全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(5): 809−815 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由中国科学院农业创新基地三期方向项目(KSCX2-YW-N-46-05)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 谢忠奎, E-mail: wxhcas@lzb.ac.cn
第一作者联系方式: E-mail: guozhhong@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2008-11-17; Accepted(接受日期): 2009-02-05.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00809
采用一种新型 RNAi载体培育转基因高直链淀粉马铃薯
郭志鸿 1 王亚军 1 张金文 2 张玉宝 1 王金牛 1 谢忠奎 1,* 陈正华 3
1 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所, 甘肃兰州 730000; 2 甘肃农业大学农学院, 甘肃兰州 730070; 3 甘肃亚盛集团博士后科研工
作站北京分站, 北京 100101
摘 要: 采用 PCR 技术分别克隆 nos 终止子、烟草 axi1 内含子和烟草 ubi.u4 启动子, 亚克隆部分与马铃薯 Sbe1 同
源、部分与 Sbe2同源的融合基因 SIII, 构建具有“ubi.u4启动子—反向 SIII—反向 nos终止子—axi1内含子—正向 nos
终止子”结构的异源 3′端 UTR反向重复序列型 RNAi载体 pCUSNI, 采用农杆菌介导法转化马铃薯品种陇薯 3号、甘
农薯 2 号和大西洋, 获得了 16 个转基因植株, 其中 14 个的块茎直链淀粉含量大幅度增加, 表观直链淀粉含量介于
53.80%~85.33%; 但随着直链淀粉含量的升高, 转基因马铃薯淀粉含量下降。半定量 RT-PCR 分析表明, 在直链淀粉
含量超过 80%的转基因株系中检测不到 Sbe1和 Sbe2基因 mRNA的积累。结果表明, 异源 3′端 UTR反向重复序列型
RNAi载体 pCUSNI能够高频、高效地同时抑制马铃薯 Sbe1和 Sbe2基因的表达, 是一个优良的 RNAi载体。以载体
pCUSNI为基础, 再以植物的其他基因为靶, 只需在 pCUSNI的 BamH I和 Xba I位点之间插入干涉片段替换 SIII即
可完成载体构建, 而不必构建靶标基因的反向重复序列, 使载体制备迅速便捷。
关键词: RNAi; nos终止子; 反向重复序列; 高直链淀粉马铃薯
Development of Transgenic High-Amylose Potato Using a Novel RNAi
Vector
GUO Zhi-Hong1, WANG Ya-Jun1, ZHANG Jin-Wen2, ZHANG Yu-Bao1,WANG Jin-Niu1, XIE Zhong-Kui1,*,
and CHEN Zheng-Hua3
1 Cold and Arid Region’s Environmental and Engineering Institute, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China; 2 College of Agronomy,
Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 3 Postdoctoral Scientific Research Station of Gansu Yasheng Industrial (Group). Co. Ltd.,
Beijing Branch, Beijing 100101, China
Abstract: Amylose from potato starch is of great advantage for applications in many fields because of its higher degree of polym-
erization and lower gelling temperature compared with cereal starch. However, there is no natural mutant of high-amylose potato.
RNAi technique is efficient and specific for plant gene silence but traditional RNAi vector is laborious to prepare. To design an
easily-prepared RNAi vector and to develop transgenic high-amylose potato, PCR technique was employed to amplify the nos
terminator, the tobacco axi1 and the tobacco ubi.u4 promoter, and to sub-clone a fused fragment SIII which is partially homolo-
gous to potato Sbe1 and to Sbe2. Then, a newly designed vector pCUSNI containing “ubi.u4 promotor–antisense SIII–antisense
nos terminator–axi1 gene intron–sense nos terminator” was generated and transformed into potato varieties Longshu 3, Gannong-
shu 2, and Atlantic by Agrobacterium-mediated transformation. Sixteen transgenic potato plants were obtained, and the amylose
content in 14 of them increased significantly, which ranged from 53.80% to 85.33% of total starch. But with the increase of amy-
lose content, starch content decreased in transgenic potato plants. Results of semi-quantitative RT-PCR indicated that the accumu-
lation of mRNAs for Sbe1 and Sbe2 was not detectable in transgenic plants with amylose content higher than 80%, indicating that
the novel RNAi vector pCUSNI was highly efficient for the simultaneous silence of Sbe1 and Sbe2 in potato. The generation of
the RNAi vector pCUSNI makes it much easier to prepare RNAi vectors targeting to other plant genes. The only thing is to insert
a fragment of the target gene or the target genes in restriction sites between BamH I and Xba I in vector pCUSNI to replace SIII
and there is no need to construct an inverted repeat of target gene.
Keywords: RNAi; nos terminator; Inverted repeat; High-amylose potato
810 作 物 学 报 第 35卷

