全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(8): 1374−1380 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2006AA100105); 教育部长江学者和创新团队发展计划项目(IRT0432); 高等学校创新引智
计划项目(B08025)
作者简介: 陈天子(1981−), 男, 博士研究生, 研究方向为棉花组织培养和基因工程。E-mail: actzi0503@gmail.com
*
通讯作者(Corresponding author): 张天真, 教授。Fax: 025-84395307; E-mail: cotton@njau.edu.cn
Received(收稿日期): 2007-10-30; Accepted(接受日期): 2008-03-14.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01374
新疆棉花 4个主栽品种的体细胞胚胎发生及植株再生
陈天子 吴慎杰 李飞飞 郭旺珍 张天真*
(南京农业大学棉花研究所 / 作物遗传与种质创新国家重点实验室, 江苏南京 210095)
摘 要: 以新疆 4 个主栽棉花品种新陆中 20、新陆早 24、新陆早 33 和 03298 为材料, 通过不同浓度的激素组合成
功地诱导获得了体细胞胚并进一步发育成苗。研究发现, 所用的 4种激素组合均能有效诱导愈伤组织, 其中又以 0.02
mg L−1或 0.10 mg L−1 KT和 0.1 mg L−1 2,4-D组合的诱导效果最佳; 两个诱导措施有利于胚性愈伤组织的产生, 即沿
中柱纵切棉花下胚轴切段, 并以纵切面接触培养基; 愈伤组织诱导培养基中 KNO3用量加倍。挑选黄绿色、灰绿色或
浅绿色的质地疏松的愈伤组织继代于无激素且 KNO3 含量加倍的培养基中可产生胚性愈伤组织, 并在高比例 KT/2,
4-D(0.05 mg L−1或 0.10 mg L−1 KT和 0.01 mg L−1 2,4-D)促进下发育成胚。借助在培养基上垫滤纸产生干燥作用, 并
间隔使用强透气效果的棉塞对培养三角瓶进行透气处理, 体细胞胚可成熟发育并产生根系发达的正常再生植株。应
用此法, 4个实验材料在 6~8个月内即可获得大量再生苗。
关键词: 棉花; 体细胞胚胎; 植株再生
In vitro Regeneration of Four Commercial Cotton (Gossypium hirsutum
L.) Cultivars Grown in Xinjiang, China
CHEN Tian-Zi, WU Shen-Jie, LI Fei-Fei, GUO Wang-Zhen, and ZHANG Tian-Zhen*
(National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement / Cotton Research Institute, Nanjing Agricultural University, Nanjing
210095, Jiangsu, China)
Abstract: Cotton grown in Xinjiang is critical to successful cotton production in China. Genetic improvement in cotton via bio-
technology is limited due to lack of an efficient regeneration system. Here, an efficient somatic embryo procedure was developed
to regenerate plantlets from hypocotyls of cotton cultivars Xinluzhong 20, Xinluzao 24, Xinluzao 33 and 03298 grown in Xinjiang.
Calli were effectively produced on the medium with 0.01–0.10 mg L−1 Kinetin (KT) and 0.10 mg L−1 2,4-Dichlorophenoxyacetic
acid (2,4-D), especially with 0.02 or 0.10 mg L−1 KT and 0.10 mg L−1 2,4-D. Split hypocotyl segments and double amounts of
KNO3 in the medium during induction of calli were beneficial to the emerge of embryogenic calli. Embryogenic calli and globu-
lar-stage somatic embryos were effectively initiated with high concentration of KT and low concentration of 2,4-D in ECM media
(0.05 or 0.10 mg L−1 KT and 0.01 mg L−1 2,4-D). Embryos further developed into plantlets in MSBF medium under conditions of
dehydration and ventilization achieved respectively by filter paper on medium and cotton tampon sealing flask. Using this proto-
col, normal plantlets with strong roots well developed from these cotton cultivars for 6 to 8 months, increasing the range of cotton
genotypes that can be regenerated. The successful regeneration protocol established in this study can be used to improve cotton
cultivars by genetic engineering.
Keywords: Gossypium hirsutum L.; Regeneration; Somatic embryogenesis
棉花是世界性的重要经济作物和可再生资源 ,
除了提供纺织原材料、食用植物油、动物饲料蛋白
外, 其副产品经多次加工后, 可以开发出满足人们
消费需求的多种产品。自首例由培养两年多的陆地
棉 Coker 310 愈伤组织中获得体细胞胚胎发生的再
生植株报道以来 [1], 利用体细胞胚胎发生途径进行
第 8期 陈天子等: 新疆棉花 4个主栽品种的体细胞胚胎发生及植株再生 1375


