全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(6): 934−943 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 重庆市自然科学基金项目(9266); 国家自然科学基金项目(30471190, 30671429); 教育部高等学校博士学科点专项科研基金项目(20050625003)
作者简介: 高启国(1978–), 男, 在读博士, 蔬菜学专业, 西南大学园艺园林学院, 研究方向: 信号传导。E-mail: gaoqg2004031@163.com
*
通讯作者(Corresponding authors): 朱利泉(1962−), 男, 教授, 博士生导师, E-mail: zhuliquan@swu.edu.cn; Tel: 023-68250794; Fax:
023-68251914; 王小佳(1956−), 男, 教授, 博士生导师, E-mail: wxj@swu.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-11-14; Accepted(接受日期): 2008-01-31.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00934
甘蓝自交不亲和信号传导中 THL1和 SRK相互作用的体外检测
高启国 1 宋 明 1 牛 义 1 杨 昆 2 朱利泉 2,* 王小佳 1,*
(1 西南大学重庆市蔬菜学重点实验室, 重庆 400716; 2 西南大学植物生理生物化学实验室, 重庆 400716)
摘 要: 在甘蓝自交不亲和信号传导中 SRK和 THL1之间可能存在相互作用。为进一步证实该相互作用, 以甘蓝 E1
为材料, 采用 RT-PCR 技术扩增了 THL1 和 SRK 激酶结构域(记为 SRKE1)编码序列, 构建了 THL1 原核表达质粒
pET43.1-THL1, SRKE1原核表达质粒 pET431-SRKE1和真核表达质粒 pPIC9K-SRKE1, 分别在宿主菌大肠杆菌 BL21和
毕赤酵母 GS115中进行表达。THL1融合蛋白经胰岛素检测, 表明表达的 THL1有氧化还原活性。建立了体外检测蛋
白质相互作用的新方法, 并用该方法对 THL1与 SRKE1的相互作用进行了检测, 结果表明 THL1可与 SRKE1相互作用
并形成稳定的复合体, 这为深入分析 THL1与 SRK相互作用机理提供了理论和技术基础。
关键词: S-位点受体激酶; 类硫氧还蛋白; 毕赤酵母
Test of Interaction between THL1 and SRK from Brassica oleracea L. in
Self-Incompatibility Signaling Process
GAO Qi-Guo1, SONG Ming1, NIU Yi1, YANG Kun2, ZHU Li-Quan 2,*, and WANG Xiao-Jia1,*
(1 Key Laboratory in Olericulture of Chongqing, Southwest University, Chongqing 400716; 2 Plant Physiology and Biochemistry Laboratory of
Southwest University, Chongqing 400716, China)
Abstract: The SRK and THL1 from Brassica oleracea L. act probably with each other in self-incompatibility signal process. In
present study, with an aim to testify the interaction, the coding sequences of THL1 and SRK kinase domain(named as SRKE1) were
amplified from stigma mRNA of Brassica oleracea L., and inserted into the expression vector pET43.1 and yeast expression vec-
tor pPIC9K to construct the recombinant plasma pET43.1-THL1, pET43.1-SRKE1, and pPIC9K-SRKE1. The recombinant protein
were expressed in E. coli(BL21) and Pichia pastoris (GS115), respectively. Thioredoxin activity was tested by the ability of THL1
reducing insulin, showing that THL1 had oxidation/reduction activity. A new method was put forward for testing the interaction
between proteins, through the method the interaction between SRKE1 and THL1 was analyzed, showing that SRKE1 and THL1
could act with each other to combine and form a stable complex. This research provides a theoretical and technical bases for fur-
ther analysis of the interaction mechanism between SRK and THL1.
Keywords: S-locus receptor kinase; Thioredoxin-like protein; Pichia pastoris
1991 年 Stein 等首次从甘蓝(Brassica oleracea)
中分离出 S-位点受体激酶(S-locus receptor kinase,
SRK)的编码基因, 发现该基因与 S-locus 连锁并在
柱头中特异表达[1]。已有报道证实该蛋白是甘蓝等
芸薹属作物柱头识别自花花粉、启动自交不亲和信号
传导和最终导致自花花粉萌发受阻的核心关键酶[2-5]。
SRK 主要由胞外结构域、跨膜结构域和激酶结构域
3部分组成, 胞外结构域是花粉配体结合位点, 有较
高的多态性, 决定自交不亲和性(self-incompatibility,
SI)特异识别反应 , 而激酶结构域具有丝氨酸 /苏氨
酸(Ser/Thr)激酶活性[1]。
THL1(Thioredoxin-like 1)是类硫氧还蛋白 h 家
族的一员[6-7]。THL1 在甘蓝根、茎、叶、花瓣、花
粉囊、雌蕊等器官中广泛表达, 在花粉囊和雌蕊中
表达量相对较高[8]。虽然 Bower 等研究发现 THL1
和 THL2 可与 SRK 激酶结构域作用, Cabrillac 等研
第 6期 高启国等: 甘蓝自交不亲和信号传导中 THL1和 SRK相互作用的体外检测 935