RNA干涉(RNA interference, RNAi)是近年来发
展起来的一种双链 RNA (double-stranded RNA,
dsRNA)介导的高频、高效、高度特异的基因沉默技
术, 已广泛应用于动植物功能基因组研究和代谢途径
分析[1-2], 并且在作物改良中也得到成功应用[3-5]。通常
采用 RNAi 技术进行植物改良时需要构建靶标基因
的反向重复序列结构, 这不但使得载体构建过程十
分繁琐, 并且在同时以两个或两个以上同源性较差
的基因为靶标进行干涉时导致外源基因片段太长 ,
载体较大, 影响后续的遗传转化工作及转基因在后
代中的遗传稳定性, 一定程度上限制了 RNAi 技术
在作物改良中的应用。随着对 RNAi 机制认识的不
断深入, 发现小干涉 RNA (small interference RNA,
siRNA)可以作为引物, 在 RNA 依赖的 RNA 聚合酶
的作用下合成互补 RNA (complement RNA, cRNA),
形成新的 dsRNA, 然后被 Dicer 切割后产生次级
siRNA, 导致 RNA降解区域向mRNA的 5′端延伸[6-9]。
基于 RNAi 的这一特性, 构建异源 3′端非翻译区(终
止子)反向重复序列型 RNAi 载体, 将可以引起反向
重复序列上游基因及与其上游基因同源基因的
mRNA 的降解, 从而实现特定基因的沉默。故一旦
构建了具有异源 3′端非翻译区(终止子)反向重复序
列型 RNAi载体, 在采用 RNAi技术以植物的其他基
因为靶标进行植物改良时将不但可以简化载体构建
过程, 并且能有效缩短外源基因的长度。
马铃薯直链淀粉具有聚合度高、成膜特性好等
突出优点, 在胶片制作、光解膜生产、医药、食品
等领域有着其他来源的直链淀粉不可比拟的优势 ,
但由于马铃薯没有高直链淀粉的天然突变体, 而从
普通马铃薯淀粉中分离直链淀粉成本较高, 限制了
马铃薯直链淀粉的开发和利用。因此, 培育高直链
淀粉含量马铃薯品种, 对于拓展马铃薯淀粉应用领
域, 促进马铃薯产业的发展及提高经济效益将具有
重要的意义。目前已知淀粉分支酶(starch branching
enzyme, SBE)在淀粉生物合成过程中负责催化葡聚
糖链中 α-1,4 糖苷键的断裂, 并于线性链之间引入
α-1,6 糖苷键从而形成分支, 是支链淀粉形成过程中
的关键酶[10]。马铃薯中存在两种同工型的 SBE, 即
SBEI 和 SBEII, 并且两者之间存在较强的代偿作用,
单独抑制其中一种基因的表达并不能有效提高马铃
薯直链淀粉含量[11-12], 而同时抑制 Sbe1和 Sbe2的表
达, 则可以大幅度提高转基因马铃薯的表观直链淀
粉含量[13-14]。本研究拟构建具有植物基因工程中常
用的 nos 终止子的反向重复序列结构的植物表达载
体, 并将部分与马铃薯 Sbe1同源、部分与 Sbe2同源
的融合基因 SIII 插入烟草 ubi.u4 启动子和 nos 终止
子反向重复序列之间, 转化马铃薯, 实现对马铃薯
Sbe1和 Sbe2的同时沉默, 获得高直链淀粉含量的马
铃薯。
1 材料与方法
1.1 试验材料
烟草品种 NC89、马铃薯品种陇薯 3号、甘农薯
2 号和大西洋、载体 pBluescript SK(+)、pBI121、
pRNAiIII[15]大肠杆菌菌株 DH5α 和农杆菌菌株
LBA4404均由亚盛集团博士后科研工作站北京分站
提供, 限制性内切酶、T4 DNA连接酶和高保真DNA
聚合酶购自 TaKaRa公司, RNA提取试剂盒 Concert
Plant RNA Reagent购自 Invitrogen, DNA Marker、凝
胶回收试剂盒和用于半定量 RT-PCR 的 Taq Mas-
terMix 购自 TIANGEN 公司, 尼龙膜(Nylon Mem-
brane, positive geladen)和 Southern blot探针标记及
检测系统均购自 Roche, 直链淀粉和支链淀粉标样
购自 Sigma。其他试剂购自北京化学试剂公司, 均为
国产分析纯。
1.2 基因克隆
根据 GenBank 中公布的 pBI121 的序列(GI：
19569229)设计扩增 nos终止子的引物 nosu (5′-gcgg
ccgcGATCGTTCAAACATTTGGCAATA-3′)和 nosl
(5′-tctagaTTCCCGATCTAGTAACATAGATGACA-3′),
预期扩增片段大小为 258 bp。为方便后续载体构建,
在 nosu的 5′端引入 Not I位点, nosl的 5′端引入 Xba I
位点(引物序列中小写字母部分为添加的限制性酶
切位点)。以质粒 pBI121为模板, nosu和 nosl为引物,
PCR扩增 nos终止子。根据 axi1基因序列(GI: 559920)
设计用于扩增其内含子的引物 tinu (5′-gcggccgcGTG
GTCCATTTCAATTTTGTT-3′)和 tinl (5′-gagctcCTGC
AAATGTTACAACAAGGCT-3′), (引物序列中小写
字母分别表示添加的 Not I、Sac I限制性酶切位点),
预期扩增片段大小为 182 bp。采用 CTAB法提取烟
草叶片基因组 DNA, 以 tinu 和 tinl 为引物, 以烟草
基因组 DNA为模板, PCR扩增烟草 axi1内含子。参
照文献[16]合成扩增烟草 ubi.u4 启动子的引物 ubi1
(5′-aagcttGGAGGCTAACTACGTTAGAGC-3′)和 ubi2
(5′-ggatccTCTGTATATACAGAAAAGGTT-3′), 小写
字母分别表示引入的 Hind III和 BamH I限制性酶切
第 5期 郭志鸿等: 采用一种新型 RNAi载体培育转基因高直链淀粉马铃薯 811


