全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (4) : 909 - 914
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 01 - 15; 修回日期 : 2007 - 05 - 14
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671429, 30471190) ; 重庆市自然科学基金项目 (9622)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhuliquan@ swau1cq1cn; wxj@ swau1cq1cn)
甘蓝中硫氧还蛋白编码基因 THL 1的分子特性及表
达研究
高启国 1 , 宋　明 1 , 牛　义 1 , 杨　昆 2 , 朱利泉 23 , 王小佳 13
(1 西南大学重庆市蔬菜学重点实验室 , 重庆 400716; 2 西南大学植物生理生物化学实验室 , 重庆 400716)
摘 　要 : 采用 PCR和 RT2PCR技术 , 以 ‘E1’甘蓝基因组 DNA和柱头 cDNA为模板对 THL1基因进行扩
增克隆 , 得到的片段长度分别为 732 bp和 455 bp。序列分析表明 , 克隆的 DNA和 cDNA序列与甘蓝 ‘西园四
号’THL1的 DNA和 cDNA同源性分别为 9719%和 9813% , 两条序列内含子的大小不同 ; 同时 , 前者第 2内
含子不符合典型的 GT2AG规则 : 即第 2个内含子 3′端碱基为 AT。将 THL1基因 cDNA序列定向克隆到原核表
达载体 pET24311a ( + ) , 构建融合表达质粒 pET4311a ( + ) 2THL1, 在大肠杆菌 BL21中表达出分子量为 74
kD的融合蛋白 , 经胰岛素检测 , THL1有氧化还原活性 , 表明 THL1在大肠杆菌中得到了正确表达。
关键词 : 甘蓝 ; 类硫氧还蛋白 ; 基因克隆 ; 序列分析
中图分类号 : S 63511; Q 786　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0420909206
M olecular Character iza tion and Expression of Th ioredox in2like Prote in THL 1
Gene from B rassica o le racea L.
GAO Q i2guo1 , SONG M ing1 , N IU Yi1 , YANG Kun2 , ZHU L i2quan23 , and WANG Xiao2jia13
(1 Key Laboratory in O lericu lture of Chongqing, Sou thw est U niversity, Chongqing 400716, China; 2 Plan t Physiology and B io2
chem istry Laboratory, Sou thw est U niversity, Chongqing 400716, China)
Abstract: The DNA and cDNA fragments of the THL1 were amp lified from genom ic DNA and stigma
cDNA of B rassica oleracea ‘E1’by PCR and RT2PCR methods. Their lengths were 732 bp and 455 bp re2
spectively. Sequence analysis indicated that the identities of DNA and cDNA with those cloned from B rassica
oleracea‘Xiyuan 4’p reviously were 9719% and 9813% respectively, the introns of the two sequences were
different in size. Moreover, the second intron of THL1 from B rassica oleracea‘E1’was not comp ly with the
typ ical GT2AG rule: AT existed in the 3′end of the second intron. The cDNA of THL1 was cloned into vector
pET24311a ( + ) to be pET4311a ( + ) 2THL1, transferred into E1coli BL21 and exp ressed as a 74 kD fu2
sion p rotein when induced with IPTG. Thioredoxin activity was measured by ability of the THL1 to reduce in2
sulin. The result showed the THL1 gene had been correctly exp ressed.