究表明加入 THL1 后, SRK 的自体磷酸化受到抑制,
花粉包被蛋白(Pollen coat proteins, PCPs)的加入会
减轻这种抑制作用[8-9]。但该相互作用是否能真正形
成？所形成复合体的稳定性受到哪些化学因子调
控？这些调控对自交不亲和性状会产生何种影响及
在生产上有何用途？为了探索这些问题, 必须进一
步鉴定 SRK 与 THL1 之间相互作用, 建立相互作用
化控试剂的筛选平台。本文扩增了 THL1和 SRK激
酶结构域编码区 (记为 SRKE1)编码序列 , 构建了
THL1原核表达质粒 pET43.1-THL1, SRKE1原核表达
质粒 pET43.1-SRKE1和真核表达质粒 pPIC9K-SRKE1,
对两者相互作用进行了体外检测。以期为上述问题
的深入研究提供新内容。
1 材料与方法
1.1 材料
甘蓝 E1品种, 为西南大学园艺园林学院选育的
高度自交不亲和材料。3月底收集甘蓝 E1开花前 1~2
d花蕾, 剥去萼片取其柱头, 用于提取柱头总 RNA。
表达载体 pET-43.1a、pPIC9K、大肠杆菌 BL21、酵
母菌 GS115为本实验室保存; UNIO-10 Trizol Total
RNA Preparation Kit 购自上海生工; PrimeSTARTM
HS DNA Polymerase、BamH I、Hind III、Xhol I、EcoR
I、Not I、Bgl II 为 MBI 产品; MagneHisTM Protein
Purification System购自 Promega公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 参照刘东等(2003)扩增 THL1
编码序列[10], 设计合成一对特异引物 P1和 P2, 其序
列: P1 为 5′-GGATCCATGATCCCAGCAGGAGAA
GTG-3′, 5′为 BamH I酶切位点; P2为 5′-CTCGAGA
AAGTGTCAATAAGGCAAC-3′, 5′为 Xhol I酶切位点。
依据 SRK的 cDNA序列(SRK6, NCBI登陆号为
M76647), 设计合成两对引物, 特异扩增 SRK 激酶
结构域编码区序列 SRKE1, P3和 P4用于构建 SRKE1
原核表达质粒, P5和 P6用于构建 SRKE1真核表达质
粒, 其序列: P3为 5′-GGATCCACTGTTGGTGTTAG
TGTTC-3′, 5′端为 BamH I 酶切位点; P4 为 5′-AA
GCTTTCATATTACCGGGCATC-3′, 5′为 Hind III 酶
切位点; P5为 5′-GAATTCACTGTTGGTGTTAGTGT
TC-3′, 5′端为 EcoR I酶切位点; P6为 5′-GCGGCCGC
TCATATTACCGGGCATC-3′, 5′为 Not I酶切位点。
1.2.2 表达质粒的构建与鉴定 收集甘蓝开花前
1~2 d柱头, 提取柱头总 RNA。以总 RNA为模板、
Oligo(dT)18 为引物, 反转录合成 cDNA 第一条链。
以 cDNA 第一条链为模版, 用 P1 和 P2 引物扩增
THL1 的 cDNA 序列, 加 A 后与 pMD18-T 连接, 经
BamH I和 Xhol I双酶切后将 THL1编码序列定向插
入载体 pET43.1a, 重组质粒转化大肠杆菌 X1-blue,
提取质粒经 BamH I/Xhol I双酶切鉴定, 构建正确的
质粒, 命名为 pET43.1a-THL1。
以 cDNA 第一条链为模版, 用 P3 和 P4 引物扩
增 SRKE1的 cDNA 序列, 加 A 后与 pMD18-T 连接,
经 BamH I/ Hind III双酶切后将 SRKE1序列定向插入
载体 pET43.1a, 重组质粒转化大肠杆菌 X1-blue, 提
取质粒经 BamH I/ Hind III双酶切鉴定, 构建正确的
质粒, 命名为 pET43.1a-SRKE1。
以 cDNA 第一条链为模版, 用 P5 和 P6 引物扩
增 SRKE1的 cDNA序列, 加 A后与 pMD18-T 连接,
经 EcoR I/Not I 双酶切后将 SRKE1序列定向插入载
体 pPIC9K, 重组质粒转化大肠杆菌 X1-blue, 经菌
落 PCR和质粒 EcoR I/Not I双酶切鉴定, 构建正确
的质粒, 命名为 pPIC9K-SRKE1, 送上海生工测序。
1.2.3 重组蛋白的体外表达 (1)THL1 和 SRKE1
原核表达将表达质粒 pET43.1a-THL1、pET43.1a-
SRKE1分别转化表达宿主菌 BL21。挑取单菌落, 接
种于 1 mL含有 50 μg mL−1氨苄青霉素的 LB液体培
养基, 37℃摇床上培养过夜。次日, 过夜培养物按
1∶100 扩大培养, 当 OD600在 0.8~1.0 时加入 IPTG
至终浓度为 0.5 mmol L−1, 37℃, 250 r min−1培养 4 h,
诱导完成后收集细胞用于电泳检测表达情况和重组
蛋 白 纯 化 。 (2)SRKE1 酵 母 表 达 表 达 质 粒
pPIC9K-SRKE1用 Bgl II 线性化, 经 Bio-Rad 电转化
仪电击转化感受态毕赤酵母 GS115, 转化产物涂布
于MD平板, 30℃倒置培养直至转化子出现, 然后将
转化子按一一对应方式接种于 MD和 MM平板上进
行 Mut+/MutS表型筛选。筛选在 MD 平板较 MM 平
板上生长较快的酵母转化子, 将其涂布于含有不同
浓度 G418(0.25、0.75、1.5、2.0、3.0、4.0 mg mL-1)
的 YPD平板上, 30℃培养 2~5 d, 每天检查菌落生长
状况。挑取 G418 高抗性菌落放入以甘油为碳源的
BMGY 培养基中, 30℃、250 r min−1振荡培养, 到
OD600值为 2~6 时, 1 500×g下离心 5 min收集细胞
沉淀 , 用含 0.5%甲醇的 BMMY 培养基重悬菌体
(OD600为 1.0), 30℃ 250 r min−1振荡培养以诱导表
达, 其间每 24 h 添加一次甲醇使其至浓度保持在
0.5%, 每隔 12 h取样一次, 直至 144 h, 用于检测重
936 作 物 学 报 第 34卷

