全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(8): 13781388 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由现代农业产业技术体系建设专项资金(nycyta-19), 国家自然科学基金项目(30971819, 30900907), 广东省自然科学基金项目
(10151064001000002)和粤港关键领域重点突破项目(2008A024200009)资助。
 通讯作者(Corresponding author): 梁炫强, E-mail: Liang804@yahoo.com, Tel: 020-87597315
第一作者联系方式: E-mail: xpchen1011@gmail.com
Received(收稿日期): 2011-01-15; Accepted(接受日期): 2011-04-27; Published online(网络出版日期): 2011-06-13.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20110613.1451.004.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01378
两个南方花生主栽品种荚果与叶片基因表达谱分析
陈小平 朱方何 洪彦彬 刘海燕 张二华 周桂元 李少雄
钟 旎 温世杰 李杏瑜 梁炫强*
广东省农业科学作物研究所, 广东广州 510640
摘 要: 利用高密度花生基因表达谱芯片比较遗传背景相似而在产量上存在显著差异的 2 个南方花生品种粤油 7 号
和汕油 523荚果与叶片的基因表达谱。结果表明, 汕油 523与粤油 7号荚果差异表达基因高达 1 383个, 其中上调表
达基因 662个, 下调表达基因 721个。叶片中差异表达基因有 647个, 其中上调表达基因 234个, 下调表达基因 413
个。基因表达差异在 10 倍以上的上调和下调基因在荚果中分别有 52 个和 105 个, 而在叶片中只有 2 个和 5 个。功
能注释结果表明, 差异表达基因集中在细胞内和膜上, 而其分子功能主要为结合和催化活性, 主要参与代谢、细胞和
生物调控等生物过程。在花生荚果和叶片中, 还有近一半的差异表达基因的功能未知, 表明这 2个器官中还有大量的
基因尚待发掘。为验证基因芯片数据的可靠性和重复性, 选择 4 个差异表达基因进行实时定量 PCR 分析, 其结果与
芯片检测结果吻合。
关键词: 花生栽培种; 基因芯片; 基因表达谱; 差异表达基因; 实时定量 RT-PCR
Analysis of Gene Expression Profiles in Pod and Leaf of Two Major Peanut
Cultivars in Southern China
CHEN Xiao-Ping, ZHU Fang-He, HONG Yan-Bin, LIU Hai-Yan, ZHANG Er-Hua, ZHOU Gui-Yuan, LI
Shao-Xiong, ZHONG Ni, WEN Shi-Jie, LI Xing-Yu, and LIANG Xuan-Qiang*
Crops Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China
Abstract: Great improvements have been achieved in peanut yield, quality and resistance through traditional breeding methods.
However, variations in gene expression profiles in major cultivars are yet unclear. Here, we used a high-density peanut oligonu-
cleotide microarray to analyze gene expression profiles in pod and leaf of Shanyou 523 and Yueyou 7, which are widely grown in
southern China. The results indicated that 1 383 differentially expressed genes were detected in pod, including 662 and 721 of
genes were up- and down-regulated, respectively. Besides 647 differentially expressed genes were detected in leaf, including 234
and 413 of genes were up- and down-regulated, respectively. Among the pod differentially expressed genes, 52 and 105 genes
were, up- and down-regulated at least 10-fold in pod, whereas only two and five were found in leaf. To further characterize these
differentially expressed genes, we used Gene Ontology (GO) for their annotation. The results showed that a large proportion of
differentially expressed genes from both pod and leaf were distributed in cell and membrane, possessed binding and catalytic ac-
tivities and were involved in metabolic and cellular processes. Additionally, the expression of four differentially expressed genes
was validated by real time qRT-PCR, further confirming the microarray results.
Keywords: Cultivated peanut (Arachis hypogaea L.); Microarray; Gene expression profiles; Differentially expressed genes;
Real-time quantitative RT-PCR
花生(Arachis hypogaea L.)是全球第二大豆科作
物, 是我国重要的油料作物和经济作物, 是重要的
植物油和蛋白质来源。联合国粮农组织的统计数据
显示, 2009年全球花生总产 3 552万吨, 而我国花生
第 8期 陈小平等: 两个南方花生主栽品种荚果与叶片基因表达谱分析 1379