位点, 以烟草叶片基因组 DNA为模板扩增 ubi.u4启
动子; 参照文献[15]设计亚克隆融合片段 SIII的引物
sal (5′-ggatccGAACGAGGACGATCATCATACCA- 3′)
和 sbu (5′-tctagaTGATGTTGACAGTAAGCCAGTC-
3′), 小写字母分别为 BamH I和 Xba I限制性酶切位
点。然后采用标准分子克隆技术将扩增到的 4 个片
段依次插入载体 pBluescript SK+的 Xba I与 Not I、
Not I与 Sac I、BamH I与 Xba I及 Hind III与 BamH
I 位点之间, 送交基因测序公司进行序列测定, 序列
分析正确的载体命名为 pUSNI。
1.3 RNAi载体构建
将 pUSNI经 Hind III/Sac I消化后产生的小片段
插入植物表达载体 pBI121 的相应限制性位点之间
得到载体 pBIUSIN, 再将 pBIUSIN经 Hind III/EcoR
I 消化后产生的小片段插入植物表达载体 pCAMBIA-
1300的相应位点之间, 得到最终的干涉载体 pCUSNI。
1.4 马铃薯遗传转化及植株再生
采用直接导入法 [17]将 pCUSNI 导入农杆菌
LBA4404, 获得用于马铃薯遗传转化的农杆菌工程
菌。分别以陇薯 3 号、甘农薯 2 号和大西洋的试管
苗茎段为受体材料, 通过农杆菌介导法进行转化[18]。
当获得的潮霉素抗性苗长到 2 cm左右时, 切下转入
生根培养基进行生根培养。
1.5 转基因植株的筛选
采用 CTAB 法[19] 提取转化抗性再生苗叶片基
因组 DNA。以提取的基因组 DNA 为模板, 以 sbu
为正向引物, 以 sal为反向引物进行 PCR检测, 初步
筛选得到转基因植株 , 然后再对这些植株进行
Souhern 杂交, 将 PCR 检测呈阳性的马铃薯植株基
因组 DNA经 Sac I过夜消化后用 0.8%琼脂糖凝胶进
行电泳分离, 再用 20×SSC转移到尼龙膜, 80℃固定
2 h后与探针杂交。探针制备以纯化的 ubi.u4启动子
为模板, 采用随机引物标记法进行标记, 杂交及检
测的其他步骤均按照 DIG High Prime DNA Labeling
and Detection Starter Kit I所述方法进行。
1.6 转基因植株的块茎淀粉含量测定
采用组织快繁法, 将筛选出的阳性转基因植株
扩繁并移栽到温室中, 待薯块成熟后采用双波长法
[20] 测定淀粉和直链淀粉含量 , 计算直链淀粉占淀
粉总量的百分率。直链淀粉含量测定采用的波长为
λ1=500 nm和 λ2=600 nm, 支链淀粉为 λ3=700 nm和
λ4=590 nm。每个样品测定 3次, 取平均值。
1.7 半定量 RT-PCR分析
提取各转基因植株试管薯总 RNA, 进行半定量
RT-PCR分析, 具体方法参照文献[15]。
2 结果与分析
2.1 基因克隆
以 nosu 和 nosl 为引物, 以 pBI121 质粒为模板
进行 PCR扩增, 经琼脂糖凝胶电泳在约 250 bp处出
现特异条带(图 1, 泳道 1), 大小与 nos相符; 以 tinu
和 tinl为引物, 以烟草叶片基因组 DNA为模板进行
PCR扩增, 得到约 200 bp的特异条带(图 1, 泳道 2),
大小与 axi1 内含子相符; 以 sal 和 sbu 为引物, 以
pCUSNI 质粒为模板进行 PCR 扩增, 产生约 700 bp
的特异条带(图 1, 泳道 3), 大小与融合基因 SIII 相
符; 以 ubi1和 ubi2为引物, 以烟草叶片基因组 DNA
为模板进行 PCR扩增, 产生 800 bp左右的特异条带
(图 1, 泳道 4), 大小与 ubi.u4 启动子相符。序列分
析表明, 这 4 个扩增片段的核苷酸序列均与预期一
致, 并且插入的顺序与方向也与设计的一致, 说明
已成功克隆了 nos终止子、烟草 axi1内含子、融合基
因 SIII及烟草 ubi.u4启动子, 并获得了含有“ubi.u4启
动子—反向 SIII—反向 nos 终止子—axi1 内含子”的
克隆载体 pUSNI。