组蛋白表达情况。
1.2.4 THL1 和 SRKE1相互作用的体外检测 依
据蛋白纯化试剂盒说明书, 纯化表达的 THL1, 参照
Holmgren等[11]研究方法我们曾检测 THL1生物学活
性 [12]。参照免疫共沉淀法鉴定相互作用蛋白质原
理[13], 通过体外蛋白质孵育检测两者的相互作用。
THL1 与原核表达 pET43.1a-SRKE1之间相互作用的
检测程序如下: (1)取 100 mL 表达 pET43.1a-SRKE1
菌液, 4℃下 3 300×g离心 10 min收集细胞, 细胞重
悬于 4 mL蛋白提取液(50 mmol L−1 Tris-HCl pH 8.0,
150 mmol L−1 NaCl, 1% Triton X-100,10% Glycerol,1
mmol L-1 PMSF, 10 μg mL−1 Leupeptin, 25 mmol L-1
Benzamidin, 30 μg mL−1 Aprotinin), 悬浮液于−20℃
冰箱中过夜 , 次日于冰上解冻 , 超声破碎 15 min,
4℃下 13 400×g离心 10 min, 收集上清液置冰上备
用; (2)取 5管, 每管 5 mL THL1表达菌液, 9 300×g
离心 2 min收集细胞, 加 1.5 mL 1×细胞裂解液悬浮
细胞和 1 μL DNase后置 28℃摇床上摇 15 min, 各管
分别加 15、20、25、30和 35 μL MagneHis Ni-Particles,
轻轻混匀, 室温孵育2 min, 用磁力架回收Ni-Particles
再加 50 μL 蛋白提取液重悬 , 悬浮液与 300 μL
pET43.1a-SRKE1上清液混匀, 室温孵育 2 min, 收集
Ni-Particles, 用结合/清洗液(100 mmol L−1 HEPES
pH 7.5, 10 mmol L−1 imidazole, 2~8 mol L−1 gua-
nidine-HCl)洗 3 次 , 再用 50 μL 洗脱缓冲液(100
mmol L−1 HEPES pH 7.5, 500 mmol L−1 imdazole)洗
脱蛋白, 电泳检测 Ni+与 THL1结合情况; (3)参照前
2步结果离心收集 10 mL THL1表达菌液中细菌, 用
3 mL 1×细胞裂解液悬浮细胞, 取 50 μL MagneHis
Ni-Particles 加入细胞悬浮液中, 轻轻混匀, 室温孵
育 2 min, 用磁力架回收 Ni-Particles, 加 50 μL蛋白
提取液重悬液; (4)取前 3步得到的悬浮液 20 μL检测
Ni+离子是否有剩余来作对照: 20 μL 悬浮液与 300
μL pET43.1a-SRKE1 上清液混匀, 室温孵育 2 min,
收集 Ni-Particles, 用结合/清洗液洗 3 次, 然后用 50
μL洗脱缓冲液洗脱蛋白; (5)取步骤 3中剩余 30 μL
悬浮液与 300 μL pET43.1a-SRKE1上清液混匀, 4℃孵
育 2 h, 每隔 15 min混匀一次, 孵育结束后用 150 μL
清洗缓冲液 (20 mmol L−1 Tris-HCl, pH 7.5, 10%
glycerol, 0.1% Triton X-100, 150 mmol L−1 NaCl and
1 mmol L−1 sodium orthovanadate)洗 3次, 然后用 50
μL洗脱缓冲液洗脱蛋白; (6)将各蛋白洗脱液加入等