总产占全球的 1/3, 约 1 334万吨[1], 居世界首位, 在
世界花生生产中占有举足轻重的地位。如何确保我
国花生生产优势, 传统育种技术在改良花生品质、
提高花生产量和抗逆性方面已经捉襟见肘。现代分
子生物学技术在其他作物中的成功应用为花生分子
育种技术的发展提供了重要的借鉴[2-3]。
现代分子生物学技术的发展特别是基因芯片技
术的迅速发展为从基因组或转录组整体的角度研究
多基因控制的复杂性状的分子机制提供了新的思路
和解决方法[4-5]。基因芯片是 20世纪 90年代初发展
起来的一门高通量分析技术。1995 年, Schena 等[4]
在 Science上首次发表基因芯片研究的论文, 之后基
因芯片技术及其应用的发展突飞猛进。目前已成为
研究高等生物基因表达的强有力工具[6]。而表达谱
芯片是非模式物种进行功能基因组学研究比较常用
的芯片类型, 其研制基于大量的表达基因序列, 可
以从整个转录组水平研究某个组织或某种逆境胁迫
下的基因表达谱。近几年花生大规模的 EST测序为
研制高密度花生表达谱芯片奠定基础。花生 EST序
列从 2006年 GenBank收录的 3 000条左右攀升至目
前(截至 2010年 12月 1日)的 86 943条(http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/dbEST_summary.html)。这些
EST序列来自花生的不同组织或器官(荚果、叶和根
等)、经过生物或非生物胁迫处理(如干旱和病原菌侵
染等), 为花生基因组学研究提供了丰富的基因序列
资源。
花生表达谱芯片的应用始于 2005 年[7], 但当时
所用的芯片仅含有 384个基因, 芯片的密度远不能满
足功能基因组学研究的需要。2009 年, Payton 等[8]
报道了一张包含 15 744个探针的高密度的花生表达
谱芯片, 并用于不同组织表达谱分析, 鉴定花生组
织特异性表达基因。本研究中所用的高密度表达谱
芯片与 Payton的芯片基本相似, 因 EST序列的来源
基本相同[9-10]。作为源库器官的花生叶和荚果是影响
花生产量形成的主要因素, 也是一些生物和非生物
胁迫危害的主要器官, 但是迄今对花生叶和荚果的
发育以及抗逆等的遗传机制知之甚少[11]。本研究目
的就是通过采用高密度花生基因芯片建立 2 个南方
花生主栽品种的荚果和叶片的基因表达谱, 分析 2
个品种在荚果与叶片发育过程中的基因表达差异 ,
提供花生荚果与叶片整体转录水平的基因表达信息
以及差异表达基因的功能信息, 为揭示花生产量形
成的分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
粤油 7 号是由广东省农业科学院作物研究所选
育的高产花生品种 , 目前在南方已经大面积推广 ,
汕油 523是国家花生南方区试的对照品种, 是 20世
纪 90年代南方主栽花生品种。从二者选育系谱来看,
均与伏花生和狮头企有亲缘关系[12], 而粤油 7 号比
汕油 523增产 10%以上。根据 Boote (1982)定义的花
生生殖生长时期[13], 分别在 R3、R4、R5、R6和 R7
期取相应的荚果及同时期的叶片。之后立即用液氮
将其速冻, –80℃保存备用。
1.2 总 RAN提取与纯化
采用改良的 CTAB 法提取总 RNA[14], 通过
NanoDrop与 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 RNA纯度和
完整性。采用 Qiagen公司的 DNase I Set去除 RNA
样品中 DNA, 然后使用 Qiagen的 RNeasy MinElute
Cleanup试剂盒去除 DNase I。
1.3 荧光标记与芯片杂交
花生表达谱芯片由美国农业部农业研究局海岸
与平原实验站郭宝珠博士惠赠。芯片试验由北京博
奥生物有限公司完成, 以样品 Total RNA起始, 使用
晶芯 cRNA 扩增标记试剂盒进行荧光(Cy5-dCTP 和
Cy3-dCTP)标记。以含有 T7 启动子序列的 T7
Oligo(dT)Primer为引物, 使用 CbcScript酶合成第 1
链 cDNA。用 RNase H 将杂合链中的 RNA 切成短
片段, DNA Polymerase以 RNA短片段为引物延伸, 合
成第 2链 cDNA, 并纯化双链 cDNA。以 cDNA为模
板, 利用 T7 Enzyme Mix合成 cRNA; 然后用 RNA
Clean-up Kit (MACHEREY-NAGEL, Germany)将其
纯化。取 2 g cRNA, 用 CbcScript II酶, 随机引物
(Random Primer)进行反转录 , 用 PCR NucleoSpin
Extract II Kit (MACHEREY-NAGEL, Germany)纯化
反转录产物。取纯化后的反转录产物, 以随机引物
进行 KLENOW酶标记, 其中 Cy5-dCTP、Cy3-dCTP
购自 GE Healthcare (Cat. No. PA 55021/PA 53021),
用 PCR NucleoSpin Extract II Kit (MACHEREY-
NAGEL, Germany)纯化标记产物。标记的 DNA溶于
80 L杂交液(3×SSC, 0.2%SDS, 5×Denhart’s, 25%甲
酰胺), 于 42℃杂交过夜。其后, 先用 42℃左右含
0.2% SDS, 2×SSC的液体中洗 5 min, 再以 0.2×SSC
室温洗 5 min。将玻片甩干后用 LuxScan 10KA双通
道激光扫描仪(CapitalBio 公司)扫描。采用 LuxScan
4.0 图像分析软件(CapitalBio 公司)分析芯片图像 ,
1380 作 物 学 报 第 37卷

