全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(11): 1970−1976 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家自然科学基金项目(30570964)
作者简介: 赵翔(1982–), 男, 硕士, 主要从事植物逆境生理研究。
*
通讯作者(Corresponding author): 张骁(1967–), 男, 博士生导师, 主要从事植物逆境信号转导研究。E-mail: xzhang@henu.edu.cn;
Tel: 0378-3880008
Received(收稿日期): 2008-04-18; Accepted(接受日期): 2008-06-16.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01970
盐胁迫条件下外源 Ca2+对蚕豆气孔运动及质膜 K+通道的调控
赵 翔 汪延良 王亚静 王西丽 张 骁*
(河南省植物逆境生物学重点实验室 / 河南大学生命科学学院, 河南开封 475004)
摘 要: 研究了 Ca2+ 对 NaCl胁迫下蚕豆气孔运动及质膜 K+通道的影响。结果表明, 100 mmol L−1 NaCl可明显诱导
气孔开放, 该现象可被 10 mmol L−1 CaCl2 显著抑制。为探讨盐胁迫下 Ca2+对 K+和 Na+跨膜运输的调控机制, 我们利
用膜片钳技术记录全细胞 K+ 电流发现, 在 100 mmol L−1 NaCl胁迫下, 加入 10 mmol L−1 CaCl2胞外处理, 显著抑制
质膜 K+内向及外向通道电流, 这种抑制可被 1 mmol L−1 La3+ (Ca2+通道抑制剂)缓解。非盐胁迫下, 10 mmol L−1 CaCl2
胞外处理也能显著抑制质膜内向 K+通道, 但明显激活其外向通道, 加入 1 mmol L−1 La3+并不能被缓解。用 H2O2专一
的荧光探针二氯荧光素二乙酸酯(H2DCF-DA)单细胞分析保卫细胞内 H2O2含量变化显示, 在 100 mmol L−1 NaCl盐胁
迫下, 10 mmol L−1 CaCl2 处理明显诱导 H2O2在保卫细胞中积累; 100 mmol L−1 NaCl和 10 mmol L−1 CaCl2单独处理并
不能诱导 H2O2积累。推测 Ca2+在盐胁迫下可能先诱导 H2O2在胞内积累, 进而激活质膜 Ca2+通道, 迅速提高胞内 Ca2+
浓度以抑制 Na+通过质膜 K+通道跨膜内流, 同时调节 Na+外流, 两种效应共同作用促使气孔关闭, 减少盐胁迫下水分
的过度散失。上述结果将为 Ca2+调控作物抗盐机制研究提供新的思路。
关键词: 盐胁迫; 钙离子; 过氧化氢; 保卫细胞; 质膜 K+通道
Effects of Exogenous Ca2+ on Stomatal Movement and Plasma Membrane
K+ Channels of Vicia faba Guard Cell under Salt Stress
ZHAO Xiang, WANG Yan-Liang, WANG Ya-Jing, WANG Xi-Li, and ZHANG Xiao*
(Henan Key Laboratory of Plant Stress Biology / School of Life Sciences, Henan University, Kaifeng 475004, Henan, China)
Abstract: Soil salinity is a key abiotic stress in crop production worldwide, especially in countries where irrigation is an essen-
tial aid to agriculture. Salt stress disturbs intracellular ion homeostasis of plants, which leads to membrane dysfunction, attenua-
tion of metabolic activity, and secondary effects causing growth inhibition and ultimately death. Salt tolerance in plants is the
ultimate manifestation of several physiologic processes, including ion uptake and membrane flux, ionic balance, and distribution.
Previous researches have shown that K+ inward rectifying channels, outward rectifying channels, high affinity K+ transporter
(HKT) and low affinity cation transporter (LCT) may facilitate Na+ influx under NaCl stress. Extracellular free Ca2+ concentration
([Ca2+]ext) enhances salt tolerance and salinity stress elicits a transient increase in cytosolic free Ca2+ concentration ([Ca2+]cyt). The
transient increase in [Ca2+]cyt activates the PP2B phosphatase calcineurin leading to the transcription of ENA1, which encodes the
P-type ATPase that is primarily responsible for Na+ efflux across the plasma membrane or activates the SOS signal pathway which
negatively controls this Na+ influx system. At the plasma membrane, high cytosolic Ca2+ levels can cause activation of anion
channels and reduce the conductivity of inward K+ channels, thus reducing water loss. To better understand Ca2+ function in K+
and Na+ uptake, here, we investigated the effect of calcium on stomatal movement and K+ channels of Vicia faba under NaCl stress.