体积的 2×样品缓冲液 100℃煮沸 5 min, 每样取 30
μL电泳检测。
THL1和真核表达 pPIC9K-SRKE1之间相互作用
的检测如下: (1)甲醇诱导表达 60 h时取 100 mL表达
菌液, 4℃下 3 300×g离心 10 min收集细胞, 细胞重
悬于 2 mL蛋白提取液(50 mmol L−1 Tris-HCl pH 8.0,
150 mmol L−1 NaCl, 1% Triton X-100, 10% Glycerol,
1 mmol L−1 PMSF, 10 μg mL−1 Leupeptin, 25 mmol
L−1 Benzamidin, 30 μg mL−1 Aprotinin), 超声破碎 10
min, 4℃下 13 400×g离心 10 min, 收集上清液置冰
上备用; (2)离心收集 5 mL THL1 表达菌液中细菌,
用 3 mL 1×细胞裂解液悬浮细胞, 取 25 μL Mag-
neHis Ni-Particles加入细胞悬浮液中, 轻轻混匀, 室
温孵育 2 min, 用磁力架回收 Ni-Particles, 与 300 μL
pPIC9K-SRKE1上清液混匀, 4℃孵育 1 h, 每 15 min
混匀一次 , 孵育结束后用 150 μL 清洗缓冲液(20
mmol L−1 Tris-HCl, pH 7.5, 10% glycerol, 0.1% Triton
X-100, 150 mmol L−1 NaCl and 1 mmol L−1 sodium
orthovanadate)洗 3 次, 然后用 50 μL 洗脱缓冲液洗
脱蛋白; (3)将蛋白洗脱液加入 1/4 体积的 4×样品缓
冲液 100℃煮沸 5 min, 取 50 μL电泳检测。
2 结果与分析
2.1 表达质粒的构建与鉴定
Kachroo 等[14]理论分析认为, SRK 激酶结构域
与 THL1之间可能存在相互作用。因此, 本文特异扩
增 SRK激酶结构域编码区序列 SRKE1, 引物对 P3/P4
与 P5/P6上酶切位点不同, 扩增的 SRKE1片段一致都
为 1 235 bp, 编码 407个氨基酸。SRKE1与 SRK6、
SRK910、SRK18、SRK29 氨基酸序列同源性分别为
88.2%、85.7%、87.2%和 85.7%, SRKE1的氨基酸序
列从跨膜结构域第 4 个氨基酸开始, 包含了跨膜结
构域 16 个氨基酸和整个激酶结构域(图 1)。Bower
等[8]和Mazzurco等[15]利用酵母双杂交结合点突变技
术证明 SRK910上 Cys465和 Lys557是 SRK910与 THL1
或者 THL2 作用所必需的。本试验扩增序列对应位
置的氨基酸也是 Cys和 Lys, 并没有突变, 表明扩增
结果符合要求。不同单倍型 SRK依据序列同源性高
低分为两类, 第一类序列间的同源性要高于第二类,
且都表现为高度自交不亲和, B. oleracea SRK15、B.
oleracea SRK2、B. rapa SRK60、B. rapa SRK29均属
第二类。将 SRKE1与网上公布的 SRK激酶结构域氨
基酸序列进行亲缘关系比对(图 2), SRKE1与 SRK45、
SRK3聚在一起, SRK15、SRK60、SRK5和 SRK2聚在
一起, 两个分支材料亲缘关系较远, 依据 HE Yu-Tan
等研究结论与 SRK45、SRK3聚在同一个分支的材料
第 6期 高启国等: 甘蓝自交不亲和信号传导中 THL1和 SRK相互作用的体外检测 937