Key words: B rassica oleracea; Thioredoxin2like p rotein; Gene clone; Sequence analysis
THL1 ( Thioredoxin2like 1) 是类硫氧还蛋白 h家族的一员 , 是一类广泛参与酶活性调节、信号传
导等生理过程的重要蛋白质 (Chivers et al. , 1997; Motohashi et al. , 2003)。Mazzurco等 (2001) 利用
酵母双杂交系统证明 THL1与甘蓝 S -位点受体激酶 ( S2locus recep tor kinase, SRK) 之间的相互作用 ,
并将 THL1与 SRK结合的活性位点定位在 CPPC上。Cabrillac等 ( 2001)、Goring和 W alker ( 2004)
研究发现 THL1可以抑制 SRK的自体磷酸化 , 花粉包被蛋白能减轻这种抑制作用 , 说明 THL1可能与
SRK可逆结合而抑制该激酶的活性 , 使甘蓝等芸薹属作物的自交不亲和反应难以发生。然而到目前
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为止 , THL1与 SRK相互作用还没有在植物体内得到验证。
THL1在甘蓝根、茎、叶、花瓣、花粉囊、雌蕊等器官中广泛表达 , 在花粉囊和雌蕊中的表达量
相对较高 (Bower et al. , 1996)。刘东等 (2003) 首次从甘蓝 ‘西园四号 ’中克隆了 THL1基因的全
序列。目前 , 对其它甘蓝品种中 THL1基因的克隆和分析研究还未见报道。由于 ‘西园四号 ’是杂交
种 , 而该基因全序列可能来自于亲本之一 ; 高度自交不亲和系 ‘E1’是其杂交亲本 , 2006年田间统
计结果表明 ‘E1’的自交亲和指数为 0101。从包括 ‘E1’在内的材料中克隆 THL1基因 , 对于该基
因在各种材料及组合之间的变异关系及其体内表达特性的研究具有重要意义。作者以甘蓝 ‘E1’为
材料 , 扩增 THL1基因的全序列 , 旨在探索不同甘蓝品种中该基因的差异 , 并首次构建了 THL1的表
达型载体 , 对大肠杆菌中表达的 THL1进行了活性检测。这对于制备 THL1抗体探针 , 深入研究 THL1
基因在芸薹属自交不亲和信号传导中作用具有重要意义。
1　材料与方法
111　材料
甘蓝 ‘E1’品种 , 为西南大学园艺园林学院选育的高度自交不亲和材料。载体质粒 pET24311a
( + )、大肠杆菌 BL21、X12blue为本实验室保存 ; PrimeSTARTM HS DNA Polymerase, pMD182T Vec2
tor, T4 DNA L igase, E1Z1N1A1TM Plasm id M ini KitⅠ购自大连宝生物公司 ; UN IO210 Trizol Total RNA
Preparation Kit, AMV First Strand cDNA Synthsis Kit, Gel Extraction M ini Kit购自上海生工生物工程服
务有限公司 ; 限制性内切酶 B am HⅠ和 X ho lⅠ为 MB I产品 , MagneH isTM Protein Purification System购
自 Promega公司。
112　PCR扩增甘蓝基因组 THL 1基因序列
用本室改良 CTAB法提取总 DNA (朱利泉和王小佳 , 2000)。参照刘东等 ( 2003) 扩增的序列 ,
设计合成了一对扩增引物 P1和 P2 , 引物 P1的 5′端引入 B am HⅠ酶切位点 , 引物 P2的 5′端引入 X holⅠ
酶切位点 , 其序列为 : P1: 5′2GA TCCATGATCCCAGCAGGAGAAGTG23′; P2: 5′2CTCGAGAAAGTGT2
CAATAAGGCAAC23′。
以甘蓝基因组 DNA为模板 PCR扩增 THL1基因。PCR反应条件为 94℃热变性 5 m in后 , 进入以
下循环 : 94℃ 1 m in, 60℃ 1 m in, 72℃ 215 m in, 30个循环后 72℃延伸 10 m in。扩增产物在 1%琼脂
糖凝胶上电泳检测。
113　RT2PCR扩增甘蓝 THL 1基因 cD NA序列、克隆测序和序列分析
以开花前 1～2 d的甘蓝柱头为材料 , 用 RNA 提取试剂盒提取柱头总 RNA。以总 RNA为模板 ,