图 1 基因 PCR扩增
Fig. 1 PCR amplification of genes
M：DNA marker III; 1：nos终止子; 2：axi1内含子;
3：SIII; 4：ubi.u4启动子。
M: DNA marker III; 1: nos terminator; 2: axi1 intron;
3: SIII; 4: ubi.u4 promoter.

2.2 pCUSNI载体鉴定
构建的 pCUSNI载体分别以 nosu和 nosl及 tinu
和 tinl 为引物进行 PCR 扩增, 分别在约 250 bp (图
2, 泳道 1)及 200 bp左右(图 2, 泳道 2)处出现特异条
带, 说明载体中连接有 nos终止子和 axi1内含子; 经
EcoR I/Sac I 消化, 在 250 bp 左右处出现特异条带
(图 3, 泳道 4), 以 tinu和 nosl为引物进行 PCR扩增,
812 作 物 学 报 第 35卷

出现 450 bp左右的特异条带(图 2, 泳道 3), 说明内
含子 axi1 下游端含有正向的 nos 终止子; 以 tinl 和
nosu为引物扩增, 也在 450 bp左右处出现特异条带
(图 2, 泳道 4), 说明 axi1 内含子上游端连接有反向
的 nos 终止子; 以 sbu 和 sal 为引物进行 PCR 扩增,
在 710 bp左右处出现特异条带(图 2, 泳道 5), 说明
干涉片段 SIII完整无缺; 经 BamH I/ Sac I消化, 在
1 200 bp左右处出现特异条带(图 3, 泳道 3), 与“融
合基因 SIII—反向 nos 终止子—axi1 内含子”的大小
相符。分别经 Hind III/ BamH I消化及以 ubi1和 ubi2
为引物进行 PCR扩增, 均产生约 800 bp的特异条带
(图 3, 泳道 2; 图 2, 泳道 6), 说明 ubi.u4 启动子也
以正确顺序和方向存在于载体中。经 Hind III/ EcoR
I消化, 产生了 2 200 bp左右的特异条带(图 3, 泳道
1), 与“ubi.u4启动子—融合基因 SIII—反向 nos终止
子—axi1内含子—正向 nos终止子”大小相符。以上
鉴定充分说明成功构建了以马铃薯 Sbe1 和 Sbe2 为
靶标的异源 3′端 UTR 反向重复序列型 RNAi 载体
pCUSNI, 其表达框架结构如图 4所示。
2.3 马铃薯遗传转化及转基因植株筛选
通过对陇薯 3 号、甘农薯 2 号和大西洋试管苗
茎段的转化, 获得 44个潮霉素抗性再生株系。对其
进行 PCR鉴定, 结果有 16个再生株系在 800 bp左
右处出现特异条带, 大小与 ubi.u4 启动子相符, 而
作为阴性对照的陇薯 3号则未出现相应的条带(图 5),
初步说明融合基因 SIII 已整合到受体材料的基因组
中。Southern 杂交结果进一步证明这些植株是阳性
转基因植株, 并且每个转基因植株只整合了 1~2 拷
贝的外源基因(图 6)。16个转基因植株中, 来自陇薯
3 号的有 9 个(3A1~3A8 和 3A15), 来自甘农薯 2 号
的有 4 个(3A9~3A12), 来自大西洋的有 3 个(3A13~
3A14和 A16)。
2.4 转基因马铃薯直链淀粉含量分析
表 1结果表明, 16个转基因株系中有 14个的直
链淀粉含量大幅度升高, 总淀粉中直链淀粉含量最
低为 53.80%, 最高为 85.33%, 均远远高于转基因受
体亲本; 直链淀粉含量大幅度增加的转基因株系占
了转基因株系总数的 87.5%。其中直链淀粉含量超