均为高度自交不亲和, 表明 SRKE1 应为高度自交不
亲和, 这与甘蓝 E1 材料自交亲和指数为 0.002, 自
花授粉表现高度自交不亲和的田间结果一致, 从分
子层面进一步说明该材料为高度自交不亲和型[16]。
构建的表达质粒 pET43.1-SRKE1经 BamH I/ Hind III双
酶切(图 3), pPIC9K-SRKE1经 EcoR I/ Not I双酶切(图
4), 电泳结果表明都可以得到大小约 1 240 bp 的
SRKE1片段, 表达质粒送上海生工测序, 结果 SRKE1
插入位点和方向完全正确。表达质粒 pET43.1a-
THL1分析结果见高启国等[11]。
2.2 重组蛋白的诱导表达与 SDS-PAGE检测
图 5表明, 与诱导的载体质粒 pET43.1a和未诱
导的样品相比 , 诱导表达后的各泳道多出一条带 ,
大小约 107 kD, 其蛋白质相对分子质量与估计值相

图 1 SRKE1序列比对分析
Fig. 1 Sequence analysis of SRKE1
下划线部分为 SRK910中 Cys465和 Lys557。
The positions of Cys465 and Lys557 of SRK910 were underlined.

图 2 部分 SRK激酶结构结构域编码区核苷酸序列分子进化树
Fig. 2 Phylogenetic tree of nucleotide sequence of some SRK kinase-domain
NCBI登陆号 SRK3为 X79432; SRK5为 Y18259; SRK6为 M76647; S RK18为 AB037473; SRK23为 AB013720; SRK60为 AB097116; SRK22
为 AB054061; SRK45为 E15795; SRK15为 Y18260; SRK29为 AB008191; SRK9为 D88193; SRK2为 AB024416; SRK910为 M97667。
X79432 is accession number for SRK3 in NCBI; Y18259 for SRK5; M76647 for SRK6; AB037473 for SRK18; AB013720 for SRK23;
AB097116 for SRK60; AB054061 for SRK22; E15795 for SRK45; Y18260 for SRK15; AB008191 for SRK29; D88193 for SRK9 ; AB024416 for
SRK2; M97667 for SRK910.
938 作 物 学 报 第 34卷


图 3 pET43.1a-SRKE1酶切电泳图
Fig. 3 The agarose gel electrophoresis of pET43.1a-SRKE1
digested by restriction enzymes
1: DL2000 DNA marker; 2和 3: BamH I/Hind III双酶切; 4: BamH
I单酶切; 5: Hind III单酶切; 6: pET43.1a-SRKE1质粒对照; 7:
λDNA marker
1: DL2000 DNA marker; 2 and 3: recombinant digested by BamH
I/Hind III; 4: recombinant digested by BamH I; 5: recombinant
digested by Hind III; 6: pET43.1a-SRKE1 without digestion as con-
trol; 7: λDNA marker.

图 4 pPIC9K-SRKE1酶切电泳图
Fig. 4 The agarose gel electrophoresis of pPIC9K-SRKE1 di-
gested by restriction enzymes
1: DNA marker; 2: EcoR I and Not I双酶切; 3: EcoR I单酶切; 4:
Not I单酶切; 5: pPIC9K-SRKE1质粒对照; 6: λDNA marker
1: DNA marker; 2: recombinant digested by EcoR I and Not I; 3:
recombinant digested by EcoR I; 4: recombinant digested by Not I;
5: pPIC9K-SRKE1 without digestion as control; 6: λDNA marker.

符, 表明 pET43.1a-SRKE1融合蛋白诱导表达成功。
与原核表达系统相比, 真核表达系统对表达蛋
白有翻译后加工修饰功能, 更有助于形成蛋白天然
构象, 因此, 我们将 SRKE1进行了真核表达, 以便对
两者相互作用作进一步验证。挑取在 MD 平板上较
MM平板生长快的菌落, 涂布于含有不同浓度 G418
的 YPD平板, 在 2.0 mg mL-1G418平板上长出 4个
菌落, 该菌落可作为 pPIC9K-SRKE1 诱导表达的待
选菌株。结果表明, 一般在诱导起始后 60~84 h之间
出现一个表达高峰, 将诱导表达 0 h和 60 h时的菌
液上清液一起进行 12% SDS-PAGE电泳, 结果见图
6, 与诱导 0 h时相比, 在 66.4 kD和 44.3 kD之间诱
导 60 h泳道中比诱导 0 h泳道中多出一条带, 大小约
57 kD, 其蛋白质相对分子质量与 pPIC9K-SRKE1融合
蛋白的估计值相符, pPIC9K 是分泌型表达载体, 从
图 6 泳道 3 中可以看出, 收集菌液上清液中杂蛋白
很少, 几乎看不到其他条带。

图 5 SRKE1在大肠杆菌中重组表达的 SDS-PAGE
Fig. 5 SDS-PAGE of recombinant expressed SRKE1 in E. coli
strain BL21
1: 蛋白质高分子量标记; 2: 未诱导 pET43.1a-SRKE1对照; 3~8:
诱导的 pET43.1a-SRKE1产物; 9: 诱导 pET43.1a产物对照。
1: protein molecular mass marker; 2: recombinant strain
BL21/SRKE1 uninduced; 3–8: recombinant strain BL21/SRKE1
induced; 9: BL21/pET43.1 induced.