O ligo ( dT) 18为引物 , 用反转录试剂盒合成 cDNA的第 1条链 , 以 cDNA的第 1条链为模版用引物 P1
和 P2扩增 THL1的 cDNA序列。电泳回收 PCR产物 , 加 A后与 pMD182T Vector连接 , 构建 pMD182T2
THL1重组质粒 , 连接液转化大肠杆菌 X12blue。挑取阳性菌落和 THL1的基因 PCR产物一起送上海生
工测序 , 测序结果用 Vector NTI进行序列分析。
114　pET4311a ( + ) 2THL1表达质粒的构建
重组质粒 pMD182T2THL1和载体质粒 pET24311a ( + ) 经 B am HⅠ和 XholⅠ双酶切 , 电泳回收目的片
段。在 10μL 连接体系中加入 1μL 缓冲液、1μL T4 DNA 连接酶、615μL THL1片段和 115μL
pET4311a ( + ) 片段过夜连接 , 转化大肠杆菌 X12blue。以 P1和 P2为引物进行菌落 PCR检测 , 用质粒提
取试剂盒提取质粒 , 经 B am HⅠ/XholⅠ双酶切 , 产物用 2%琼脂糖凝胶电泳检测 , 构建正确的质粒命名为
pET4311a ( + ) 2THL1。表达质粒送上海生工测序 , 鉴定所插入的序列及其读码框是否正确。
115　重组蛋白的诱导表达和 SD S - PAGE检测
将表达质粒 pET4311a ( + ) 2THL1转化表达宿主菌 BL21。挑取单菌落 , 接种于 1 mL含有 50μg/mL
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　4期 高启国等 : 甘蓝中硫氧还蛋白编码基因 THL1的分子特性及表达研究 　
氨苄青霉素的 LB液体培养基中 , 37℃摇床上培
养过夜。过夜培养物按 1∶100扩大培养 , 当 OD600
在 018～1时加入 IPTG。 IPTG浓度设为 011、015
和 115 mmol/L等 3个梯度 , 诱导温度设为 28℃
和 37℃两个梯度 , 按两个因素交叉分组设计 , 共
6个组合 (表 1)。225 r/m in下培养 4 h, 取 1 mL
诱导表达的菌液 , 12 000 r/m in离心 1 m in, 弃上
清液 , 沉淀用 1 ×样品缓冲液 (含 011% SDS) 悬
浮 , 100℃煮沸 5 m in。样品用 4%浓缩胶 , 12%分
表 1　pET4311a ( + ) 2THL1诱导条件组合
Table 1　The a ssem bly table of pET4311a ( + ) 2THL1
induc ing cond ition
编号
No.
IPTG
(mmol/L)
诱导温度
Inducing temperature (℃)
诱导时间
Inducing time ( h)
1 011 28 4
2 015 28 4
3 115 28 4
4 011 37 4
5 015 37 4
6 115 37 4
离胶进行 SDS - PAGE, 电泳结束后用 0105%考马斯亮蓝染色 , 染色后置于脱色液中脱色 , 直至蛋白
质条带清楚。
116　THL1的活性检测
用蛋白纯化试剂盒纯化后回收诱导表达的 THL1。参照 Holmgren (1979) 的方法检测 THL1的活
性。预先配制 0139 mmol/L胰岛素和 3 mmol/L的二硫苏醇糖溶液 , 分别取 50μL胰岛素、50μL二硫
苏醇糖和 50μL THL1蛋白纯化液 , 三者混合 , 用分光光度计测反应混和物在 650 nm的吸光值 , 每 2
m in记数 1次。以 50μL胰岛素、50μL二硫苏醇糖和 50μL水的混合液作为对照。
2　结果与分析
211　THL 1基因 D NA和 cD NA的扩增与序列分析
PCR产物电泳结果显示我们克隆片段与刘东等 ( 2003) 从 ‘西园四号 ’克隆的序列大小一致
(图 1)。测序结果表明甘蓝 ‘E1’中 THL1基因 DNA为 732 bp、cDNA为 455 bp。
图 1　THL 1基因 D NA和 cD NA的 PCR产物电泳图
F ig. 1　Agarose gel electrophoresis pa ttern of the D NA and cD NA PCR products of gene THL 1
1: 3 000 marker; 2 and 3: The cDNA PCR p roduct; 4 and 5: The DNA PCR p roduct.