The results showed that 100 mmol L−1 NaCl significantly induced stomatal opening, CaCl2 facilitated NaCl-induced stomatal
opening at concentration of 0.1 mmol L−1 and significantly inhibited NaCl-induced stomatal opening at concentration of 10 mmol
L−1. To gain further insights into Ca2+ function in NaCl-regulated stomatal movement, Vicia faba guard cell protoplasts were
patch-clamped in a whole-cell configuration and the results showed that Ca2+ significantly inhibited inward rectifying and outward
rectifying K+ current when NaCl and CaCl2 were added to the bath solution together, at concentration of 100 and 10 mmol L−1
第 11期 赵 翔等: 盐胁迫条件下外源 Ca2+对蚕豆气孔运动及质膜 K+通道的调控 1971


respectively, which was alleviated by LaCl3 at concentration of 1 mmol L−1. In contrast, 10 mmol L−1 CaCl2 alone significantly
inhibited inward rectifying K+ current and activated outward rectifying K+ current, which was not alleviated by LaCl3. A single
cell analysis of cytosolic H2O2 using 2’,7’-dichlorofluorescin (H2DCF-DA) revealed that Ca2+ can induce the generating of H2O2
in the guard cells with 10 mmol L−1 CaCl2 under 100 mmol L−1 NaCl stress, but 10 mmol L−1 CaCl2 or 100 mmol L−1 NaCl had
little effect on the accumulation of H2O2 in the guard cells, respectively. These results suggest that calcium may alleviate the dam-
age caused by NaCl stress through inducing the production of H2O2, in turn the H2O2-activated increases in [Ca2+]cyt in guard cells
decrease Na+ uptake by the regulation of plasma membrane K+ channels in guard cells leading to stomatal closure and reduction
of water loss. These findings open new perspectives about Ca2+-based signaling in responsive to salt stress in plants.
Keywords: Salt stress; Calcium; Hydrogen peroxide; Guard cell; Plasma membrane K+ channels
土壤盐渍化限制了作物可耕种面积和产量, 严
重影响了农业生产, 世界上近20%的农业用地和50%
的作物耕地处于盐胁迫逆境。盐胁迫最大的危害是
可利用水的亏缺, 气孔作为植物体水分散失的门户,
其开与关对植物抵抗盐胁迫起着重要作用。早期研
究发现, 外源 NaCl 处理可诱导植物气孔运动[1-2]。
其中, Na+可以通过高亲和 K+转运体(high affinity K+
transporter, HKT)和低亲和阳离子转运体(low affini-
ty cation transporter, LCT)以及非选择性阳离子通道
(NSC)进入细胞[3-4]。但迄今为止, 有关 Na+对保卫细
胞的调控机制还不甚清楚。
Ca2+已被广泛认为是胞内信使 , 参与 ABA、
H2O2 诱导的气孔关闭[5-6]。诸多生物及非生物胁迫
都会引起植物胞质 Ca2+浓度([Ca2+]cyt)的上升[7-8], 植
物可以根据[Ca2+]cyt变化的差异如位置、幅度、频率
及持续的时间解码不同的刺激, 从而使细胞做出不
同的反应[9-10]。研究发现胞外 Ca2+可引起保卫细胞
[Ca2+]cyt 振荡诱导气孔关闭 [11]。胞外 Ca2+浓度
([Ca2+]ext)增加可引起[Ca2+]cyt上升, 增强盐忍耐[12]。
最近 , 研究酵母发现胞外 Ca2+ 通过 Cch1p and
Mid1p-Ca2+运输体系进入细胞提高[Ca2+]cyt[13], 而拟
南芥中胞外 Ca2+可能作为一种信号通过与质膜 Ca2+