图 6 SRKE1在毕赤酵母中重组表达的 SDS-PAGE
Fig. 6 SDS-PAGE of recombinant expressed SRKE1 in Pichia
pastoris GS115
1: 蛋白质高分子量标记; 2: 甲醇诱导 pPIC9K-SRKE1表达 0 h产
物; 3: 甲醇诱导 pPIC9K-SRKE1表达 60 h产物。
1: protein molecular marker; 2: SRKE1 recombinant expression
induced with methanol for 0 h; 3: SRKE1 recombinant expression
induced with methanol for 60 h.

2.3 THL1和 SRKE1相互作用的体外检测
2.3.1 THL1 和原核表达 SRKE1 相互作用的体外
检测
2.3.1.1 Ni+剩余检测 为排除相互作用检测过
程中可能由于 pET43.1a-THL1 结合剩余的 Ni+与
pET43.1a-SRKE1 结合而带来的假阳性结果, 我们设
置 5管Ni+梯度, 在每管收集 5 mL的 pET43.1a-THL1
表达菌液菌体的裂解液中分别加入 15、20、25、30
和 35 μL MagneHis Ni-Particles, 孵育 2 min后收集
磁珠, 再与 pET43.1a-SRKE1上清液孵育 2 min, 洗脱
Ni+结合蛋白电泳检测。结果表明加入 15、20和 25 μL
MagneHis Ni-Particles 时未见 SRKE1条带, 表明 Ni+
几乎完全与 pET43.1a-THL1 结合, 而加入 30 μL 和
35 μL MagneHis Ni-Particles时有 pET43.1a-SRKE1条
带, 说明 Ni+过量, 过量的 Ni+与 pET43.1a-SRKE1结
合。因此以 5 mL pET43.1a-THL1菌液, 加入 25 μL
Ni+为基准进行下一步试验。
2.3.1.2 SRKE1与 THL1相互作用的电泳检测
第 6期 高启国等: 甘蓝自交不亲和信号传导中 THL1和 SRK相互作用的体外检测 939


将孵育结果、Ni+与 pET43.1a-THL1结合情况对照和
纯化的 pET43.1a-THL1、pET43.1a-SRKE1一起电泳,
结果见图 7。Ni+离子磁珠与 pET43.1a-THL1融合蛋
白结合后得到 50 μL Ni+离子磁珠悬浮液, 取其 20
μL悬浮液与 300 μL pET43.1a-SRKE1上清液室温孵
育 2 min的电泳结果见泳道 5, 有 pET43.1a-THL1蛋
白条带, 而与纯化的 pET43.1a-SRKE1对应处未见条
带, 说明 Ni+全部与 pET43.1a-THL1 结合; 剩余 30
μL悬浮液与 300 μL pET43.1a-SRKE1上清液 4℃孵育
2 h后的电泳结果见泳道 4, 该泳道中既有 pET43.1a-
THL1 融合蛋白条带也有 pET43.1a-SRKE1融合蛋白
条带, 而对照泳道 5中没有 SRKE1条带, 说明 SRKE1
与 THL1结合在一起并随Ni+离子磁珠一起沉淀下来,
进而证实了两者间的相互作用。

图 7 pET43.1a-THL1与 pET43.1a-SRKE1相互作用的 SDS-PAGE
Fig. 7 SDS-PAGE of the interaction of pET43.1a-THL1with
pET43.1a-SRKE1
1: 蛋白质高分子量标记; 2: 纯化的 pET43.1a-THL1; 3: 纯化的
pET43.1a-SRKE1; 4: pET43.1a-THL1和 pET43.1a-SRKE1孵育产物;
5: Ni+剩余情况检测。
1: protein molecular mass marker; 2: purified pET43.1a-THL1;
3: purified pET43.1a-SRKE1; 4: pET43.1a-THL1 was incubated
with pET43.1a-SRKE1; 5: Test of the rest Ni+ as control.

