全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(1): 4047 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2006AA10Z111), 转基因生物新品种培育重大专项(2008ZX08009-003)和教育部 111
项目(B08025)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 郭旺珍, E-mail: moelab@njau.edu.cn
Received(收稿日期): 2010-06-10; Accepted(接受日期): 2010-08-04.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00040
两个棉花-葡聚糖酶新基因的结构与表达特征分析
董 佳 蔡彩平 王立科 赵 亮 张天真 郭旺珍*
南京农业大学 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095
摘 要: β-葡聚糖酶是一类能降解 β-葡聚糖的水解酶。本研究分别通过电子克隆和棉纤维发育 cDNA 文库筛选法克
隆到 2个棉花 β-葡聚糖酶新基因, 内切-1,4-β-葡聚糖酶基因(GhEG, GenBank登录号为 HM462003)和 1,3-β-葡聚糖酶
基因(GhGLU, GenBank登录号为 HM462004)。GhEG全长 ORF为 1 581 bp, 编码 526个氨基酸残基。GhGLU全长
ORF为 1 410 bp, 编码 469个氨基酸残基。基因组水平分析表明, GhEG含 5个内含子和 6个外显子, 而 GhGLU无内
含子, 仅 1个外显子。新克隆的 2个基因在二倍体棉种非洲棉和雷蒙德氏棉中含 1个拷贝, 而在四倍体陆地棉和海岛
棉中存在 2 个拷贝。通过开发 SNP 标记分别将 GhEG 和 GhGLU 在四倍体中的 1 个拷贝定位在第 19 染色体和第 4
染色体上。Q-PCR表达分析表明, GhEG在根、茎、叶中表达水平很低, 而在纤维伸长期优势表达, 在 15 DPA和 20 DPA
纤维中, 该基因在海岛棉海 7124中的转录本显著高于陆地棉 TM-1。GhGLU在根、茎、叶及纤维发育不同时期均有
表达, 属于组成性表达基因, 特别在根、纤维发育初始期和伸长后期优势表达, 且表达水平在陆地棉 TM-1和海岛棉
海 7124间也有显著差异。
关键词: 内切-1,4-β-葡聚糖酶; 1,3-β-葡聚糖酶; 结构; 表达
Structure and Expression Analysis of Two Novel Genes Encoding β-glucanase
in Cotton
DONG Jia, CAI Cai-Ping, WANG Li-Ke, ZHAO Liang, ZHANG Tian-Zhen, and GUO Wang-Zhen*
National Key Laboratory of Crop Genetics & Germplasm Enhancement / Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: The β-glucanase is a type of enzyme degrading β-glucan. Cloning and expression analysis of genes encoding
β-glucanase can provide information in both gene resources and breeding utilization for improvement of cotton fiber quality. The
two novel genes encoding β-glucanase, designated as GhEG (GenBank accession No. HM462003) and GhGLU (GenBank acces-
sion No. HM462004), were obtained by sillico cloning and cDNA library screening, respectively. GhEG contained an open read-
ing frame of 1 581 bp that encoded a polypeptide of 526 amino acids, and GhGLU contained an open reading frame of 1 410 bp
that encoded a polypeptide of 469 amino acids. The genome sequence indicated that GhEG has five introns and six exons, while
GhGLU has no intron and only one exon. The two genes all had one copy in diploid cotton species G. herbaceum and G. raimondii
and two copies in tetraploid cotton species G. hirsutum acc. TM-1 and G. barbadense cv. Hai 7124, respectively. One of GhEG or
GhGLU homoelogs in tetraploid was located on chromosome 19 and chromosome 4 by developing SNP marker, respectively.
Q-PCR expression analysis showed that GhEG was expressed specifically in fiber elongation and had obvious difference between
TM-1 and Hai7124 at the fiber elongation period of 15 DPA and 20 DPA, almost no transcripts were detected in root, stem and
leaf. GhGLU was expressed in all tissues, dominantly in root, at fiber initiation and fiber late elongation phase, with obvious dif-
ference between TM-1 and Hai7124.
Keywords: GhEG; GhGLU; Structure; Expression
β-葡聚糖酶是一类能降解 β-葡聚糖的水解酶类
总称。包括内切和外切 β-1,3葡聚糖酶、β-(1,3-1,4)-
葡聚糖酶、内切和外切 β-1,4-葡聚糖酶等。内切-
1,4-β-葡聚糖酶(EGases), 俗称纤维素酶, 是一类普
遍存在于原核生物和真核生物体内的水解酶, 它可
以催化水解具有 1,4-β-葡聚糖主链的多聚糖, 以随
第 1期 董 佳等: 两个棉花-葡聚糖酶新基因的结构与表达特征分析 41