过 80%的株系有 4 个, 来自陇薯 3 号的有 2 个(3A3
和 3A6), 来自甘农薯 2号的有 1个(3A11), 来自大西
洋的有 1个(3A14)。直链淀粉含量超过 80%的株系



图 2 pCUSNI PCR检测
Fig. 2 PCR detection of pCUSNI
M：DNA marker III; 1：以 nosu+nosl为引物扩增; 2：以 tinu+tinl
为引物扩增; 3：以 tinu+nosl为引物扩增; 4：以 tinl+nosu为引物
扩增; 5：以 sbu+sal为引物扩增; 6：以 ubi1+ubi2为引物扩增。
M: DNA marker III; 1: amplified with nosu+nosl; 2: amplified with
tinu+tinl; 3: amplif ied with tinu+nosl; 4: amplif ied with
tinl+nosu; 5: amplified with sbu+sal; 6: amplified with ubi1+ubi2.



图 3 pCUSNI酶切分析
Fig. 3 Restriction analysis of pCUSNI
M: DNA marker III; 1：Hind III/ EcoR I消化; 2：Hind III/BamH I
消化; 3：BamH I/ Sac I消化; 4：EcoR I/Sac I消化。
M: DNA marker III; 1: digested by Hind III/ EcoR I; 2: digested by
Hind III/BamH I; 3: digested by BamH I/ Sac I; 4: digested by EcoR
I/Sac I.



图 4 pCUSNI表达框架示意图
Fig. 4 Schematic diagram of pCUSNI expressing frame
RB：右边界; ubi P：烟草 ubi.u4启动子; anti-SIII：反向 SIII; anost：反向 nos终止子; Tin：烟草 axi1内含子; nost：正向 nos终止子; CaMV
35S：CaMV35S启动子; HPTII：潮霉素磷酸转移酶基因; poly A：CaMV 35S终止子; LB：左边界。
RB: right border; ubi P: tobacco ubi.u4 promoter; anti-SIII: SIII in antisense oritention; anost: nos terminator in antisense oritention; Tin:
tobacco axi1 intron; CaMV35S: CaMV35S promoter; NOS P: nos promoter; HPT II: hygromycine phosphotransferase gene; poly A: CaMV
35S terminator; LB: left border.
(SY)
第 5期 郭志鸿等: 采用一种新型 RNAi载体培育转基因高直链淀粉马铃薯 813




图 5 Hyg抗性再生植株的 PCR检测
Fig. 5 PCR detection of regenerated plants resistant to Hyg
M：DNA marker V; 1~6：再生植株; 7：陇薯 3号。
M: DNA marker V; 1–6: regenerated plants; 7: Longshu 3.