受体 CAS结合, 激活磷脂酶 C(PLC), 增加 IP3浓度,
诱导胞内钙库释放 Ca2+以提高[Ca2+]cyt[14-15]。然而胞
外Ca2+如何进入植物保卫细胞还不甚了解。另外, 已
有研究表明[Ca2+]cyt的上升, 可通过降低 Na+的吸收,
有效地控制 Na+/K+在植物中选择性积累, 增加其对
NaCl胁迫的抗性[16-18]。尽管如此, 胞外 Ca2+缓解盐
胁迫机理以及对保卫细胞质膜相关离子通道如何调
节并不十分清楚。我们的研究发现, H2O2 可通过对
保卫细胞质膜 K+ 通道及胞内 pH 的调节介导 ABA
诱 导 的 气 孔 关 闭 [19-20], 也 可 通 过 诱 导 质 膜
H+-ATPase脱磷酸化介导 ABA抑制蓝光诱导的气孔
开放[21]。Yan等[22]报道 H2O2也可介导 ABA抑制的
气孔开放, Pei等[6]报道 H2O2可以激活保卫细胞质膜
Ca2+ 通道, 促使 Ca2+ 内流。那么, 胞外 Ca2+ 缓解盐
胁迫, 抑制气孔开放是否有 H2O2 的参与则不清楚,
本研究针对上述问题, 利用药理学、电生理学及细
胞生物学的研究技术和方法 , 探讨外源 Ca2+ 在
NaCl 胁迫条件下对保卫细胞质膜 K+ 离子通道的调
控机制, 以期明确外源 Ca2+ 对 NaCl 胁迫的缓解机
理, 为改善盐渍土上的农业生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
将蚕豆(Vicia faba L.)种子用 75%乙醇表面消毒
5 min, 在生化培养箱中催芽 3~4 d, 播种于培养土
(营养土∶蛭石为 2 1)∶ 中。蚕豆生长的光/暗周期为
12 h/12 h, 光照强度为 0.20~0.30 mmol m−2 s−1, 昼夜
温度分别为 25 ±2℃ ℃和 20 ±2 , ℃ ℃ 相对湿度在 70%
左右, 生长期间无胁迫。
1.2 试剂
纤维素酶(Cellulase RS) 购自日本 Yakult Hon-
sha 公司; 果胶酶(Pectolyase Y-23)购自日本 Seishin
Pharmaceutical公司; 二氯荧光素二乙酸酯(dichloro-
fluorescin diacetate, H2DCF-DA)购自 Sigma公司, 使
用前配成 50 mmol L−1 DMSO溶液, 分成小包装冷冻
保存; 其他试剂均为分析纯。
1.3 表皮条的生物分析
参见 Zhang 等[19]方法, 取 3~4 周龄蚕豆苗顶端
第 1~2 对完全展开的叶片, 用蒸馏水洗净, 撕取下表
皮, 洗去叶肉细胞后, 切成 5 mm长的表皮条, 暗处
理 2 h诱导气孔关闭。用 CO2-free 10 mmol L−1 MES,
50 mmol L−1 KCl (pH 6.15)开放缓冲液为对照, 以缓
冲液中加入 NaCl 和不同浓度的 CaCl2为处理, 同时
在 23℃下, 光照(0.20~0.30 mmol m−2 s−1) 2 h。然后
在 10×25 倍倒置显微镜下用测微尺测定气孔宽长比
值。每个处理至少用 3个表皮条, 每个表皮条随机测
1972 作 物 学 报 第 34卷

20个气孔开度, 每个处理重复 5次(不少于 300个气孔
开度), 统计平均值和标准误差。
1.4 蚕豆保卫细胞原生质体的分离及质膜 K+电
流记录
分离原生质体参照 Zhang 等[20]的方法, 取 3~4
周龄苗顶端第 2 对完全展开叶, 用蒸馏水洗净, 撕
取下表皮, 洗净叶肉细胞后, 切成约 5 mm长的表皮
条, 进行酶解提取。酶解液含 1.3%纤维素酶 RS、
0.0075%果胶酶(Pectolyase Y-23)、0.25%牛血清蛋白
(BSA)、0.5 mmol L−1 抗坏血酸, 用山梨醇调渗透压
至 460 mOsmol kg-1, pH 5.5 (KOH)。
记录质膜 K+ 电流采用 Hamill 等常规全细胞记
录技术[23]。非 NaCl胁迫下所用细胞外液含 10 mmol
L−1谷氨酸钾、2 mmol L−1 MgCl2、1 mmol L−1 KOH、
10 mmol L−1 Mes; NaCl 胁迫处理细胞外液含 100
mmol L−1 NaCl、谷氨酸钾 10 mmol L−1、2 mmol L−1
MgCl2、1 mmol L−1 KOH、10 mmol L−1 Mes, 用山梨
醇调渗透压至 460 mOsmol kg−1, 并调至 pH 5.5
(KOH)。NaCl 胁迫及非胁迫下电极液均包含 100
mmol L−1谷氨酸钾、2 mmol L−1 MgCl2、4 mmol L−1
KOH、1.1 mmol L−1 MgATP、0.1 mmol L−1 CaCl2、
10 mmol L−1 Hepes, 山梨醇调渗透压为 510 mOsmol
kg−1, pH 7.2 (KOH)。刺激电压从–190 mV逐级去极
化到+110 mV, 每级为+20 mV, 维持时间 3 s, 频率
为 0.2 Hz。全细胞封接形成 10~15 min后采集数据,
以连续两次稳定的值作为对照电流, 不同浓度 Ca2+
处理 10 min后采集处理数据。使用 EPC-9膜片钳放
大器(HEKA Elektronik, Lambrecht, Germany)测定全
细胞电流, 使用 PULSE + PULSEFIT软件采集和分
析全细胞电流, 每一试验结果重复 6~8次。
1.5 荧光探针的负载及荧光图像的记录
参见 Lü 等[24]的方法, 事先取出表皮条, 在 5
mL负载缓冲液(10 mmol L−1 Tris, 50 mmol L−1 KCl,
pH 7.2)中培养, 然后将H2O2荧光探针加入盛有表皮