把图像信号转化为数字信号; 根据 cy5和 cy3总体信
号的全局平均值对各芯片进行片间线性校正, 使得
各张芯片的全局平均值相同。采用 Lowess 方法[15]
进行归一化。根据信号强度和图像质量删除荧光信
号弱的基因以及芯片上的阴性对照、内标、外标等
冗余的数据。因为试验中每个样品均采用了荧光交换,
所以首先进行 ratio值整合, ratio = (ratio 1 × ratio 2)0.5,
由于每个基因有 3个以上重复 ratio, 因此用 SAM软
件分析[16], FDR控制在 5%以内, 再以 2倍标准筛选
差异表达基因。
1.4 基因功能注释
采用 NCBI BLAST软件的 Blastx程序将差异表
达基因与Uniprot数据库进行相似性比对分析, 设置
E 值小于 10–5。取比对结果的第一条记录作为该基
因的功能注释信息。在此基础上, 利用 Uniprot蛋白
的 GO 功能注释文件, 获取被注释的差异表达基因
对应的 GO编号(GO ID), 进而获取该基因的 GO功
能分类注释信息。
1.5 qRT-PCR验证差异表达基因
对芯片分析获得的粤油 7 号和汕油 523 之间有
差异的 4个基因进行荧光实时定量 PCR验证。根据
芯片上探针组对应的代表序列, 利用 Primer6.0软件
设计 PCR引物(表 1)。以组成型表达基因 actin作为
内参基因。每个样品中取 2 g总 RNA进行反转录,
反转录酶 SuperScript III, 反应体积 20 L, 在反转
录产物中加水 80 L稀释之后用于 qRT-PCR分析。
应用 Roche SYBR Green PCR Master Mix试剂盒的
反应体系, 反应所用仪器为 Roche LighterCycler 480
(Roche, Switzerland), 反应扩增循环为 95 10 min; ℃
95 15 s, 60 1 min, 40℃ ℃ 个循环。每个反应 3个重复,
最后取平均值。
2 结果与分析
2.1 花生荚果与叶片总 RNA分析
荚果和叶片总 RNA 电泳条带清晰, 28S 与 18S
rRNA条带的亮度比大于 1 (图 1), RNA的 A260/A280
的吸光度比值介于 2.01~2.04 之间(表 2), 表明 RNA
质量符合芯片杂交的需要。从电泳图分析, 2个品种
的叶片总 RNA在 18S rRNA处均出现 3条带, 在花
生相同时期的其他品种叶片总 RNA 中也有相似的
条带出现, 证明这 3 条带并非降解所致, 而是叶片总
RNA 所特有的条带。由于叶片和荚果 RNA 条带上
的差异, 进行基因芯片实验时, 分别将荚果和叶片
分为 2组进行分析, 从而避免因为起始 RNA的差异
影响分析结果。
2.2 荚果基因表达谱分析
试验分别提取粤油 7 号荚果和汕油 523 荚果
RNA, 在进行逆转录反应时, 采用荧光交换方法将
(1)粤油 7号RNA标记Cy3, 汕油 523 RNA标记Cy5;
(2)粤油 7号RNA标记Cy5, 汕油 523 RNA标记Cy3。
对芯片扫描后的图像采用 LuxScan4.0 图像分析软件,
把图像信号转化为数字信号。为了校正 Cy5、Cy3
标记体系间的系统误差, 将所得的数据通过软件进
行归一化处理。在删除了荧光信号弱的基因以及芯
片上的阳性对照、阴性对照等冗余数据之后, 荧光
交换的 2张芯片上均检测到的基因总共有 4 983个。
在芯片分析中, 散点图(scatter plot)可以比较直观地
显示 2 个样品之间差异表达基因。图 2-A 的横坐标
和纵坐标分别代表粤油 7 号和汕油 523 样品与芯片
杂交后的荧光信号强度, 图中每一个数据点代表芯
片上一个基因的杂交信号, 红色标记和绿色标记分
别表示汕油 523 与粤油 7 号的 ratio 值大于 2 和小

表 1 实时定量 RT-PCR分析的引物
Table 1 List of primers for qRT-PCR analysis
探针
Probe
引物序列
Primer sequence (5–3)
扩增效率
Primer efficiency
扩增子大小
Amplicon size (bp)
4262 F: CGGTATTGGTGTCTCTGAGTGAAT 1.937 105
R: ACAGCAGCAAGATATTGGAGTAGTC
8177 F: TGGTGGCAGATGGAGGTTGATTA 1.943 120
R: GAGAGTATATGAAAGGACCCGAACAT
483 F: CACCATCAAGATATGCGGCTCTGT 1.859 134
R: TGCTCTAAATGCTGCTGGACTTGG
3809 F: AACGAAGCCAAGTGACGAAGATA 1.882 99
R: AGCAATTCAAGAATGGTGACATCAG
actin F: GTTCCACTATGTTCCCAGGCA 1.881 83
R: CTTCCTCTCTGGTGGTGCTACA
第 8期 陈小平等: 两个南方花生主栽品种荚果与叶片基因表达谱分析 1381