图 6 转基因植株 Southern杂交
Fig. 6 Southern blotting of transgenic plants
1: 3A3; 2: 3A5; 3: 3A10; 4: 3A11; 5: 3A12; 6: 3A13;
7: 3A15; 8: Longshu 3.

表 1 转基因植株直链淀粉和淀粉糖含量
Table 1 The amylose and starch content in transgenic plants
品种(系)
Variety (line)
直链淀粉含量
Amylose content (%)
淀粉含量
Starch content (%)
陇薯 3号
Longshu 3
23.65±2.35 21.62±1.96
3A1 74.30±2.49 11.92±2.11
3A2 68.20±1.95 14.74±2.36
3A3 85.33±3.80 8.78±2.68
3A4 74.26±2.69 11.01±1.89
3A5 55.86±3.00 16.37±3.02
3A6 81.30±3.03 9.74±2.22
3A7 79.81±1.70 11.32±1.59
3A8 66.33±2.74 15.75±2.38
3A15 23.22±2.86 22.43±1.98
甘农薯 2号
Gannongshu 2
23.75±3.36 20.11±2.26
3A9 69.83±2.55 15.04±2.27
3A10 79.96±3.11 10.34±3.37
3A11 85.24±3.58 9.11±1.85
3A12 53.80±3.06 10.74±2.01
大西洋 Atlantic 22.16±1.74 18.53±1.75
3A13 68.12±2.41 15.79±2.26
3A14 83.33±3.29 8.91±1.29
3A16 21.99±2.42 17.98±2.19
直链淀粉含量为占总淀粉的百分率。
Amylose content is the percentage to total starch.

占转基因株系的 25%。但转基因马铃薯随着直链淀
粉含量的升高, 淀粉含量下降, 并且直链淀粉增加
的幅度越大, 淀粉含量下降的幅度也越大。
2.5 转基因株系中 Sbe基因的表达水平
各转基因株系 Sbe1和 Sbe2基因 mRNA积累量
的分析结果表明 , 用内标引物从各株系都扩增到
800 bp左右亮度相当的条带, 与预期的 Actin基因片
段大小相符, 说明用于 PCR扩增的模板量基本一致;
作为对照的陇薯 3号中可检测到 Sbe1和 Sbe2 mRNA
(图 7, 泳道 1)的积累, 但在直链淀粉含量超过 80%
或接近 80%的株系中检测不到其积累(图 7, 泳道 2~
6), 说明在这些株系中编码 SBE 两种亚型的基因
mRNA 积累量极低, 在直链淀粉含量没有明显变化
及变化幅度较小的转基因株系中可检测到 Sbe1 和
Sbe2 (图 7, 泳道 7~10)积累, 说明转基因植株中直链
淀粉含量升高是由于 Sbe1和 Sbe2表达受抑制引起的。



图 7 半定量 RT-PCR检测 Sbe1和 Sbe2 mRNA的积累
Fig. 7 Semi-quantitative RT-PCR detection of mRNA derived
from Sbe1 and Sbe2
M: DNA marker III; 1: Longshu 3; 2: 3A3; 3: 3A6; 4: 3A11; 5:
3A14; 6: 3A10; 7: 3A15; 8: 3A16; 9: 3A5; 10: 3A12.
3 讨论
异源 3′端 UTR 反向重复型 RNAi 载体是基于
dsRNA能够引起其 5′端序列及与其 5′端序列同源基
因的沉默(即 RNAi 能向 dsRNA 5′端延伸)的原理设
计的。本研究构建了具有“ubi.u4 启动子—反向 SII
—反向 nos 终止子—axi1 基因内含子—nos 终止子”
结构的载体, 由于反向的 nos 终止子不具备终止转
录的功能, 故转基因植物中外源转基因经转录后就
形成了具有“反向 SIII—反向 nos 终止子—axi1 内含
子—nos 终止子”结构的 mRNA, 然后 nos 终止子通
过链内退火形成 dsRNA, 激发 RNAi 机制, 产生小
814 作 物 学 报 第 35卷