无性系突变体筛选和遗传转化已成为棉花育种的有利
手段之一。但棉花体细胞胚胎发生受基因型限制[2], 已
报道体细胞胚胎发生的陆地棉多为 Coker棉[3-8]或有
Coker 棉遗传背景的品种[9-10]。当前, 把外源基因导
入棉花推广品种常采取的方法是“Coker 棉介质法”,
即先把外源基因导入易于再生的 Coker 棉或有
Coker 棉遗传背景的品种, 获得外源基因纯合的中
间品种, 然后以中间品种与推广品种进行杂交培育
转基因棉花[11]。这是国际上培育转基因棉花的通用
方法。但该法需进行杂交育种, 无疑延长了转基因
棉花的培育过程。此外, 由于性状连锁的原因, 中间
品种本身的一些不良农艺性状随外源目的基因进入
培育品种之中。这是育种者和棉农所不期望的。随
着转基因棉种植面积的不断扩大, 拓宽可再生棉花
基因型, 尤其是重要推广品种的胚胎发生, 亦变得
日益紧迫。目前, 已有一些品种通过体细胞胚胎发生
成功再生[12-17], 但远未能满足市场和生产的需要[18]。
建立更多推广品种的体细胞胚胎发生再生体系无疑
将大大推进棉花转基因育种的进程[19]。
新疆位于我国西北部, 气候干燥, 日照充足、热
量丰富、有效积温高, 日照时间多、无霜期长, 昼夜
温差大 , 雨水稀少 , 但灌溉水资源丰富 , 宜棉土地
资源丰富。这使得新疆成为我国第一大优质产棉区。
中国棉花协会(http://www.china-cotton.org)的统计结
果表明, 2006年中国棉花总产达 670万吨, 占世界棉
花总产的 1/4 以上; 其中新疆棉花产量占中国棉花
产量 1/3以上。但另一方面, 新疆的干旱气候也极易
造成土地的沙漠化、盐碱化和次生盐碱化; 随着棉
花生产的不断扩大, 棉田更多地采用连作, 棉花病
虫害有逐年加重趋势; 加之一些偶然的天气灾害如
霜冻、冰雹等造成不利影响。诸多因素对新疆棉花
可持续发展造成了瓶颈。因此, 新疆棉花品种的改
良, 尤其是针对新疆特定生态条件而开展的抗旱、
抗病、抗冻、高产、优质、早熟等品种培育, 将给
新疆棉花生产带来更大的发展。目前生物技术是加
快育种步伐的有效方法之一。在新疆陆地棉中, 已
有不少品种如新陆早 1 号、新陆早 4 号、新陆早 7
号、新陆早 8 号、新陆早 10 号、新陆早 17、新陆
中 2 号、新陆中 4 号等通过体细胞胚胎发生成功再
生植株[20-24], 并用于遗传转化培育转基因棉花[25-27]。
研究证明以棉花胚性愈伤组织为受体体系进行遗传
转化是高效、简易的转基因途径[28-30], 其前提是具
有体细胞胚胎发生的棉花品种。本研究以新疆陆地
棉主栽品种为材料 , 研究其体细胞胚胎发生能力 ,
以期建立新疆陆地棉有效的体细胞胚胎发生再生体
系, 扩展可再生棉花基因型, 促进新疆转基因棉研
究和生产。
1 材料与方法
新疆陆地棉品种(系)新陆中 20、新陆早 24、新
陆早 33和 03298种子由新疆康地农业科技有限公司
提供。脱绒种子经 75%酒精表面消毒 1 min, 及 30%
过氧化氢(H2O2)消毒 3~4 h后, 以无菌水冲洗 3~4次,
然后无菌水浸种 24 h至露白。在无菌条件下剥去种
皮, 将种仁接种于苗培养基上[1/2 MS+0.25% Phy-
tagel (W/V)], 28℃下暗培养 3 d后于 16 h/8 h光照周
期下培养 3 d以获取无菌苗。
切取 5~7 mm 左右的无菌苗下胚轴并沿纵轴将
其一分为二, 纵切面朝下接种于 CIM 愈伤组织诱导
培养基。CIM培养基由 MS无机盐+B5维生素+1.9 g
L−1 KNO3+3% (W/V) glucose+0.25% (W/V) Phy-
tagel+0.91 g L−1 MgCl2 组成 , 辅以多种组合的
KT(Kinetin)和 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)
(表 1)。培养 5周后, 将愈伤组织继代于 MSBP培养
基(基本组成与 CIM培养基相同, 无 KT和 2,4-D 激
素)进行增殖。2个月后, 挑选愈伤组织继代于 ECM
培养基(基本组成与 CIM 培养基相同, 附加 KT 和
2,4-D, 表 2)和无激素 MSBP培养基诱导体细胞胚胎
发生。
在体细胞胚发生后, 各发育阶段的体细胞胚均
培养于 MSBF培养基(以 1.0 g L−1谷氨酰胺和 0.5 g
L−1冬酰胺取代 MSBP 培养基中的 NH4NO3)直至分
化成苗。培养期间辅以特定的透气胁迫和营养胁迫
处理, 即在 MSBF 培养基上铺垫滤纸和间期地使用
强透气的棉塞封口以促进体细胞胚胎发育成熟。再
生苗长至 3~5 片叶时, 根系发达者经炼苗后移栽于
温室, 其余则以嫁接的方法进行繁殖。所用培养基
pH均为 5.8, 并以 121℃高压灭菌 20 min。