机的作用方式将多聚糖降解成为糊精或寡聚糖[1-2]。
一些 EGases 是在果实成熟或叶片脱落过程中特异
表达, 而另一些 EGases在正在伸展的细胞中高量表
达, 这表明 EGases对植物体的生长发育可能具有广
泛的作用[3-4]。已知的 β-1,3-葡聚糖酶均属于糖基水
解酶第十七家族, 其成员具有共同的氨基酸序列结
构[5]。β-1,3-葡聚糖酶分为外切酶和内切酶, 目前主
要研究的是内切酶。β-1,3-葡聚糖酶在植物的细胞分
裂、小孢子发生、花粉萌发、育性、韧皮部胼胝质
去除、受精、种子萌芽及生长调控等过程中都具有
作用[6]。
棉纤维是胚珠外珠被单个表皮细胞分化发育而
成, 是一种优良的天然纤维。其形成和发育可分为
起始分化、纤维伸长或初生壁形成、次生壁合成及
脱水成熟 4 个时期。这 4 个时期分隔明显但有部分
重叠[7]。起始分化一般在开花前 3 d到开花当天(–3~0
DPA), 纤维伸长在 1~25 DPA, 次生壁合成在 16~40
DPA, 脱水成熟在 40~50 DPA[8-9]。据估计, 棉花纤
维发育过程中有上千特异基因表达, 但到目前为止,
仅有少数基因被分离鉴定[10]。已克隆到的 β-葡聚糖
酶基因在棉纤维中优势表达[11], 也有一些在其他组
织、器官中表达[12-13]。
本研究利用电子克隆和棉纤维发育 cDNA 文库
筛选法分别获得 2 个与棉花纤维发育相关的 β-葡聚
糖酶新基因, 并对其基因组结构和表达特征进行了
系统研究, 研究结果有望为棉纤维品质改良和提高
棉花抗病性提供基因资源。
1 材料与方法
1.1 试验材料
2008—2009年于南京农业大学网室种植陆地棉
遗传标准系 TM-1 和海岛棉海 7124。在植株生长盛
花期, 分别采集 2个材料的 0 DPA和 5 DPA的胚珠
纤维混合物, 10、15和 20 DPA的纤维, 于液氮中速
冻, 70℃冰箱保存。根、茎和叶样品取自有五、六
片真叶的棉花幼苗。
1.2 目的基因片段的获得
基于遗传标准系TM-1和海岛棉海7124基因芯片
在纤维发育 15 DPA 的竞争杂交结果, 获得一个海
7124优势表达 EST序列(NCBI登录号为CM122B12)。
以该 EST 序列为探针, 对陆地棉的 dbEST 数据库
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, 2009)进行 tBlastn 比
对。将获得的 EST序列用 CAP3拼接后形成 Contig,
然后以 Contig 为探针, 再次采用 Blastn 方式进行检
索, 直至检出的 Contig 不能再延伸。对电子拼接获
得的序列进行 ORF预测、Blastp和多重序列比较将
其分类命名; 本研究克隆的另一个新基因是根据本
实验室前人整理的棉花纤维发育 cDNA 文库中的测
序结果, 选取 1 个可能与糖代谢相关的 cDNA 克隆
进行研究, 测序并获得 1条 ORF完整的序列。根据
目标序列生物信息学分析结果, 分别设计全长 ORF
引物和 Q-PCR 引物进行目标基因全长 ORF 验证和
表达特征分析。表 1 示本研究中涉及的所有引物信
息。所有引物合成和 DNA序列测定由南京金斯瑞生