图 1 粤油 7号和汕油 523荚果和叶片总 RNA电泳图
Fig. 1 Electrophoretic gel image of total RNA from pods and
leaves of Yueyou 7 and Shanyou 523
1: 粤油 7号叶片总 RNA; 2: 粤油 7号荚果总 RNA; 3: 汕油 523
叶片总 RNA; 4: 汕油 523荚果总 RNA。
1: RNA from Yueyou 7 leaf; 2: RNA from Yueyou 7 pod; 3: RNA of
Shanyou 523 leaf; 4: RNA from Shanyou 523 pod.

于 0.5的数据点, 代表差异表达基因, 而黑色标记表
示汕油 523 与粤油 7 号之间的 ratio 值在 0.5 和 2.0
之间, 代表表达无差异的基因。粤油 7号和汕油 523
之间有大量的基因在荚果发育过程中差异表达, 从
图可比较清楚地看到上调和下调基因数目基本相近。
按照 2.0/0.5 (ratio>2.0 或 ratio<0.5)筛选标准,
汕油 523 和粤油 7 号荚果差异表达基因共有 1 383
个, 其中上调表达基因 662个, 下调表达基因共 721
个。上调表达 50 倍以上的基因只有 1 个(ratio=
73.6502), 40~50 倍之间的基因有 2 个(ratio=49.2931
和40.1348), 30~40倍之间的基因有3个(ratio= 34.6039,
31.1410, 31.1067)。下调表达的基因 ratio值小于 0.01
的基因有 3个(ratio=0.0084, 0.0062, 0.0059)。图 3表示
小于 0.5 和大于 2.0 的不同 ratio 范围所对应的下调
和上调表达基因数量的分布, 其中差异在 0.4~0.5的
下调基因和差异在 2.0~3.0 的上调基因分别占下调
和上调基因的 37%和 65%。
2.3 叶片基因表达谱分析
与荚果芯片杂交程序相同, 分别提取粤油 7 号
和汕油 523叶片RNA, 在进行逆转录反应时, 采用 2
种方法标记 , 经过与荚果芯片相同的数据处理后 ,
在荧光交换的 2 张芯片上均检测到的基因总共有

表 2 粤油 7号和汕油 523荚果和叶片总 RNA
Table 2 Total RNA from pod and leaf of Yueyou 7 and Shanyou 523
品种
Cultivar
样品编号
Sample number
样品状态
Sample state
A260/280 A260/230
浓度
Concentration (µg µL–1)
电泳结果
Assay results
粤油 7号 7L DEPC H2O 2.04 2.40 1.38 RNA available
Yueyou 7 7S DEPC H2O 2.02 2.37 2.86 RNA available
汕油 523 523L DEPC H2O 2.01 2.37 1.93 RNA available
Shanyou 523 523S DEPC H2O 2.01 2.38 2.59 RNA available



图 2 粤油 7号和汕油 523荚果(A)和叶片(B)比较分析散点图
Fig. 2 Scatter plots of relative gene expression in pod (A) and leaf (B) between Shanyou 523 and Yueyou 7
横坐标轴(X轴)表示粤油 7号的荧光强度, 纵坐标轴(Y轴)表示汕油 523的荧光强度。红色表示汕油 523相对于粤油 7号上调表达的
基因(比值大于 2), 绿色表示汕油 523相对于粤油 7号下调表达的基因(比值小于 0.5), 黑色表示汕油 523相对于粤油 7号表达无显著
差异的基因(比值介于 0.5~2.0之间)。
Intensity_7S on the X-axis represents the fluorescence intensity of pod genes of Yueyou 7. Intensity_523S on the Y-axis represents the
fluorescence intensity of pod genes of Shanyou 523. Intensity_7L on the X-axis represents the fluorescence intensity of leaf genes of Yueyou
7. Intensity_523L on the Y-axis represents the fluorescence intensity of leaf genes of Shanyou 523. The red points represent up-regulated
expressed genes (ratio > 2). The green points represent down-regulated expressed genes (ratio < 0.5). The black points represent gene expres-
sion almost indifferently (ratio > 0.5 and ratio < 2).
1382 作 物 学 报 第 37卷



图 3 粤油 7号与汕油 523荚果和叶片 ratio值与差异表达基因分布
Fig. 3 Distribution of differentially expressed genes corresponding to different ratios for Yueyou 7 and Shanyou 523