2.3.2 THL1 和真核表达 SRKE1相互作用的体外检
测 纯化的 pET43.1a-THL1、表达 0 h和 60 h的
菌液上清液与孵育结果一起电泳, 结果如图 8, 泳道
5为孵育后结果, 该泳道明显比对照泳道 4多出一条
带, 其大小与诱导 60 h 上清液中 pPIC9K-SRKE1大
小完全一致, 说明真核表达 SRKE1可以与 THL1 相
互作用。由于真核表达 pPIC9K-SRKE1融合蛋白内没
有组氨酸标签, 完全排除了 pPIC9K-SRKE1与 Ni+结
合的可能, 因此该检测结果是对原核表达的 THL1
和 SRKE1间相互作用检测结果的进一步证实。
3 讨论
SRK是自交不亲和反应中雌蕊决定因子, 该蛋白
由胞外结构域、跨膜结构域和激酶结构域 3部分组成[1]。
现有研究结果表明 SRK激酶结构域与 THL1之间可能
存在相互作用[14]。为此本文特异扩增了 THL1和 SRK

图 8 pET43.1a-THL1与 pPIC9K-SRKE1相互作用的 SDS-PAGE
Fig. 8 SDS-PAGE of the interaction of pET43.1a-THL1 with
pPIC9K-SRKE1
1: 甲醇诱导 60 h时 pPIC9K-SRKE1产物; 2: 甲醇诱导 0 h时
pPIC9K-SRKE1产物; 3: 蛋白质高分子量标记; 4: 纯化的
pET43.1a-THL1; 5: pET43.1a-THL1和 pET43.1a-SRKE1孵育产物。
1: SRKE1 recombinant expression induced with methanol for 60 h;
2: SRKE1 recombinant expression induced with methanol for 0 h;
3: protein molecular mass marker; 4: purified pET43.1a-THL1;
5: pET43.1a-THL1 was incubated with pPIC9K-SRKE1.

激酶结构域编码序列 SRKE1, SRKE1序列分析表明扩
增序列包含了跨膜结构域 16 个氨基酸和整个激酶
结构域, 符合本试验的要求。
本文首次以甘蓝 E1 为材料, 构建了 THL1 和
SRKE1 表达质粒并进行了体外表达, 通过两个平行
的实验验证了 THL1 和 SRKE1之间相互作用。这一
实验结果是从体外表达角度对 Bower 等 [8]和
Mazzurco 等 [15]利用酵母双杂交系统研究结果提供
了进一步证实。酵母双杂交系统能检测到蛋白质与
蛋白质瞬间的相互作用, 因此 Bower 等和 Mazzurco
等的研究结果只能说明 THL1与 SRK之间存在相互
作用而不能解释两者的作用方式, 在本文检测中为
纯化两者相互作用产物用 150 μL清洗缓冲液清洗了
3次, 在最终检测中仍能检测到 THL1与 SRKE1蛋白
条带 , 说明在反复的清洗过程中并没有洗掉与
THL1结合的 SRKE1, 因此两者的相互作用并非瞬间
发生的而应该是相互结合形成了稳定的复合体。
目前, 人们普遍认为, 在甘蓝花期 THL与 SRK
结合, 使 SRK 激酶活性不能发生, 但当花粉落到柱
头乳突表面后, 花粉 S 半胱氨酸富集蛋白与同一单
倍型的 SRK胞外结构域结合, 并引起 SRK构象的变
化, 使其释放出原本结合的 THL, 从而激活 SRK 激
酶活性, 进而在乳突细胞内发生级联生化反应, 并
最终导致自交不亲和发生[14,17]。可见 THL 与 SRK
复合体的存在及其聚合与解离在自交不亲和反应中
起重要作用。由此我们可以提出假设, 同一单倍型
SCR与 SRK胞外结构域作用后, SRK-THL复合体仍
940 作 物 学 报 第 34卷