表 1 本研究所用引物
Table 1 Primer pairs used in this study
基因名称
Gene name
引物编号
Primer No.
引物序列
Primer sequence (5–3)
用途
Purpose
GhEG Y3775F/R TTTTACGACTGTCCGATGAGA 全长引物 Primer for full-length ORF amplification
TAGGGAAGCGTGGTATTGA
Y3561F CATCTAACTCGGCATACTCAAGCAC RT-PCR引物 RT-PCR primer
Y3562R GCCACATTAGGATTCGGTTCAG
Y3476F/R CAACCGAATCCTAATGTGGC 定量引物 Q-PCR primer
GCAGATGAGGTAGTGACCAAAC
Y5612F AATGAGCATACTTTTGTTCATAGTCGC SNP引物 SNP primer
Y5613R GAGTTAGATGTCTTAAACACCAGAGATGC

GhGLU Y5615F/R AAAACAGCGTTCAAATCCTC 全长引物 Primer for full-length ORF amplification
TTCTCCACTTCAATGCCCT
Y2377F/R TACTTTCATCCACCGCTGCT 定量/RT-PCR引物 Q-PCR and RT-PCR primer
CGTTACCCGAATCTACTACACC
Y6099F GAAAGCCGATGAGAAGAAGTTACAATCA SNP引物 SNP primer
Y6100R AATGCCCTGTTGGAAACTCACAACT
42 作 物 学 报 第 37卷