5 116个, 与荚果中检测的基因数接近。如图 2所示,
虽然粤油 7 号和汕油 523 之间荚果和叶片中检测的
基因数量基本相同, 但叶片中差异表达基因的数量
却明显少于荚果中差异表达基因。按照 2.0/0.5 (ra-
tio>2.0或 ratio<0.5)筛选标准, 汕油 523和粤油 7号
叶片中差异表达基因一共有 647 个, 约为荚果中差
异表达基因的一半, 其中上调表达基因 234 个, 下
调表达基因共 413个。上调表达基因 ratio值分布在
2.0028~13.7332 之间, 其中上调表达 10 倍以上的基
因只有 2 个(ratio=13.7332 和 13.3363)。下调表达基
因 ratio值分布在 0.0252~0.4996之间, 其中下调表达
的基因中没有 ratio 值小于 0.01 的基因, ratio 值在
0.01~0.10之间的基因也只有 5个(ratio=0.0252, 0.0430,
0.0834, 0.0885, 0.0932)。图 3表示荚果和叶片中小于
0.5和大于 2.0的不同 ratio范围所对应的下调和上调
表达基因数量的分布, 叶片中 ratio值在 0.4~0.5的下
调表达基因和在 2.0~3.0 的上调表达基因分别占下
调和上调基因的 63%和 85%。
2.4 荚果与叶片基因表达谱比较分析
2个品种的荚果和叶片检测的基因数量基本相同
(荚果为 4 983个, 叶片为 5 116个), 其中有 4 108个
基因在荚果和叶片芯片中都被检测到, 但差异表达
基因数量荚果(1 383个)是叶片(647个)的 2倍。比较
图 3 中荚果和叶片中 ratio 值对应的基因数量变化,
叶片中下调表达基因主要分布在 0.3~0.5之间, 上调
表达基因主要分布在 2.0~3.0之间, 而荚果的下调表
达基因在 0.01~0.03 之间分布基因数量占整个荚果
下调表达基因的一半以上 , 而且位于 0.01~0.10、
0.1~0.2 和 0.2~0.3 范围的基因数量基本相同。另外,
图 4 显示在粤油 7 号和汕油 523 荚果和叶片中差异
表达基因的相互重叠关系。在 2个器官中都存在差异
表达的基因共有 177个, 其中在叶片和荚果中都上调
表达的基因有 32 个, 同时下调表达的基因有 38 个,
表明尽管荚果和叶片中有着相同的差异表达基因 ,
但是相对于整体的差异表达基因, 荚果与叶片中表
达趋势一致的基因在数量上较少, 而且 2 个器官基
因表达的上调或下调以及上、下调的显著程度都存
在差异。
上述结果从整体转录水平阐述了 2 个品种之间
无论从差异基因的数量, 还是差异基因的显著性都
是荚果高于叶片, 而且 2个器官中差异表达趋势一致
的基因相对较少。这些结果表明荚果与叶片作为不
同生物学功能的器官, 其形态与功能上的差异部分
源于其发育过程中的基因表达的差异, 这种表达水
平的差异不仅表现在差异表达基因的特异性, 而且
也表现在差异表达的显著性上, 同时表明 2个品种在
产量上差异, 就荚果与叶片 2 个器官而言, 遗传调控
对荚果的影响大于叶片。
2.5 差异表达基因功能注释
为进一步分析 2个花生品种粤油 7号和汕油 523
荚果和叶片基因表达谱, 挖掘可能在荚果和叶发育
过程中起作用的重要基因以及这些基因在 2 个主要
器官的发育对 2 个品种在产量上存在显著差异的可
能贡献, 在上述对基因芯片所有基因进行整体分析
第 8期 陈小平等: 两个南方花生主栽品种荚果与叶片基因表达谱分析 1383




图 4 粤油 7号和汕油 523种子和叶片上调和下调差异表达基因的韦恩图
Fig. 4 Venn diagram showing numbers of differentially expressed genes between pods or leaves of Yueyou 7 and Shanyou 523