条的负载缓冲液中混均, 使 H2DCF-DA终浓度为 50
μmol L−1, 负载温度控制在 25 , ℃ 负载时间 15 min。
然后将负载 H2DCFDA 的表皮条用新鲜负载缓冲液
漂洗两次, 以洗去细胞表层多余的探针, 然后用盖
玻片迅速将表皮条固定在显微镜载物台上, 用激光
共聚焦扫描显微镜(FV1000, Olympus)观察。LCSM
的工作条件为: Ex=488 nm, Em=500~550 nm, Power
2%, Zoom 3~5, 中速扫描, Frame 512×512 pixel; 对
每个细胞荧光变化做适时记录。每个实验至少重复
5 次, 当结果一致时, 取其中一个细胞用 FV10ASW
1.6软件分析荧光强度。
2 结果与分析
2.1 Ca2+ 和 Na+ 对气孔运动的调节
图 1所示, 100 mmol L−1 NaCl处理可明显促进
气孔开放 , 其增加值为 35.6%, 等浓度 KCl 代替
NaCl 处理具有类似的效应。低浓度的胞外 Ca2+(0.1
mmol L−1 CaCl2)可促进 NaCl诱导的气孔开放, 较高
浓度的胞外 Ca2+处理可有效抑制 NaCl 诱导的气孔
开放, 其中 10 mmol L−1 CaCl2处理可使NaCl诱导的
气孔开度下降 39.0%, 显著抑制 NaCl诱导的气孔开
放。另外, 非 NaCl胁迫下 10 mmol L−1 CaCl2胞外处
理几乎完全抑制气孔开放。



图 1 外源 Ca2+ 和 Na+ 对蚕豆气孔运动的调节
Fig. 1 Regulation of exogenous Ca2+ and Na+ on stomatal
movement in Vicia faba
KCl和 NaCl的处理浓度为 100 mmol L−1; Ca1=0.1 mmol L−1,
Ca2=1 mmol L−1, Ca3=10 mmol L−1为 Ca2+ 梯度处理; 图中每个
值来自于 300个测量结果的平均值(n=6)。
The concentrations of KCl or NaCl are both 100 mmol L−1. The
concentrations of CaCl2 are 0.1 mmol L-1 for Ca1, 1 mmol L−1 for
Ca2 and 10 mmol L−1 for Ca3. Each value is the mean of 300
measurements ±SE (n=6).

2.2 非盐胁迫及盐胁迫下外源 Ca2+ 对蚕豆保卫
细胞质膜 K+ 通道的调控
非盐胁迫下 , 低的[Ca2+]ext(0.1 mmol L−1 CaCl2)
处理对保卫细胞质膜内向 K+及外向 K+通道基本
没有影响 , 而较高的[Ca2+]ext(10 mmol L−1 CaCl2)处
理几乎完全抑制保卫细胞质膜内向 K+通道电流 ,
显著激活其外向 K+ 通道电流 , 1 mmol L−1 LaCl3的
加入并不能缓解上述效应(图 2)。
在 100 mmol L−1 NaCl胁迫条件下, 0.1 mmol L−1
CaCl2 显著激活保卫细胞质膜外向 K+通道, 对内向
第 11期 赵 翔等: 盐胁迫条件下外源 Ca2+对蚕豆气孔运动及质膜 K+通道的调控 1973


K+通道影响甚微, 然而 10 mmol L−1 CaCl2处理能显
著抑制保卫细胞质膜外向及内向 K+通道, 1 mmol
L−1 LaCl3 的加入能很好地缓解盐胁迫下高的
[Ca2+]ext 处理对质膜内向及外向 K+通道电流的抑制
作用。表明在盐胁迫下胞外 Ca2+ 可能主要通过质膜
Ca2+通道进入胞内, 进而调控质膜 K+通道(图 3)。



图 2 外源 Ca2+ 对蚕豆保卫细胞质膜内向及外向 K+ 通道的调节
Fig. 2 Regulation of exogenous Ca2+ on inward-rectifying and outward-rectifying K+ channel current from protoplasts
in Vicia faba guard cells
A: 不同处理对电压依赖的蚕豆保卫细胞内向及外向K+ 通道电流的影响; B: 全细胞跨膜K+ 电流(pA)与跨膜电势(mV)的关系; CK: 对
照; LCa: 0.1 mmol L−1 CaCl2; HCa: 10 mmol L−1 CaCl2; La+HCa: 1 mmol L−1 LaCl3和 10 mmol L−1 CaCl2 共同处理。B中每个数据均来自
6个独立重复试验的平均值±标准误。
A: effects of different treatments on voltage-dependent Vicia faba guard cell inward-rectifying and outward-rectifying K+ channel current; B:
relationship between the whole cell K+ current (pA) and membrane potential (mV); CK: control; LCa: 0.1 mmol L−1 CaCl2; HCa: 10 mmol L−1
CaCl2; La+HCa: 1 mmol L−1 LaCl3 + 10 mmol L−1 CaCl2 treatments. Each value in B is the mean current (current)
from six independent experiments and the error bar denotes the standard error.