物科技有限公司完成。
1.3 序列的生物信息学分析
利用 NCBI中 Blast程序在蛋白数据库中进行相
似性搜索 , 获得测序片段的相关功能信息 ; 利用
DNAstar (Ver. 5.01)软件完成 ORF, 等电点和分子量
预测; ClustalX (Ver. 1.81)软件进行多重序列比对和
进化树分析。
1.4 不同棉种基因组序列分析
利用扩增基因全长引物在陆地棉 TM-1、海岛棉
海 7124、雷蒙德氏棉(G. raimondii)和阿非利加棉(G.
herbaceum)基因组中分别扩增这 2 个基因。PCR 产
物回收, 连接转化, 对每一基因分别从来自 TM-1和
海 7124 中的阳性克隆中随机挑选 10 个克隆, 从雷
蒙德氏棉和阿非利加棉的阳性克隆中随机挑选 3 个
克隆, 进行测序, 分别进行目标基因在不同棉种中
的拷贝数和同源基因的确定[14]。进一步利用 MEGA
软件(http://www.megasoftware.net/)分析该基因在四
倍体中亚基因组来源。
1.5 基因的染色体定位
分别根据 2个基因在 TM-1和海 7124中基因序
列差异, 开发 SNP标记, 检测 TM-1和海 7124间分
子差异及在其 140 个单株的 BC1作图群体中的分离
情况, 进一步利用 JoinMap 软件[15]将多态位点整合
到 Guo 等[16]构建的海陆遗传图谱上, 完成基因的染
色体定位。
1.6 总 RNA和 DNA的提取
采用改进的热硼酸法提取 10、15和 20 DPA的
纤维组织[17], 采用 CTAB-酸酚法[18]提取棉花 TM-1
0 DPA 和 5 DPA 的胚珠和纤维总 RNA 和棉花 5~6
片真叶时的根、茎和叶总 RNA; 采用 CTAB 法[19]
从新鲜幼嫩的叶片提取 DNA。
1.7 实时荧光定量 RT-PCR反应
实时荧光定量 PCR在 iCycler iQ5荧光定量 PCR
仪(Bio-Rad, USA)上进行, 棉花内参基因 EF1α作为
平行反应被扩增。Bio-Rad公司的 SYBR Green I (SGI)
是一种与双链 DNA 特异结合的荧光染料, 能显示
PCR反应中扩增的 DNA。反应组分加在专用的定量
PCR 管中, 反应体系含 10×PCR buffer 2.0 L、25
mmol L1 MgCl2 1.2 L、10 mmol L1 dNTP Mix 0.4
μL、10 mol L1正向引物和反向引物各 1 L、cDNA
第一链模板 1 L和 rTaq酶 (5 U L1, TaKaRa) 0.1
L, 加无菌超纯水至 20 L; 扩增条件为 95℃预变
性 2 min; 94℃变性 45 s, 55~60℃退火 30 s, 72℃延伸
30 s, 40个循环; 72℃延伸 10 min, 以熔解曲线结束。
计算公式[20]如下, 目的基因相对表达量=2–ΔCt; ΔCt=
Ct目的基因CtEF1α。
2 结果与分析
2.1 GhEG和 GhGLU全长 cDNA获得及其序列
分析
按 1.2方法, 获得一个新的 cDNA全长基因。该
全长序列与已报道的蓖麻(Ricinus communis)和拟南
芥(Arabidopsis thaliana)的内切-1,4-β-葡聚糖酶(EG)
分别有 85%和 82%的同源性, 因此将该基因命名为
GhEG, GenBank登录号为 HM462003。另 1个可能
与糖代谢相关的 cDNA 克隆其全长序列与已报道的
枣(Ziziphus jujuba)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的
β-1,3-葡聚糖酶基因(GLU)都有 63%的同源性, 因此
将该基因命名为 GhGLU, GenBank 登录号为
HM462004。
用 EditSeq软件分别对 GhEG和 GhGLU cDNA
序列进行分析, 结果显示 GhEG 和 GhGLU 的 ORF
分别为 1 581 bp/1 410 bp, 分别编码 526个和 469个
氨基酸残基。用 Expasy pI/Mw程序对这 2个基因氨
基酸序列进行一级结构的预测发现 , GhEG 和
GhGLU理论上的等电点分别为 6.38和 5.31, 分子量
分别为 56.94 和 50.30 kD。进一步对其蛋白质结构
预测分析发现, GhEG和 GhGLU均编码的是一个蛋
白前体, 它们在被合成之后将通过分泌途径运输到
其作用部位或被分泌到细胞外。
2.2 GhEG和 GhGLU系统进化分析
为进一步明确棉花 GhEG 和 GhGLU 与已报道
的棉花和其他植物中亲缘关系相近的基因间进化关
系, 从 NCBI 网站中搜索了陆地棉(Gossypium hir-
sutum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza
sativa)、蓖麻(Ricinus communis)、大豆(Glycine max)、
枣(Ziziphus jujube)、烟草(Nicotiana tabacum)等植物
中 同 源 性 高 的 基 因 , 同 时 也 加 入 从 海 岛 棉
(Gossypium barbadense)中克隆的 GbGLU[13], 与本
实验新克隆的内切-1,4-β-葡聚糖酶基因和 1,3-β-葡
聚糖酶基因分别进行氨基酸的多重序列比较和进化
树分析。结果表明, 来源于上述植物中的内切-1,4-β-
葡聚糖酶和 1,3-β-葡聚糖酶基因都含有与棉花
GhEG和 GhGLU相同的保守结构域, 新克隆的棉花
GhEG和 GhGLU均与蓖麻的同源基因亲缘关系最近,
而与棉花中已报道的几个内切-1,4-β-葡聚糖酶基因
第 1期 董 佳等: 两个棉花-葡聚糖酶新基因的结构与表达特征分析 43


和 1,3-β-葡聚糖酶基因亲缘关系均较远。图 1~图 2
和图 3~图 4 分别表示不同来源内切-1,4-β-葡聚糖酶
和 1,3-β-葡聚糖酶基因编码氨基酸多重序列比较和
进化树分析结果。

图 1 棉花 GhEG与来源于其他植物的外切 β-1,4-葡聚糖酶的序列比对
Fig. 1 Multiple alignment of GhEG with glucanases from other plants