表 1 愈伤组织诱导培养基的组成
Table 1 Composition of callus induction medium (mg L−1)
愈伤组织诱导
培养基
Callus induction
medium
MSBP培养基的
基本组成
Medium composition
of MSBP
KT 2,4-D
CIM1 0.01 0.10
CIM2 0.02 0.10
CIM3 0.05 0.10
CIM4
MS salt + B5 vitamin +
1.9 g L−1 KNO3 +
30 g L−1 Glucose +
2.5 g L−1 Phytagel +
0.91 g L−1 MgCl2 0.10 0.10
1376 作 物 学 报 第 34卷

表 2 诱导体细胞胚胎发生的 ECM培养基
Table 2 ECM medium for induction of embryogenic calli and
embryos (mg L−1)
培养基
Medium
KT 2,4-D
ECM1 0.05 0.001
ECM2 0.05 0.005
ECM3 0.05 0.010
ECM4 0.10 0.001
ECM5 0.10 0.005
ECM6 0.10 0.010
ECM7 0.10 0.030
ECM8 0.20 0.001
ECM9 0.20 0.005
ECM10 0.20 0.010
ECM11 0.20 0.030

2 结果与分析
2.1 愈伤组织诱导
在 CIM愈伤组织诱导培养基上培养 1周后, 纵
切的下胚轴外植体开始膨大并产生愈伤组织; 4周后,
4 个品种的外植体 4 均围起了愈伤组织团。KT 和
2,4-D的 4种激素组合均能诱导愈伤组织, 但愈伤组
织诱导率在不同品种间有所差别, 最低者为 58.33%,
而最高则达 100%(表 3)。F测验(P<0.05)没有发现愈
伤组织诱导率在 4 个品种间或 4 种激素组合间存在
显著性差异。所产生愈伤组织按其颜色和质地可分
为两类 : 类型一颜色暗绿或深绿 , 部分间有白色 ,
质地紧密、坚硬; 类型二颜色浅绿、灰绿到黄绿, 质
地疏松无硬化(图 1-A)。综合考虑诱导率、颜色及质
地, 认为培养基组合 CIM4和 CIM2较适于诱导愈伤
组织。
张献龙等 [31]把棉花下胚轴外植体分为中柱组
织、形成层和形成层以外的皮层组织 3 部分; 愈伤
组织和胚状体即从形成层和皮层中发生, 而中柱组
织不能或极少能产生愈伤组织。在 CIM1、CIM2和
CIM3上培养 5周后, 纵切的下胚轴外植体外围已形
成厚厚的愈伤组织层, 露出光亮的中柱组织, 明显
地看出中柱组织与其外层组织发生分离, 且这些中
柱组织仅在外植体两端产生少量的致密坚硬的白色
或深绿色愈伤组织(图 1-A)。对于培养于 CIM4上的
外植体没有观察到中柱与其外层组织分离的现象 ,
可能是 KT 浓度的增加加快细胞分裂而模糊了这种
组织间的分离。
2.2 愈伤组织增殖和胚胎发生的诱导
如上所述, 棉花下胚轴产生的愈伤组织具有不
同的颜色和质地, 而这与再生能力有关。一般认为
类型二愈伤组织具有较强的再生能力, 而类型一愈
伤组织则较难以再生。挑选类型二愈伤组织于
MSBP 培养基继代培养 2 次后, 可获得较为一致的
质地疏松的愈伤组织; 其中品种 03298 培养 2 个月
即产生灰白色、灰黄色间红色的疏松、细颗粒状的
胚性愈伤组织(图 1-B)。说明品种 03298具有体细胞
胚胎发生的能力。其他 3 个品种继续在 MSBP 上培
养也相继产生了胚性愈伤组织。但在第 3、4轮继代
期间, 每次继代 15 d后, 4个品种在MSBP培养基上
的愈伤组织都相继出现不同程度的褐化, 并随时间
推移而逐渐加重甚至死亡(图 1-C), 所产生的胚性愈
伤组织或死亡或愈伤组织化(图 1-D)。
在 ECM培养基上, 胚性愈伤组织保持着旺盛的
活力, 并无 MSBP 培养基上所发生的褐化、死亡现
象。培养 3周后, 品种 03298分别在 ECM1、ECM2、