图 3 外源 Ca2+ 对 NaCl胁迫件下蚕豆保卫细胞质膜内向及外向 K+ 通道的调节
Fig. 3 Regulation of exogenous Ca2+ on inward-rectifying and outward-rectifying K+ channel current from protoplasts in Vicia faba
guard cell in response to 100 mmol L−1 NaCl stress
图中 A和 B处理同图 2, 字母缩写同图 2。B中每个数据均来自 6个独立重复试验的平均值±标准误。
The treatments of A and B are the same as in Fig. 2. Abbreviations are the same as in Fig. 2. Each value in B is the mean current from six
independent experiments and the error bar denotes the standard error.
1974 作 物 学 报 第 34卷

为了进一步比较胞外 Ca2+对质膜 K+通道的调
控机制, 选择同一电压下质膜 K+通道电流的变化进
行比较。100 mmol L−1 NaCl能抑制保卫细胞质膜内
向K+通道, 抑制K+电流 55.3%(图 4-A), 但对质膜外
向 K+通道活性影响不大(图 4-B)。较低的[Ca2+]ext(0.1
mmol L−1 CaCl2)对胁迫与非胁迫下的保卫细胞质膜
内向 K+通道有轻微的促进作用(图4-A), 却能显著增
加盐胁迫下质膜外向 K+通道电流 , 其增加值为
140%(图 4-B)。较高的[Ca2+]ext(10 mmol L−1 CaCl2)
能明显抑制胁迫及非胁迫下质膜内向 K+通道电流
(图 4-A), 且增加非胁迫下质膜外向 K+通道电流, 其
增加值为 148%(图 4-B)。与上面分析结果类似 , 1
mmol L−1 LaCl3能缓解较高的[Ca2+]ext对盐胁迫下质
膜 K+ 通道的抑制(图 4-A)。



图 4 外源 Ca2+ 在两种跨膜电压时对蚕豆保卫细胞质膜内向及外向 K+ 通道的影响
Fig. 4 Effect of exogenous Ca2+ on inward-rectifying and outward-rectifying K+ channel currents from protoplasts in Vicia faba
guard cell in response to membrane potential of –190 mV or +110 mV
图中字母缩写同图 2, 图中每个柱分别是在电压−190 mV(A)或者+110 mV(B)时, 来自 6个独立重复试验的平均值±标准误。
Abbreviations are the same as in Fig.2. Each value in Fig.4 is the mean current from six independent experiments and the error bar denotes
the standard error response to –190 mV (A) or +110 mV (B) respectively.