2.3 GhEG 和 GhGLU 在不同棉种基因组序列分
析
GhEG和 GhGLU的基因组全长分别为 3 170
bp/1 820 bp, GhEG有 5 个内含子 , 6 个外显子 ; 而
GhGLU属于单外显子。它们在二倍体棉种中仅出现
一种序列类型, 而在四倍体棉种中出现 2 种序列类
型。结合序列聚类分析结果, 推测它们在二倍体棉
种中均为一个拷贝, 而在四倍体棉种中有 2 个拷贝,
且在四倍体棉种中均呈亚基因组独立进化模式(图
5)。多外显子的 GhEG 在不同棉种中其剪切位点均
完全一致。
2.4 GhEG和 GhGLU基因的染色体定位
分别根据 GhEG和 GhGLU基因组序列在 TM-1
和海 7124 棉种间的 SNP 位点差异 , 开发仅在海
7124中有扩增产物的 SNAP引物。进一步用差异引
物检测其在 BC1 作图群体的多态性, 获得其多态分
离信息。利用 JoinMap 3.0作图软件与本实验室的骨
架标记整合, 将GhEG和GhGLU在四倍体棉种中的
44 作 物 学 报 第 37卷

一个拷贝分别定位在第 19 染色体和第 4 染色体上
(图 6)。由于序列的一致性, 不能在 TM-1和海 7124
棉种间开发出 GhEG 和 GhGLU 另一个拷贝多态的
分子标记, 无法完成其染色体定位, 但根据四倍体
棉种部分同源染色体特性和其在不同棉种基因组序
列分析结果, 推测它们的另一个拷贝应该分别在相
应的部分同源群第 5染色体和第 22染色体上。
2.5 GhEG和 GhGLU的 Q-PCR分析
分别以陆地棉遗传标准系 TM-1 和海岛棉海
7124的幼根、茎、叶、0和 5 DPA胚珠纤维混合物,
10、15、20 DPA 纤维的总 RNA 作为模板, 以持家
基因 EF1α 为内参, 进行不同发育期相对表达水平
比较。结果表明(图 7), GhEG转录本在海 7124的 15
DPA 纤维发育期的表达量显著高于陆地棉 TM-1,
与基因芯片检测结果完全吻合。GhEG 在根、茎、
叶中表达很低, 而在纤维伸长期优势表达, 特别在
15 DPA和 20 DPA纤维中, 该基因在海岛棉海 7124
中的转录本显著高于陆地棉 TM-1。GhEG在纤维伸
长期的表达特点表明其与纤维伸长发育密切相关。

图 2 棉花 GhEG与来源于其他植物的葡聚糖酶的聚类分析
Fig. 2 Phylogenetic analysis of GhEG with glucanases from
other plants
GhEG: 陆地棉(登录号: HM462003); AtEG: 拟南芥(登录号:
AAM63477.1); GhEG2: 陆地棉(登录号: AAN04496.2); RcEG:
蓖麻(登录号: XP_002510516.1); GmEG: 大豆(登录号:
ABC94542.1); GhEG3: 陆地棉(登录号: AAS87601); GhEG4: 陆
地棉(登录号: AAP83128)
GhEG: Gossypium hirsutum (GenBank accession No. HM462003);
AtEG: Arabidopsis thaliana (GenBank accession No.
AAM63477.1); GhEG2: Gossypium hirsutum (GenBank accession
No. AAN04496.2); RcEG: Ricinus communis (GenBank accession
No. XP_002510516.1); GmEG: Glycine max (GenBank accession
No. ABC94542.1); GhEG3: Gossypium hirsutum (GenBank acces-
sion No. AAS87601); GhEG4: Gossypium hirsutum (GenBank
accession No. AAP83128).


图 3 棉花 GhGLU与来源于其他植物的 β-葡聚糖酶的序列比对
Fig. 3 Multiple alignment of GhGLU with glucanases from other plants
第 1期 董 佳等: 两个棉花-葡聚糖酶新基因的结构与表达特征分析 45