能结合不分离, 将阻碍 SRK 自身磷酸化, 导致不发
生自交不亲和反应; 相反, 不同单倍型 SCR 与 SRK
作用后, SRK-THL解离, 激发 SRK 激酶活性, 最终
引发不亲和反应。可见 SRK 与 THL 相互作用的深
入分析和实现人为调控 SRK-THL 复合体聚合与解
离对于自交不亲和材料保存和育种制种工作有重要
意义。本文对 SRKE1与 THL1 相互作用的检测, 条
带清楚, 明确证实了两者相互作用。另外本文建立
的检测体系可作为 SRK 与 THL 相互作用化控试剂
筛选平台, 深入分析两者相互作用的机理。槲皮素
能有效抑制 SRK的激酶活性, 导致 SRK自身磷酸化
明显受阻[18], 在孵育前可用不同浓度槲皮素对 SRK
进行处理, 处理后的 SRK再与 THL孵育, 分析两者
相互作用是否需要 SRK激酶。二硫苏醇糖能够还原
蛋白质及蛋白质各亚基间的二硫键[12], Mazzurco等[15]
利用酵母双杂交系统研究发现 SRK910 上 Cys465 及
THL1 活性位点两个半胱氨酸 Cys35和 Cys38是两者
相互作用所必需, 因此可用二硫苏醇糖处理孵育产
物, 分析 THL与 SRK是不是以二硫键结合在一起。
另外还可以对蛋白质活性位点的单个氨基酸进行化
学修饰, 分析还有那些氨基酸参与决定两者间相互
作用, 但值得注意的一点就是体外表达的 SRK 蛋白
很容易降解 , 因此表达完成后应尽快进行后续试
验。该筛选平台是直接对目的蛋白复合体进行处理,
目的明确。有关化控试剂的筛选工作正在进行中。
免疫共沉淀法鉴定蛋白质相互作用原理表明 ,
蛋白质 X与蛋白质 Y相互作用, 如蛋白质 X用其抗
体免疫沉淀, 则蛋白 Y会与蛋白质 X及其抗体一起
沉淀下来[13]。依据该原理本文利用 pET43.1a作为表
达载体表达 THL1, 巧妙利用了 pPET43.1-THL1 融
合蛋白序列中的 6×His标签与Ni+结合探索性建立体
外 检 测 蛋 白 质 间 相 互 作 用 的 新 方 法 。 将
pPET43.1-THL1融合蛋白与Ni+结合, 结合后的复合
物作为“诱饵蛋白”, 把体外表达 SRKE1 融合蛋白溶
于适于相互作用的缓冲液中作为“靶蛋白”溶液, 两
者 4℃条件下孵育后利用 pPET43.1-THL1 上结合的
Ni+与磁力架吸附性将诱饵蛋白与靶蛋白的复合体
纯化出来。从本文的两个平行试验来看, 我们都得
到了理想的结果, 说明我们建立的体外检测蛋白相
互作用方法是可行的。另外与免疫共沉淀法鉴定蛋
白质相互作用相比, 本方法不需要制备抗体, 简化
了实验操作, 避免了因抗体特异性不强可能带来的
假阳性结果。
4 结论
从分子层面上说明了甘蓝 E1 材料的高度自交
不亲和性。探索性建立了体外检测蛋白质相互作用
的新方法, 利用该方法证实了 THL1 与 SRK 之间的
相互作用, 建立了 SRK 与 THL1 相互作用化控试剂
的筛选平台, 这对于深入分析 THL1 与 SRK 相互作
用的机理, 筛选相互作用的化控试剂, 分析这些调
控对自交不亲反应的影响及其在生产上的应用具有
重要的意义。
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附图 Attached figures:

THL1基因扩增
Agarose electrophoresis of the DNA
and cDNA PCR product of THL1


pET43.1a-THL1酶切电泳图
The agarose gel electrophoresis of the restric-
tion enzyme digestion of pET43.1a-THL1


pET43.1a-SRKE1菌落 PCR检测
PCR identification of the recombinant of
pET43.1a-SRKE1

pET43.1a-THL1菌落 PCR检测
PCR identification of the recombinant
of pET43.1a-THL1


SRKE1基因 RT-PCT产物电泳图
Agarose gel electrophoresis of the cDNA PCR
product of SRKE1


pET43.1a-SRKE1酶切电泳图
The agarose gel electrophoresis of the restric-
tion enzyme digestion of pET43.1a-SRKE1

942 作 物 学 报 第 34卷


pPIC9K-SRKE1菌落 PCR检测
PCR identification of the recombinant of
pPIC9K-SRKE1


pPIC9K-SRKE1酵母转化子检测
PCR identification of the pPIC9K-SRKE1
Transforms


pET43.1a-THL1蛋白表达电泳图
SDS-PAGE analysis of recombinant expressed THL1
in E. coli strain BL21


pET43.1a-THL1与 pET43.1a-SRKE1相互作用检测
SDS-PAGE analysis of the interaction of
pET43.1a-THL1with pET43.1a-SRKE1

pPIC9K-SRKE1酶切电泳图
The agarose gel electrophoresis of the restriction
enzyme digestion of pPIC9K-SRKE1


pET43.1-SRKE1蛋白表达电泳图
SDS-PAGE analysis of recombinant expressed
SRKE1 in E. coli strain BL21


pPIC9K-SRKE1降解情况检测
SDS-PAGE analysis of the degradation of
pPIC9K-SRKE1


pET43.1a-THL1与 pPIC9K-SRKE1相互作用检测
SDS-PAGE analysis of the interaction of
pET43.1a-THL1 with pPIC9K-SRKE1




第 6期 高启国等: 甘蓝自交不亲和信号传导中 THL1和 SRK相互作用的体外检测 943



MM筛选平板
The transforms screening on the MM plate

MD筛选平板
The transforms screening on the MD plate