2.3 盐胁迫下 Ca2+对保卫细胞 H2O2产生的影响
用 H2O2 专一的荧光探针二氯荧光素二乙酸酯
(H2DCF-DA)标记蚕豆保卫细胞来检测胞内 H2O2 的
水平变化[19,24]。结果显示, 100 mmol L−1 NaCl胁迫
下, 10 mmol L−1 Ca2+处理表皮条 2 min后即可诱导
保卫细胞中 H2O2产生, 处理 10 min 后能显著诱导
H2O2 在保卫细胞中积累。单独使用 100 mmol L−1
NaCl或 10 mmol L−1 Ca2+以及 100 mmol L−1 NaCl +
0.1 mmol L−1 Ca2+等处理均不能明显诱导 H2O2积累
(图 5)。
3 讨论
在盐胁迫条件下, 植物调整合适的气孔开度以
防止水分的过度散失, 并确保二氧化碳的吸收以保
证光合作用的进行, 这对植物的生长发育是至关重
要的。本试验对蚕豆表皮生物学分析显示, 100 mmol
L−1 NaCl处理可明显促进气孔开放(图 1), 而等浓度
KCl代替 NaCl处理具有类似的效应。说明高的胞外
K+和 Na+胁迫均可以加强 K+和 Na+向胞内的运输,
以诱导气孔开放。Schachtman 等[25]报道 Na+可以通
过内向K+通道与K+竞争进入细胞, 也可以通过外向
K+通道进入细胞, 从而改变保卫细胞的渗透势, 迫
使气孔开放。由图 4可知, 100 mmol L−1 NaCl处理
可以部分降低 K+的内向通道电流, 并不影响其外向
K+通道电流, 说明 Na+可能与 K+竞争通过内向 K+通
道进入细胞, 但 Véry等[1]报道 Na+并不通过内向 K+
通道与K+竞争进入细胞, 而是通过外向K+通道进入
细胞。无论 K+和 Na+以怎样的机制进入保卫细胞,
NaCl胁迫条件下气孔开放对植物来说都极其不利。
Ca2+作为胞内重要第二信使, 调控植物诸多生
长发育及胁迫应答过程。非盐胁迫下, 较高浓度的
胞外 Ca2+可以诱导气孔关闭(图 1), 这与McAinsh等
[26]的研究结果一致。本研究发现, 高的[Ca2+]ext几乎
完全抑制质膜内向 K+通道, 并激活外向 K+通道(图
2), 这与 Schroeder 等[27]报道[Ca2+]cyt升高可以抑制
内向 K+通道、激活外向 K+通道结果相似。因此推测,
胞外 Ca2+可能是通过引起[Ca2+]cyt 升高以发挥其对
质膜 K+通道的调节功能。Tang等[14]和 Epstein等[15]
报道拟南芥中胞外 Ca2+可作为一种信号, 与其质膜
受体 CAS 结合, 通过 IP3 信号转导途径, 诱导胞内
第 11期 赵 翔等: 盐胁迫条件下外源 Ca2+对蚕豆气孔运动及质膜 K+通道的调控 1975




图 5 NaCl胁迫下 Ca2+ 诱导的 H2O2(以 H2DCF-DA荧光显示)产生和变化的过程
Fig. 5 Ca2+-induced H2O2 generation from guard cells under NaCl stress
A1~A7：10 mmol L−1 CaCl2和 100 mmol L−1 NaCl共同处理后保卫细胞中 H2DCF-DA的荧光变化; B1~B7：10 mmol L−1 CaCl2处理后保
卫细胞中 H2DCF-DA荧光变化图; C1~C7：100 mmol L−1 NaCl处理后保卫细胞内 H2DCF-DA荧光变化图; D1~D7：0.1 mmol L−1 CaCl2
和 100 mmol L−1 NaCl共同处理后保卫细胞内 H2DCF-DA荧光变化图。时间顺序如下: A1、B1、C1和 D1为处理前对照, A2~A7、B2~B7、
C2~C7和 D2~D7分别表示处理后 2、4、6、8、10、12 min时荧光图。
A1−A7: H2DCF-DA fluorescence picture in the treatment with 10 mmol L−1 CaCl2 and 100 mmol L−1 NaCl; B1–B7: fluorescence picture in the
treatment with 10 mmol L−1 CaCl2; C1–C7: fluorescence picture in the treatment with 100 mmol L−1 NaCl only; D1-D7: fluorescence picture
in the treatment with 0.1 mmol L−1 CaCl2 and 100 mmol L−1 NaCl. A1, B1, C1, D1 are images before treatment; A2−A7, B2−B7, C2−C7, and
D2−D7 show the fluorescence changes at different minutes after different treatments.