表 3 4个棉花品种在 CIM培养基上的愈伤组织诱导率
Table 3 Rate of callus induction of four cotton cultivars on CIM medium
新陆中 20 Xinluzhong 20

新陆早 24 Xinluzao 24

新陆早 33 Xinluzao 33

03298
培养基
Medium 外植体数 a
Number of explants a
愈伤组织率 b,c
Callus (%) b,c
外植体数
Number of
explants
愈伤组织率
Callus (%)
外植体数
Number of
explants
愈伤组织率
Callus (%)
外植体数
Number of
explants
愈伤组织率
Callus (%)
CIM1 24(14) 58.33 17(13) 76.47 17(17) 100.00 19(18) 94.74
CIM2 27(22) 81.48 13(12) 92.31 15(12) 80.00 22(20) 90.91
CIM3 36(23) 63.89 16(10) 62.50 14(10) 71.42 24(23) 95.83
CIM4 23(23) 100.00 13(13) 100.00 23(19) 82.61 19(17) 89.47
a: 每棵无菌苗仅取一个下胚轴切段诱导愈伤组织, 括号外的数字为接种外植体数, 也代表处理的无菌苗数, 括号内的数字则为
培养 4周后产生愈伤组织的外植体数。b: 外植体培养 4周后愈伤组织诱导率。c: F测验(P<0.05)发现 4种品种间和 4种 CIM培养基间
均无显著性差异。
a: only one explant from an individual of seedling was used to induce callus, so the number out of parentheses indicated the number of
explant individuals, and the number in parentheses was that of explants with callus after 4 weeks of culture. b: percentage of explants pro-
ducing callus after 4 weeks of culture. c: no significant difference among the four cultivars or among CIM media according to F test (P<0.05).
第 8期 陈天子等: 新疆棉花 4个主栽品种的体细胞胚胎发生及植株再生 1377



图 1 4个新疆棉品种的体细胞胚胎发生和植株再生
Fig. 1 Somatic embryogenesis and plant regeneration of four cotton cultivars in Xinjiang
A: 纵切的下胚轴外植体在 CIM培养基上产生愈伤组织并发生皮层与中柱分离现象; 箭头 1所示为皮层组织产生的灰绿色疏松愈伤组
织(类型二); 箭头 2所示为中柱组织; 箭头 3所示为中柱两端产生的深绿色间白色的坚硬致密状愈伤组织(类型一)。B: 圆圈所示为品
种 03298在 MSBP培养基上产生的胚性愈伤组织; C: MSBP培养基上褐化的愈伤组织; D: MSBP培养基上愈伤组织化的胚性愈伤组织
(箭头所示); E: ECM培养基上产生的浸水状愈伤组织, 其中有零星的体细胞胚。F: 经 ECM培养基诱导体细胞胚胎发生后, 胚性愈伤
组织和子叶胚再次在 MSBP培养基上的良好长势; G: 无脱水胁迫处理条件下, 体细胞胚在 MSBF培养基上发育成熟的同时伴随着胚
性愈伤组织的快速增殖; H: 脱水胁迫处理条件下, MSBF培养基上产生的子叶胚。I和 J: 脱水胁迫处理条件下, 子叶胚在 MSBF培养
基进一步发育成熟; K: 根系发达的再生苗; L: 温室中的再生苗。
A: callus initiation from split hypocotyls and separation of cortex tissue from stele tissue on CIM medium. Arrow 1 shows gray green loose
callus from cortex tissue (type II); arrow 2 shows stele tissue; arrow 3 points to whitish dark green hard and compact callus from cut end of
hypocotyls (type I); B: embryogenic calli of cultivar 03298 (ellipse showed) on MSBP medium; C: browning of callus on MSBP medium; D:
faded away of embryogenic calli (arrow pointed) on MSBP medium; E: waterish-logged calli with sporadic embryos on ECM medium; F:
development of cotyledonary embryos and proliferation of embryogenic calli on MSBP medium after culturing on ECM medium; G: embryo
maturation along with rapid proliferation of embryogenic calli on MSBF medium without dehydration; H: cotyledonary embryos under
dehydration; I, J: cotyledonary embryos further development on MSBF medium under dehydration; K: regenerated plantlet with well
developed roots; L: regenerated plantlets in greenhouse.