图 4 棉花 GhGLU与来源于其他植物的 β-葡聚糖酶的聚类分析
Fig. 4 Phylogenetic analysis of GhGLU with glucanases from
other plants
GhGLU: 陆地棉(登录号: HM462004); ZjGLU: 枣(登录号:
AAZ40342.1); AtGLU: 拟南芥(登录号: AAM66024.1); RcGLU:
蓖麻(登录号: XP-002529472.1); NtGLU: 烟草(登录号:
BAB17320.1); OsGLU: 水稻(登录号: AAD10386.1); GhGLU2:
陆地棉(登录号: CAA92278); GbGLU: 海岛棉[13]。
GhGLU: Gossypium hirsutum(GenBank accession No. HM462004);
ZjGLU: Ziziphus jujube (GenBank accession No. AAZ40342.1);
AtGLU: Arabidopsis thaliana (GenBank accession No.
AAM66024.1); RcGLU: Ricinus communis (GenBank accession No.
XP-002529472.1); NtGLU: Nicotiana tabacum (GenBank accession
No. BAB17320.1); OsGLU: Oryza sativa (GenBank accession No.
AAD10386.1); GhGLU2: Gossypium hirsutum (GenBank accession
No. CAA92278 ); GbGLU: Gossypium barbadense[13].
GhGLU在根、茎、叶及纤维发育不同时期均有表达,
属于组成性表达基因。相对于茎和叶, 在根里表达
量最高 , 且在海 7124 的根中表达量显著高于在
TM-1根中。该基因主要在纤维启始期和伸长后期优
势表达 , 且表达水平在陆地棉 TM-1 和海岛棉海
7124 间也有显著差异。陆地棉 TM-1 中在纤维发育
0 DPA和 20 DPA优势表达, 而海岛棉海 7124中在
15 DPA表达量最高(图 7)。
3 讨论
3.1 内切 β-1,4-葡聚糖酶基因在棉纤维发育中的
可能功能
植物在自然条件下生长、开花、果实成熟、器
官脱落等过程均可诱导内切 β-1,4-葡聚糖酶基因表
达, 表明该基因在植物生长的不同发育阶段均起作
用。因此研究植物内切 β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆、

图 5 EG和 GLU基因在非洲棉、雷蒙德氏棉、TM-1和海 7124中聚类分析
Fig. 5 Phylogenetic tree for EG and GLU orthologs in G. herbaceum, G. raimondii, G. hirsutum, and G. barbadense


图 6 GhEG和 GhGLU基因的定位结果
Fig. 6 Mapping of GhEG and GhGLU in tetraploid cotton
表达调控模式、编码蛋白的结构及底物对于全面了
解内切 β-1,4-葡聚糖酶基因表达特征及与植物的生
理效应关系具有重要指导意义。
到目前为止, 棉花中已克隆了多个 β-1,4-葡聚糖
酶基因 ( G e n B a n k 登录号分别为 B A A 2 1111、
AANO4496、AAS87601、AAP83128等), 这些基因编
码的产物均属于纤维素酶类, 参与了棉花纤维的伸
长。本文新克隆的编码 526个氨基酸的 GhEG基因与
来源于棉花和其他植物中的 β-1,4-葡聚糖酶基因高度
同源, 均含有糖基水解酶第 9家族的完整保守结构域。
该基因在纤维伸长期优势表达, 且在海 7124 15 DPA
和 20 DPA中表达量显著高于 TM-1。Brummell等[21]
报道根据植物 EG 保守序列设计简并引物从番茄
cDNA文库中分离出 1个 Cel3基因, 推测 Cel3可能与
植物纤维素合成有关; Shani 等[22]通过简并 PCR 引物
从拟南芥中分离出的一个 EG 基因 cel1, 证明 cel1 基
因的表达和植物细胞的伸长发育相关。陆地棉和海岛
棉是两大四倍体栽培棉种, 与陆地棉 TM-1 相比, 海
46 作 物 学 报 第 37卷


图 7 GhEG和 GhGLU基因在 TM-1和海 7124中的表达分析
Fig. 7 GhEG and GhGLU expression pattern in TM-1 and Hai7124
0、5、10、15和 20分别代表 0 DPA和 5 DPA胚珠纤维混合物、10、15和 20 DPA纤维组织。
0, 5, 10, 15, 20 indicates 0 DPA and 5 DPA mixture of ovule and fibers, 10, 15, and 20 DPA fiber tissues, respectively.