两者序列比较显示 : 该基因包括 3个外显子和两个内含子 , 与刘东等 (2003) 分析的结果一致 ,
但两条序列内含子的大小不同。‘E1’的 THL1基因两个内含子为 195 bp和 82 bp , 而 ‘西园四号 ’
的为 207 bp和 81 bp。另外 , ‘E1’中 THL1基因第一个内含子剪切位点符合经典的 GT2AG规则
(Benjam in, 2000) , 但第 2个内含子剪切位点 5′端碱基为 GT, 3′端碱基为 AT, 为排除测序错误 , 将
产物送不同的公司测序 , 结果肯定了序列的正确性 , 说明甘蓝 ‘E1’THL1基因该位点发生了变异。
用 Vector NTI进行比对分析 , 甘蓝 ‘E1’中 THL1基因 DNA和 cDNA序列与 ‘西园四号 ’THL1
基因 DNA和 cDNA序列的同源性分别为 9719%和 9813% (序列未提供 ) , 其编码区仅有 4个碱基差
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异 , 分别为 : GCT→GCG、ATC→GTC、AAA→AAG、GCC→GCG, 其中 3个为无义突变 , 推导的氨
基酸序列仅在第 92位存在 E→K氨基酸差异 , 活性位点的 CPPC序列没有发生突变 (图 2)。
由于 ‘E1’是 ‘西园四号 ’的杂交亲本 , 两者 THL1基因核苷酸序列的差异说明该基因在杂交
选育过程中发生了自身变异 , 尤其是内含子大小不同及其剪切位点变异可能影响该基因表达过程中
mRNA的有效剪切 , 并最终造成 THL1蛋白在两种材料中表达量的差异。
图 2　THL 1基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列分析
核苷酸大写部分为开放阅读框 , 其下面为相应的氨基酸序列 , 其中双划线部分为活性位点 , 单划线部分为内含子序列 ;
方框内序列为 THL扩增引物 ; 斜体部分为内含子剪切位点 , 阴影部分显示与刘东等 (2003) 扩增序列的差异碱基。
F ig. 2　Ana lysis of the nucleotide sequence of B rassica o leracea L. THL 1 and deduced am ino ac id sequence
The ORF was indicated with cap ital letter and its deduced am ino acid sequence was shown in one2letter under the DNA sequence;
Active site residues were double underlined; The introns were single underlined; The p rimers were boxed;
The cleavage sites were inclined; The base different with the report were shaded.
212　表达质粒 pET4311a ( + ) 2THL1的 PCR、双酶切检测和测序验证
将连接产物转化大肠杆菌质粒 X12blue, 经菌落 PCR检测后 , 提取质粒用 B am HⅠ和 XholⅠ酶切 , 产
物经 2%琼脂糖凝胶电泳检测 , 结果显示双酶切后有大小约 450 bp和 7 200 bp两条带 , 单酶切只有一条
带 , 与预期值大小一致 , 说明表达质粒构建正确 (图 3)。将构建的表达质粒 pET4311a ( + ) 2THL1送上
海生工测序 , 测序结果 (序列未提供 ) 进一步也表明 , 表达质粒的 THL1基因片段插入完全正确。
图 3　 pET4311a ( + ) 2THL1酶切电泳图
1: DL2000 DNA marker; 2和 3: B am HⅠ /XholⅠ双酶切 ; 4: B am HⅠ单切 ; 5: XholⅠ单切 ;
6: pET4311a ( + ) 2THL1质粒对照 ; 7: Lamda DNA marker。
F ig. 3　Agarose gel electrophoresis pa tterna s of the restr iction enzym es d igestion of pET4311a ( + ) 2THL1
1: DL2000 DNA marker; 2 and 3: The recombinant digested by B am HⅠand XholⅠ; 4: The recombinant digested by B am HⅠ;
5: The recombinant digested by XholⅠ; 6: pET4311a ( + ) 2THL1 without digestion as control; 7: Lamda DNA marker.
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　4期 高启国等 : 甘蓝中硫氧还蛋白编码基因 THL1的分子特性及表达研究 　
213　重组蛋白的诱导表达和 SD S - PAGE检测
表达产物的 SDS - PAGE结果显示 , 在 74 kD左右处有重组蛋白表达特异带出现 , 其蛋白质相对
分子质量与预期值相符 , 而未诱导的重组子菌液不见此条带 (图 4 )。表明表达质粒 pET4311a
( + ) 2THL1构建正确 , 且融合蛋白在大肠杆菌中正确表达。另外 , 各条带之间重组蛋白的表达量差
异不大 , 说明 IPTG浓度和诱导温度对该蛋白表达量的影响不大。
图 4　不同条件对 pET4311a ( + ) 2THL1融合蛋白诱导表达的影响
1: 蛋白质低分子量标记 ; 2: 未诱导的 pET4311a ( + ) 2THL1对照 ; 3～8: 与表 1中的 1～6对应 ; 9: 诱导的 pET4311a ( + ) 对照。
F ig. 4　The influence of d ifferen t induc ing cond ition to pET4311a ( + ) 2THL1 express
1: Protein molecular weight marker; 2: pET4311a ( + ) 2THL1 without inducement as control;
3 - 8: Corresponding to 1 - 6 of the Table 1; 9: pET4311a ( + ) induced by IPTG as control.