基础上, 这里着重分析差异表达基因的功能。根据
GO 分类系统将荚果和叶片中差异表达的 1 383 和
647 个基因的功能分类注释(表 3)。结果表明无论是
荚果还是叶片, 分子功能和生物学过程所占的比例
均大于细胞组分。在分子组分中, 主要包括细胞内
成分(intracellular)和膜(membrane)。在生物学过程中
差异表达基因主要归于 3类, 包括代谢过程(metabolic
process), 细胞过程 (cellular process)和生物学调控
(biological regulation)。在分子功能中差异表达基因
主要分为结合活性 (binding)和催化活性 (catalytic
activity)。除了在上调和下调表达差异基因都归属的
类别之外, 尚有少数类别只在荚果或叶片的上调或
下调中有此功能分类, 如生物学过程中的发育过程
(developmental process)只在荚果和叶片的下调基因
中存在此类基因, 而在 2个组织的上调基因中没有发
现。这些类别对特定的发育过程有何作用, 还需要
进一步的研究。
GO 分类可以从整体水平分析基因表达差异, 阐
明导致不同品种或组织器官形成发育过程中产生差
异的主要功能类别。但是, 为了更明确地了解差异
显著基因的具体功能, 我们逐一分析荚果和叶片中
上调或下调在 10倍以上的基因。结果发现其中有接
近一半的基因功能未知。叶片中上调表达 10倍以上
的基因只有 2 个, 其功能都为假定的, 一个为假定
的 F7F22.17 (F7F22.17, putative), 另一个是假定未
知功能蛋白(putative uncharacterized protein)。而下调
10倍以上的基因有 5个, 其中 2个在 Uniprot数据库
中没有匹配基因, 另外 3 个中, 一个也是假定未知
功能蛋白(putative uncharacterized protein), 一个为
Arachin Ahy-1, 还有一个为富含脯氨酸蛋白
(proline-rich protein)。荚果中上调和下调表达 10倍
以上的基因分别有 52个和 105个, 表 4中仅列出荚
果中差异表达 20倍以上的基因, 其中下调表达基因
44 个, 上调表达基因 16 个。在 44 个下调表达基因
中, 15个(34.09%)基因功能未知, 而上调表达基因中
有近一半(7/16)的基因功能未知。上述结果表明花生
荚果与叶片中有大量的基因需要进一步的研究确定
其功能, 其中某些基因可能是花生所特有的功能基
因, 这些基因很难通过生物信息学的序列相似性分
析注释其生物学功能。
荚果中已知功能的下调表达基因中过敏原蛋白
有 8 个, 另外还包括一些荚果贮藏蛋白和油体蛋白,
除此之外还有一些与抗逆或发育相关的功能蛋白
也显著下调表达 , 包括干燥相关蛋白(dessication-
1384 作 物 学 报 第 37卷

表 3 种子和叶片中差异表达基因的 GO功能分类
Table 3 Statistics of YY523 differentially expressed genes assigned to GO functional categories
本体
Ontology
基因本体术语
GO term
L_down L_up P_down P_up
Biological regulation 21 17 63 40
Cell proliferation 1 1 – –
Cellular component organization 7 4 16 29
Cellular process 124 82 172 210
Developmental process 2 – 5 –
Establishment of localization 19 8 34 43
Localization – – 1 –
Metabolic process 134 65 170 218
Multicellular organismal process – – 1
Response to stimulus 6 12 14 14
生物过程
Biological process
Signaling 2 – – 1

Cell
Cell surface – 2 – –
Endomembrane system – 1 1 1
Envelope 2 1 3 14
External encapsulating structure 3 3 8 10
Intracellular 96 85 96 215
Membrane 54 37 93 73
Extracellular region 6 6 8 14
细胞组分
Cellular component
Macromolecular complex – – 1 –

Antioxidant activity – 5 5 3
Binding 202 147 363 342
Catalytic activity 290 192 507 577
Electron carrier activity 16 13 14 16
Enzyme regulator activity 3 2 11 14
Molecular transducer activity 6 5 4 3
Protein binding transcription factor 1 – – –
Sequence-specific DNA binding transcription
factor activity 2 6 10 8
Structural molecule activity 10 7 4 23
Transcription regulator activity 1 1 2 3
分子功能
Molecular function
Transporter activity 13 5 23 25
L_down: 叶片中下调表达的基因; L_up: 叶片中上调表达基因; P_down: 荚果中下调表达的基因; P_up: 荚果中上调表达基因。
L_down: the number of down-regulated genes in leaf; L_up: the number of up-regulated genes in leaf; P_down: the number of
down-regulated genes in pod; P_up: the number of up-regulated genes in pod.

related protein)、金属硫蛋白(metallothionein)、胚发
育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein)、
钙离子结合延伸因子蛋白 (Ca2+-binding EF hand
protein)、几丁质酶(chitinase)、木葡聚糖内糖基转移
酶(xyloglucan endotransglucosylase)以及葡萄糖与核
糖醇脱氢酶(glucose and ribitol dehydrogenase)等, 该
结果与 Payton 等[8] 髙检测到的荚果 丰度表达基因相
同。上调表达的已知功能基因有类枯草杆菌蛋白酶
种子特异性蛋白(subtilisin-like seed-spcific protein)、
Kunitz 胰蛋白酶抑制剂(Kunitz trypsin protease in-
hibitor)、肌醇-3-磷酸合酶(myo-inositol-3-phosphate
synthase)以及初级氨基氧化酶 (primary amine oxi-
dase)等。
2.5 荧光定量验证差异表达基因
为了验证芯片数据的可靠性, 挑取上调表达基因
(AH004262 和 AH000483)和下调表达基因(AH008177
第 8期 陈小平等: 两个南方花生主栽品种荚果与叶片基因表达谱分析 1385


