的试验结果仅基于陆地棉品种 Coker
201, 是否适合于其他棉花品种, 尚需进一步验证。
4 结论
在陆地棉品种Coker201胚性愈伤组织的继代培
养中, 当在培养基中添加 0.1%(W/V) KCl时, 能够调
节细胞内的生理代谢, 改善继代培养中大多数体细
胞胚停留在球形胚阶段的状况, 促进球形胚向鱼雷
形胚和子叶胚阶段的发育。而当在培养基中添加
0.02% (W/V) CaCl2或 1.5% (W/V) glucose时, 对胚胎
的发生和发育没有显著影响。
以含 0.1% (W/V) KCl的体细胞胚发生培养基为
基本培养基, 并综合运用悬浮培养 14 d 结合 30~50
目筛网筛选处理、在固体培养基上铺垫一层滤纸、
将所选的悬浮培养物以悬浮液的形式用长而尖的吸
管喷布在铺垫在固体培养基上的滤纸表面、在垫有
滤纸的固体培养基上培养 21 d后将球形胚继代培养
等一系列措施对胚性愈伤组织进行培养, 与单独的
悬浮培养和固体培养相比, 能够非常显著地提高体
细胞胚胎发生率, 并能够基本实现体细胞胚胎的同
步发育。这个培养体系避开了 ABA处理、ASA+TDZ
处理、肌醇饥饿等影响胚性培养物正常生理状态的
物理和化学因素, 也降低了受污染的风险, 可望有
助于在生理生化和分子水平上对棉花体细胞胚胎发
生机制的研究。
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