214　THL1的活性检测
胰岛素分子由 A链和 B链组成 , 两者以两个二硫键结合在一起 , 二硫苏醇糖可以还原该二硫键 ,
使 A链与 B链解离 , 解离后的 B链使反应混合液呈现白色混浊 , 硫氧还蛋白可以加速该反应的进程
(Holmgren, 1979)。通过反应混合物的 OD650值来检测该反应过程。从图 5可以看出加 THL1混合液
的 OD650值增长速率要明显的比对照快 , 说明加 THL1混合液中 B链的形成速率比对照快 , 表达的
THL1蛋白有活性。
图 5　反应混合液吸光值的变化
THL1代表 THL1、二硫苏醇糖和胰岛素混合液的吸光值 ; 对照为二硫苏醇糖和胰岛素混合液的吸光值。
F ig. 5　Change of the absorbance a t 650 nm of the reaction m ixture
THL1 indicated the absorbance at 650 nm of the m ixture of THL1, DTT and insulin,
the absorbance at 650 nm of the m ixture of DTT and insulin without THL1 as control.
3　讨论
作者以高度自交不亲和系甘蓝 ‘E1’为材料克隆了 THL1基因的全序列 , 首次对 ‘E1’及其杂
交后代 ‘西园四号 ’ (刘东 等 , 2003) 中该基因的全序列进行了比对分析。分析结果证实 THL1基因
由 3个外显子两个内含子组成。两种材料中 THL1基因 DNA和 cDNA序列的同源性分别为 9719%和
9813% , 两者都编码 117个氨基酸 , 同源性为 9911% , 其活性位点序列完全一致。进一步将 THL1
DNA的编码区与非编码区序列比较发现 , 编码区序列高度保守 , 而两个内含子序列和 3′端非翻译区
(UTR) 的保守程度较低 , 说明这些序列比编码区累积变异的程度更高。两条序列中内含子的大小有
较大差异 , 其内含子剪切位点也不完全一致 : ‘E1’中第 1个内含子为 195 bp, 而 ‘西园四号 ’中增
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加到 207 bp, 第 2个内含子的大小基本一致 ; ‘西园四号 ’THL1基因的两个内含子的剪切位点完全
符合典型的 GT2AG规则 (Benjam in, 2000) , 而其亲本 ‘E1’THL1基因第 1个内含子的剪切位点符
合 GT2AG规则 , 第 2个内含子剪切位点 5′端碱基为 GT, 3′端碱基为 AT, 既不符合 GT2AG规则也不
符合 AT2AC规则 (朱玉贤和李毅 , 2002)。一般在含有多个内含子基因的正确表达过程中 , mRNA的
剪切十分重要。两条序列内含子大小不同及其剪切位点变异可能影响该基因表达过程中 mRNA的有
效剪切 , 并最终造成 THL1蛋白在两种材料中表达量的差异。
‘西园四号 ’是杂交种 , ‘E1’为其亲本 , 两种材料中 THL1序列的差异可能是该基因自身的突
变造成的 ; 另一个可能的原因是 ‘E1’与其它材料杂交过程中引起的变异。研究结果表明 , THL1蛋
白参与甘蓝自交不亲和信号传导过程 , 是信号传导的功能因子 (Mazzurco et al. , 2001; Goring et al. ,
2004)。高度自交不亲和性甘蓝 ‘E1’是育种的亲本材料 , 因此从 ‘E1’克隆的 THL1基因的全序列
以及该材料中 THL1基因的生物学功能对于该基因在甘蓝自交不亲和信号传导中作用的阐述更具有说
服力。作者对 ‘E1’中 THL1基因全序列的克隆以及其序列比对分析的工作为进一步从甘蓝柱头等量
cDNA文库中钓取 THL1的启动子 , 通过转基因等技术对 THL1在自交不亲和信号传导中生物学作用的
深入研究奠定了基础。
另外 , 本研究首次构建了 THL1基因的原核表达质粒 pET4311a ( + ) 2THL1, 在大肠杆菌 BL21
中表达出约 74 kD的融合蛋白 , 表达的 THL1纯化回收后用胰岛素检测其活性 , 结果表明 THL1蛋白
有氧化还原活性 , 初步说明了序列克隆的正确性。可望为制备 THL1抗体探针 , 在蛋白质水平上深入
研究 THL1在自交不亲和信号传导中生物学作用奠定了技术基础 , 也可望为对甘蓝自交不亲和性的深
入研究和利用提供新内容。有关 THL1在甘蓝自交不亲和性不同材料中的表达差异及其与 SRK相互作
用的机理的研究正在进行中。
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