表 4 荚果中上调和下调 20倍以上的差异表达基因功能注释
Table 4 Functions of up- and down-regulated expressed genes (ratio>20 or ratio<0.05) in pods
下调表达基因 Down-regulated genes 下调表达基因 Down-regulated genes
基因 ID
Gene ID
ratio 假定功能
Putative function
基因 ID
Gene ID
ratio 假定功能
Putative function
AH003313 0.0059 Desiccation-related protein PCC13-62 AH006302 0.0350 Arachin ahy-2
AH008177 0.0062 Putative uncharacterized protein AH006425 0.0374 Xyloglucan endotransglucosylase
AH005769 0.0084 Type 4 metallothionein AH000772 0.0382 Unknown
AH004043 0.0119 Arachin ahy-2 AH007763 0.0396 51 kDa seed maturation protein
AH001441 0.0131 Putative uncharacterized protein AH007249 0.0404 Unknown
AH005563 0.0154 Putative uncharacterized protein AH005943 0.0412 LEA protein (fragment)
AH001241 0.0154 Putative uncharacterized protein AH005920 0.0420 Sucrose binding protein homolog S-64
AH001696 0.0155 Predicted protein AH001160 0.0447 Oleosin
AH007659 0.0170 Iso-ara h3 AH001917 0.0466 Em protein
AH006277 0.0182 Allergen AH005027 0.0480 Glucose and ribitol dehydrogenase homolog 1
AH003074 0.0193 Maturation protein pPM32 AH002434 0.0480 Predicted protein
AH006128 0.0195 Late embryogenesis abundant protein 2 AH007813 0.0487 Oleosin 1
AH005467 0.0195 Conarachin
AH005650 0.0196 Type 4 metallothionein 上调表达基因 Up-regulated genes
AH000588 0.0206 Putative uncharacterized protein
AH001748 0.0209 Putative uncharacterized protein
基因 ID
Gene ID
ratio 假定功能
Putative function
AH000555 0.0217 11S seed storage globulin AH004262 73.6502 Predicted protein
AH007538 0.0220 Unknown AH007777 49.2931 Unknown
AH005615 0.0250 Ca+2-binding EF hand protein AH002603 40.1348 Subtilisin-like seed-specific protein
AH000851 0.0263 Putative uncharacterized protein AH001524 34.6039 Putative uncharacterized protein
AH003348 0.0267 Unknown AH006802 31.1410 Kunitz trypsin protease inhibitor
AH000401 0.0268 Iso-Ara h3 AH001020 31.1067 Acid beta-fructofuranosidase
AH001501 0.0278 11S globulin-like protein AH006347 26.2709 Lectin (Fragment)
AH001730 0.0280 Putative uncharacterized protein AH004306 25.8675 Myo-inositol-3-phosphate synthase
AH005210 0.0283 Conarachin (fragment) AH001988 25.4581 Putative uncharacterized protein
AH007709 0.0294 Seed maturation protein AH002378 23.8009 Primary amine oxidase (fragment)
AH004843 0.0296 Putative uncharacterized protein AH004424 23.6958 Unknown
AH000844 0.0297 Chitinase (class II) AH003682 23.4186 Unknown
AH008060 0.0303 Ara h 7 allergen AH001961 22.8328 Lectin
AH000080 0.0309 Ara d 6 AH002427 22.3004 Putative uncharacterized protein
AH006137 0.0312 Conarachin AH002544 21.9758 Periplasmic beta-glucosidase, putative
AH000375 0.0322 Allergen Gly m Bd 28K (fragment) AH007428 21.8277 Vicianin hydrolase (fragment)

和 AH003809), 根据表达谱芯片杂交探针对应的
EST 序列设计引物。通过 RT-PCR 检测粤油 7 号和
汕油 523的荚果和叶片中基因的表达量变化(表 5)。
试验中以花生 actin基因作为内参基因, 每个基因均
设 3 次重复验证差异的稳定性。结果表明 RT-PCR
与表达谱芯片结果基本吻合 , 荚果差异表达基因
qRT-PCR 的检测结果与芯片完全吻合 , 叶片的
qRT-PCR 结果虽然在比值上存在差异, 但是其上调
或下调的趋势却是一致的, 从而证明了表达谱芯片
检测结果的可靠性。
3 讨论
如何确定大量基因序列的功能, 并通过高通量
分析技术了解基因与基因之间互作调控机体代谢和
发育机制, 成为功能基因组学研究的核心问题[17]。
通过把产量性状分解为多个具体的构成因素, 为定
位和克隆产量性状相关 QTL/基因提供新的思路[18-19]。
花生产量决定于群体光合物质生产能力、产量形成
1386 作 物 学 报 第 37卷