钙库释放 Ca2+以提高[Ca2+]cyt。胞外 Ca2+有没有可能
通过质膜 Ca2+通道直接进入胞内提高[Ca2+]cyt? 为证
实这一点, 在胞外液中加入 1 mmol L−1 LaCl3, 如图
2所示, LaCl3的加入并不能缓解高的[Ca2+]ext对质膜
K+通道的调控作用, 因此基本上排除了非盐胁迫下
胞外 Ca2+通过质膜 Ca2+通道直接进入胞内的可能。
在 NaCl 胁迫条件下, 高浓度 CaCl2处理也可显著抑
制 NaCl胁迫诱导的气孔开放(图 1), 而且较高的胞外
Ca2+能同时抑制质膜内向及外向 K+通道, 该现象可
以被 1 mmol L−1 LaCl3缓解(图 3), 表明在盐胁迫条件
下, [Ca2+]ext可能主要通过质膜 Ca2+通道进入细胞, 以
提高[Ca2+]cyt, 从而阻止 K+内流, 防止 Na+通过质膜
K+通道进入细胞(图 3, 图 4), 又可促进 Na+跨质膜外
流[16-18], 进而抑制 NaCl 胁迫诱导的气孔开放(图 1),
这将极大地提高 NaCl胁迫下植物的保水能力。
值得注意的是, 10 mmol L−1 CaCl2胞外处理, 对
盐胁迫和非盐胁迫下质膜K+通道有着并不完全相同
的调控结果(图 4)。产生该现象的可能原因是在这两
种情况下胞外 Ca2+进入胞内的方式存在差异, 造成
[Ca2+]cyt振荡存在诸如位置、幅度、频率及持续时间
等的不同, 导致植物对这些差异产生不同解码, 最
终做出不同的反应[9-10]。另外, 相同条件下, 不同浓
度胞外 Ca2+可能通过影响[Ca2+]cyt 振荡的幅度 [15],
进而影响其对气孔运动(图 1)以及对质膜 K+通道的调
节(图 2, 图 3)。但是, 目前有关胞外 Ca2+影响[Ca2+]cyt
振荡差异的机制并不清楚。最近, H2O2 作为调节多
种胁迫的信号分子介导 ABA 诱导的气孔关闭或抑
制蓝光依赖的气孔开放的研究 [19-22], 尤其是 H2O2
对保卫细胞质膜 Ca2+ 通道调控机制的研究[6], 为我
们研究 Ca2+在调节抗盐等方面的功能提供了新的途
径。盐胁迫条件下[Ca2+]ext可能是主要通过质膜 Ca2+
通道进入细胞(图 3)。胞外 Ca2+对盐胁迫缓解过程是
否有H2O2的参与？我们发现, 在 100 mmol L−1 NaCl
胁迫下, 10 mmol L−1 Ca2+处理确实能诱导 H2O2在保
卫细胞中大量积累(图5)。而 H2O2可以激活保卫细胞
质膜 Ca2+通道, 促使 Ca2+的内流[6], [Ca2+]cyt的升高
可能对质膜 Ca2+通道又具有反馈调节作用, 以调控
质膜 K+通道, 保证盐胁迫条件下 Na+/K+的跨膜流动,
调节植物体细胞内离子平衡, 从而减少 Na+的吸收、
降低[Na+]/[K+]比以适应盐胁迫[16]。
1976 作 物 学 报 第 34卷

4 结论
NaCl胁迫条件下, 较高浓度的胞外 Ca2+可诱导
保卫细胞内 H2O2产生, 进而激活质膜 Ca2+通道, 迅
速提高[Ca2+]cyt 以抑制质膜内向及外向 K+通道, 既
可阻止大量 K+内流, 又防止 Na+通过质膜 K+通道进
入细胞, [Ca2+]cyt的上升还可促进 Na+跨质膜向外运
输, 共同作用来抑制盐胁迫下气孔开放, 以防止植
物水分的过度散失。
References
[1] Véry A A, Robinson M F, Mansfield T A, Sanders D. Guard cell
cation channels are involved in Na+-induced stomatal closure in a
halophyte. Plant J, 1998, 14: 509–521
[2] Zeiger E. The biology of stomatal guard cells. Annu Rev Plant
Physiol, 1983, 34: 441–475
[3] Tester M, Davenport R. Na+ tolerance and Na+ transport in higher
plants. Annu Rev Plant Biol, 2003, 91: 503–527
[4] Demidchik V, Davenport R J, TesterM. Nonselective cation
channels in plants. Annu Rev Plant Biol, 2002, 53: 67–107
[5] McAinsh M R, Brownlee C, Hetherington A M. Abscisic
acid-induced elevation of guard cell cytoplasmic Ca2+ precedes
stomatal closure. Nature, 1990, 343: 186–188
[6] Pei Z M, Murata Y, Benning G, Thomine S, Kluesener B, Allen
G J, Grill E, Schroeder J I. Calcium channels activated by hydro-
gen peroxide mediate abscisic acid signaling in guard cells.