岛棉海 7124具有更长、更细、更强的纤维, GhEG在
棉纤维中特异表达, 且纤维伸长后期在海 7124中表达
量显著高于 TM-1。因此, 推测该基因表达与纤维的伸
长发育有关, 在纤维伸长后期的高表达可进一步有效
延长纤维伸长时期。目前, 已报道通过转基因的手段
可调控植物内切 β-1,4-葡聚糖酶基因表达, 进而影响
植物生理功能[23-24]。对于在纤维发育期专化表达的
GhEG 基因, 笔者将进一步利用转基因技术阐明其在
纤维品质形成中的作用机理。
3.2 β-1,3-葡聚糖酶基因在植物体内的可能功能
β-1,3-葡聚糖酶基因在植物中是一个大的基因
家族。许多研究表明, 它参与植物的多种正常生理
过程, 包括细胞分裂、小孢子发生、花粉萌发、受
精、种子萌芽及植物生长调控等过程[25-27]。本文克
隆的 cDNA全长 2 088个核苷酸, 共编码 469个氨基
酸残基, 与棉花及其他植物中的 β-1,3-葡聚糖酶基
因高度同源, 均含有糖基水解酶第 17家族的完整保
守结构域。它在纤维起始和伸长早期(0~5 DPA), 纤
维发育初生-次生壁转换期(15~20 DPA)均优势表达,
且在海 7124和 TM-1中表达水平有显著差异。暗示
该基因与纤维发育密切相关。前人也对该家族中纤
维专化表达的一个 β-1,3-葡聚糖酶基因在不同棉种
中的表达特征进行了系统研究, 利用该基因的部分
cDNA序列(GhGluc1登录号为D88416)设计 RT-PCR
引物进行不同纤维发育时期表达分析, 发现该基因
在短纤维品种中的表达量很高, 而在中长纤维品种
中的表达量却较低[28], 同时也发现 GhGluc1 的高表
达促进胼胝质的降解, 进而打开胞间连丝, 导致纤
维细胞膨压减少, 纤维伸长动力不足。本文克隆的
GhGLU 基因是否在纤维发育中与 GhGluc1 有相似
功能, 尚需进一步研究。
β-1,3-葡聚糖酶是重要的水解酶。在正常情况下,
它的表达水平很低, 但当其遭受病原物、昆虫取食
等生物因子以及乙烯、细胞分裂素、紫外线、机械
损伤、金属离子等非生物因子诱导后, 迅速积累, 表
达活性显著增强。McFadden 等 [29]对登录号为
CAA92278 的棉花 β-1,3-葡聚糖酶基因的研究发现,
该基因参与了棉花对黄萎病的防卫反应。Jongedijk
等[30]将烟草的 β-1,3-葡聚糖酶基因转化番茄时发现,
番茄发病率降低 36%~58%。众所周知, 海 7124 具
有强的抗黄萎病特点。在本研究中 , GhGLU 在海
7124 根中的表达量比 TM-1 显著高, 暗示该基因与
棉花黄萎病抗性可能有直接的关系, 可能是棉花抗
黄萎病育种的良好抗源基因。
4 结论
从陆地棉中克隆出 2 个基因, 分别编码内切-1,4-
β-葡聚糖酶(GhEG)和 1,3-β-葡聚糖酶(GhGLU)。GhEG
含 5个内含子和 6个外显子, 而GhGLU无内含子, 仅
1 个外显子。新克隆的 2 个基因在二倍体棉种非洲棉
和雷蒙德氏棉中含 1 个拷贝, 而在四倍体陆地棉和海
岛棉中存在 2个拷贝。分别将 2个基因在四倍体棉种
中的一个拷贝定位在第 19染色体上和第 4染色体上。
GhEG 是纤维发育特异表达基因, 在纤维伸长期优势
表达, 在海岛棉海 7124 中的转录本显著高于陆地棉
TM-1。GhGLU是组成性表达基因, 在根, 纤维初始期
和伸长后期优势表达, 且表达水平在陆地棉 TM-1 和
海岛棉 H7124间存在显著差异。
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