表 5 粤油 7号和汕油 523荚果与叶片上调或下调差异表达基因的实时定量 RT-PCR数据分析
Table 5 Analysis of real-time RT-PCR results for differentially expressed genes from pods and leaves of Yueyou 7 and Shanyou 523
目标基因表达丰度 Abundance of target gene样品名
Sample
Cp
表达丰度 Abundance 平均值 Average
标准差
SD
ratio=523/7 P-value
芯片比值
Microarray fold
change
7P-actin 27.50
7P-actin 28.01
7P-actin 27.52
523P-actin 24.34
523P-actin 24.05
523P-actin 24.43
7P-4262 30.63 15.05
7P-4262 30.27 25.95 20.31 5.46
7P-4262 30.20 19.93
523P-4262 19.81 1689.00
523P-4262 19.78 1430.00 1619.00 165.50 79.7144 3.75E-05 73.6502
523P-4262 19.85 1738.00
7P-8177 28.86 5.27
7P-8177 29.11 6.21 5.76 0.47
7P-8177 28.73 5.79
523P-8177 31.83 0.11
523P-8177 32.34 0.07 0.08 0.02 0.0144 1.57E-05 0.0062
523P-8177 32.54 0.07
7L-actin 28.80
7L-actin 28.87
7L-actin 28.77
523L-actin 30.12
523L-actin 29.68
523L-actin 29.73
7L-483 28.34 15.48
7L-483 28.33 16.19 17.14 2.29
7L-483 27.92 19.76
523L-483 22.07 1609.00
523L-483 21.85 1447.00 1359.00 303.72 79.2728 0.00078 8.7709
523L-483 22.46 1021.00
7L-3809 26.76 44.27
7L-3809 26.90 42.35 38.08 9.10
7L-3809 27.48 27.63
523L-3809 30.73 7.70
523L-3809 30.10 8.94 8.66 0.86 0.2275 0.0025 0.0252
523L-3809 30.08 9.35
Cp(crossing point): 当荧光强度大于背景值时的循环数。
Cp(crossing point): PCR cycle at which product fluorescence intensity finally rises above background and becomes visible; SD: stan-
dard deviation.

期所生产的光合产物分配到荚果中的比率和产量形
成期的长、短 3 个因素。其中涉及的最主要 2 个器
官为荚果和叶片。本研究通过高密度花生基因芯片
技术比较近 20 年来在南方广泛种植, 其育成系谱相
近, 而在产量上存在显著差异的 2个花生品种的荚果
和叶片基因表达谱, 从整体基因表达水平分析这 2
第 8期 陈小平等: 两个南方花生主栽品种荚果与叶片基因表达谱分析 1387


个品种的差异。由于基因芯片检测灵敏度非常高 ,
芯片上的杂交反应是芯片检测的关键一步, 多种因
素影响着杂交结果的准确性和可靠性[5,20]。本研究采
用荧光交换并整合 2张芯片结果, 同时运用 real time
RT-PCR法验证差异表达基因, 发现基因芯片和实时
定量 PCR 两组数据的变化趋势一致, 进一步证明芯
片结果的可靠性。虽然叶片中差异表达基因使用
qRT-PCR 检测的上调或下调倍数与基因芯片检测倍
数差异很大, 但其上调或下调的趋势是一致的, 2种
检测方法的这种差异是正常的[21-22]。
2 个花生品种荚果和叶片基因表达谱分析结果
表明, 在荚果中的差异表达基因的数量是叶片中的
2 倍(图 2), 其上调和下调基因的显著性均远远大于
叶片(图 3)。因此, 对粤油 7号和汕油 523在产量上
显著差异的影响, 荚果基因表达大于叶片。功能分
类结果表明, 差异表达基因主要集中在生物学过程
和分子功能两大类(表 3), 进一步分类表明代谢过程、
催化活性和结合功能等为差异基因的主要功能类别,
而荚果和叶片的功能分类基本相似。导致粤油 7 号
和汕油 523 在荚果和叶片形态结构和其功能差异的
基因的功能相似, 表明其遗传调控机制可能存在相
似之处。表 4 显著上调基因功能注释结果表明导致
粤油 7 号和汕油 523 荚果差异的基因有一部分功能
未知, 而已知功能的主要是贮藏蛋白(过敏原在某种
意义上也是贮藏蛋白)和抗逆相关蛋白, 这是否表明
粤油 7 号在某种程度上通过增加抗性和贮藏蛋白而
使其产量得到提升, 当然, 未知功能基因的作用尚
需进一步研究。
总之, 本研究尝试从基因表达水平分析这 2 个
南方主栽花生品种的差异, 并明确二者之间差异表
达基因的功能。虽然无法阐明基因差异及其功能与
2 个花生品种在产量差异上的直接关系, 但是在一
定程度上为将来从荚果和叶片角度研究花生产量奠
定基础。为将来研究它们之间在形态结构和功能上
的差异, 以及这些差异导致产量差异中的作用提供
一些有用的基因表达信息。而且一些在 2 个品种之
间表达差异极其显著而功能未知的基因, 也将激发
我们对花生荚果发育遗传调控机制进行深入研究的
兴趣。
4 结论
检测到汕油 523 和粤油 7 号品种间在荚果和叶
片中差异表达基因分别有 1 383个和 647个, 其中荚
果中上调表达基因 662个, 下调表达基因 721个, 叶
片中上调表达基因 234 个, 下调表达基因 412 个。
差异表达基因功能主要为代谢过程、细胞过程、生
物调控、结合功能和催化活性等。
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