Nature, 2000, 406: 731–734
[7] Hetherington A M, Brownlee C. The generation of Ca2+ signals in
plants. Annu Rev Plant Biol, 2004, 55: 401–427
[8] Knight H, Knight M R. Abiotic stress signalling pathways: Speci-
ficity and cross-talk. Trends Plant Sci, 2001, 6: 262–267
[9] Sanders D, Brownlee C, Harper J F. Communicating with cal-
cium. Plant Cell, 1999, 11: 691–706
[10] McClung C R. Plant circadian rhythms. Plant Cell, 2006, 18:
792–803
[11] Gethyn J A, Kuchitsu K, Sarah P C, Murata Y, Schroeder J I.
Arabidopsis abi1-1 and abi2-1 phosphatase mutations reduce ab-
scisic acid-induced cytoplasmic calcium rises in guard cells.
Plant Cell, 1999, 11: 1785–1798
[12] Knight H, Trewavas A J, Knight M R. Calcium signaling in
Arabidopsis thaliana responding to drought and salinity. Plant J,
1997, 12: 1067–1078
[13] Matsumoto T K, Ellsmore A J, Cessna S G, Low P S, Pardo J M,
Bressan R A, Hasegawa P M. An osmotically induced cytosolic
Ca2+ transient activates calcineurin signaling to mediate ion ho-
meostasis and salt tolerance of Saccharomyces cerevisiae. J Biol
Chem, 2002, 277: 33075–33080
[14] Han S, Tang R, Anderson L K, Woerner T E, Pei Z M. A cell sur-
face receptor mediates extracellular Ca2+ sensing in guard cells.
Nature, 2003, 425:196–200
[15] Tang R H, Han S C, Zheng H L, Cook C W, Choi C S, Woerner
T E, Jackson R B, Pei Z M. Coupling diurnal cytosolic Ca2+ os-
cillations to the CAS-IP3 pathway in Arabidopsis. Science, 2007,
315: 1423–1426
[16] Epstein E. How calcium enhances plant salt tolerance. Science,
1998, 280: 1906–1917
[17] Zhu J K. Regulation of ion homeostasis under salt stress. Curr
Opin Plant Biol, 2003, 6: 441–445
[18] Rus A, Lee B H, Mayor A M, Sharkhuu A D, Miura K, Zhu J K,
Bressan R A, Hasegawa P M. AtHKT1 facilitates Na+ homeosta-
sis and K+ nutrition in planta. Plant Physiol, 2004, 136: 2500–
2511
[19] Zhang X, Zhang L, Dong F C, Gao J F, Galbraith D W, Song C P.
Hydrogen peroxide is involved in abscisic acid-induced stomatal
closure in Vicia faba. Plant Physiol, 2001, 126: 1438–1448
[20] Zhang X, Miao Y C, An G Y, Zhou Y, Shangguan Z P, Gao J F,
Song C P. K+ channels inhibited by hydrogen peroxide mediate
abscisic acid signaling in guard cells. Cell Res, 2001, 11:
195–202
[21] Zhang X, Wang H B, Takemiya A, Song C P, Kinoshita T, Shi-
mazaki K. Inhibition of blue light-dependent H+ pumping by ab-
scisic acid through hydrogen peroxide-induced dephosphoryla-
tion of the plasma membrane H+-ATPase in guard cell protoplasts.
Plant Physiol, 2004, 136: 4150–4158
[22] Yan J P, Tsuichihara N, Etoh T, Iwai S. Reactive oxygen species
and nitric oxide are involved in ABA inhibition of stomatal open-
ing. Plant Cell Environ, 2007, 30: 1320–1325
[23] Hamill O P, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth F J. Im-
proved patch-clamp techniques for high-resolution current re-
cording from cells and cell-free membran patches. Pfluger Archiv,
1981, 391: 85–100
[24] Lü D(吕东), Zhang X (张骁), Jiang J(江静), An G-Y(安国勇),
Zhang L-R(张玲瑞), Song C-P(宋纯鹏). NO may function in the
downstream of H2O2 in ABA-induced stomatal closure in Vicia
faba L. Acta Phytophys Sin (植物生理与分子生物学学报), 2005,
31(1): 62–70 (in Chinese with English abstract)
[25] Schachtman D P. Molecular insights into the structure and func-
tion of plant K+ transport mechanisms. Biochim Biophys Acta,
2000, 1465: 127–139
[26] McAinsh M R, Webb A A R, Taylor J E, Hetherington A M.
Stimulus-induced oscillations in guard cell cytoplasmic free cal-
cium. Plant Cell, 1995, 7: 1207– 1219
[27] Schroeder J I, Hagiwara S. Cytosolic calcium regulates ion
channels in the plasma membrane of Vicia faba guard cells.
Nature, 1989, 338: 427–430