siRNA, 然后以 siRNA为引物, 在 RNA依赖的 RNA
聚合酶作用下形成反向 SIII 序列的互补 RNA, 使反
向 SIII 区域也出现双链结构, 进而导致与反向 SIII
同源的 mRNA 的降解。异源 3′端 UTR 反向重复型
RNAi 载体作为一个新型的高频、高效的干涉载体,
具有其独到的优势。首先, 构建这种载体十分方便。
一旦构建了含有 3′UTR 的反向重复序列的基本载体,
在针对特定基因构建干涉载体时只需将待干涉基因
的部分片段插入到 3′端UTR的反向重复序列的上游
(5′端), 就可以获得最终的干涉载体。其次, 这类载
体中反向重复序列的选择可以使用长度较小的 3′端
UTR, 从而为在载体中插入较大的干涉片段实现对
多个基因的沉默提供方便。本研究选择了的植物基
因工程中常用的但长度比较小的 nos 终止子, 构建
了其反向重复序列, 并在该反向重复序列之间引入
了一个功能性的内含子 axi1, 将其置于双子叶植物
中的强启动子烟草 ubi.u4 启动子的控制之下, 以保
证载体具有良好干涉效果。以我们构建的具有 nos
终止子反向重复序列结构的新型RNAi载体 pCUSNI
为基础, 在针对特定的植物基因为靶标构建 RNAi
载体时, 只需在该载体 BamH I和 Xba I限制性酶切
位点之间插入与靶标基因同源的序列即可, 而不必
构建靶标基因的反向重复序列。由于 nos 终止子和
引入的烟草 axi1 基因内含子的片段都比较小, 构建
的内含子连接的 nos 终止子反向重复序列的总长度
不超过 800 bp, 并且已经包括外源基因阅读框架的
终止子, 这为插入更大的干涉片段实现对多个基因
的沉默提供了方便。由本研究结果可见, 在 16个转
pCUSNI的转基因株系中, 14个株系的 Sbe1和 Sbe2
基因的表达均得到有效抑制, 直链淀粉含量大幅度
增加, 占了总转基因株系的 87.5%, 其中直链淀粉
含量超过 80%的转基因株系为 4 株, 占总转基因株
系的 25%, 说明以 nos 终止子为反向重复序列的异
源 3′端 UTR反向重复序列型 RNAi载体可以高频、
高效地沉默两个非同源基因 Sbe1和 Sbe2的表达, 是
作物改良和植物反向遗传学研究中理想的 RNAi
载体。
本研究通过同时抑制 Sbe1和 Sbe2的表达, 实现
了转基因马铃薯直链淀粉含量的大幅度增加。外源
基因整合到受体材料的基因组中的拷贝数较低(为
1~2 个拷贝), 并且存在 2 个拷贝的转基因株系直链
淀粉含量升高的幅度大, 而直链淀粉含量升高幅度
相对较小或没有明显升高的则为 1 个拷贝, 一定程
度上说明外源转基因的干涉效果存在剂量效应。导
致外源基因拷贝数较低的原因一方面可能与农杆菌
介导的遗传转化的特性有关, 另一方面由于 RNA干
涉效果存在剂量效应, 随着外源基因拷贝数的增加,
Sbe1 和 Sbe2 表达被抑制的程度增强。有报道显示,
高效沉默 Sbe 基因表达的转基因马铃薯植株生长缓
慢, 而如果完全抑制 Sbe 的表达则影响植株再生[14],
故得到的转基因植株均是低拷贝的。通过抑制 Sbe1
和 Sbe2表达提高了转基因植株的直链淀粉含量, 但
淀粉总量却有所下降, 这一方面可能是抑制支链淀
粉的合成, 导致淀粉总量下降所致; 另一方面可能
与高直链淀粉马铃薯块茎的含水量增加有关, 有报
道表明转基因高直链淀粉马铃薯块茎含水量远高于
受体亲本[14]。
4 结论
异源 3′端 UTR 反向重复序列型 RNAi 载体
pCUSNI是一个高频、高效的新型 RNAi载体, 利用
该载体抑制 Sbe 基因表达能够大幅度提高转基因马
铃薯的直链淀粉含量。
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