ECM4 和 ECM7 上产生球形胚 ; 新陆早 24 则在
ECM6上获得球形胚, 1周后 ECM7上也出现球形胚
(图 1-E)。显然, ECM培养基中的激素是诱导体细胞
胚胎发生的关键。但由于激素的作用, 细胞分裂加
速, ECM 培养基上持续培养的胚性愈伤组织和胚状
体出现了愈伤组织化。把 03298和新陆早 24的胚性
愈伤组织和体细胞胚继续继代于 ECM培养基, 或无
激素 MSBP培养基上。1个月后, MSBP培养基上已
有少量子叶胚, 且胚性愈伤组织愈伤组织增殖良好
(图 1-F); 对比之下, ECM培养基上还是零星的球形
胚, 且胚性愈伤组织呈浸水状(图 1-E)。经统计, MSBP
培养基上的体细胞胚数目是 ECM 培养基上的 2~3
倍(表 4)。
培养 2 个月后, 新陆中 20 在 ECM9 和 ECM10
上也获得体细胞胚; 新陆早 33则在 ECM2、ECM3、
ECM4、ECM9和 ECM10发生再生。与 03298和新
陆早 24一样, 新陆中 20和新陆早 33的胚性愈伤组
织在这些 ECM 培养基上也是分裂快速、生长旺盛,
愈伤化严重。鉴于 03298和新陆早 24在 MSBP培养
基上的良好表现, 新陆中 20 和新陆早 33 的胚性愈
伤组织经 ECM培养基诱发体细胞胚胎发生后, 也继
代于 MSBP 培养基进行增殖。为了防止愈伤组织的
过度生长 , 继代时仅接入黄豆粒大小的愈伤团即
可。结果表明, MSBP培养基比 ECM培养基更适合
于胚性愈伤组织的增殖和体细胞胚的生长(表 4); 上
述胚性愈伤组织褐化、死亡现象在此阶段亦无发生。
1378 作 物 学 报 第 34卷

表 4 ECM培养基诱导体细胞胚胎发生后不同培养基对体细胞胚发育成熟的作用
Table 4 Effect of medium on the development of somatic embryos after initiation of embryogenesis by ECM
培养 30 d后每克胚性愈伤组织中所含体细胞胚数
Number of embryos per gram embryogenic callus after 30 days of culture 品种
Cultivar
培养基 a
Medium a 球形胚 Globular 鱼雷形胚 Torpedo 子叶胚 Cotyledonary
MSBP 205 25 3 新陆中 20 Xinluzhong 20
ECM 9 70 6 0
MSBP 224 28 8 新陆早 24 Xinluzao 24
ECM 6 72 16 0
MSBP 37 16 3 新陆早 33 Xinluzao 33
ECM 2 17 0 1
MSBP 143 18 6 03298
ECM 7 62 7 0
a 所选 ECM培养基均为该品种在其中表现最好的培养基。
a The best ECM for the cultivar to compare with MSBP.

2.3 体细胞胚的成熟和植株再生
经 MSBP-ECM-MSBP 培养获得的体细胞胚转
至 MSBF 培养基上进行胁迫处理以促进体细胞胚的
成熟。在滤纸和棉塞的透气作用下, 培养瓶内的微
环境与外界的气体交流极为通畅, 相对湿度相对较
低, 内壁无水珠生成; 而无透气胁迫的培养瓶内壁
则能观察到大量的水珠。在滤纸和棉塞的协同胁迫
下, 03298、新陆早 24和新陆中 20的体细胞胚均发
育良好, 玻璃化、畸形苗等现象极少, 产生了大量的
子叶形胚(图 1-H, I, 表 5)。无胁迫处理下, 体细胞胚
在 MSBF 培养基上也发育成熟, 但伴随着胚性愈伤
组织的快速增殖(图 1-G)。需要指出的是品种新陆早
33, 在 MSBF 培养基上产生的子叶胚相对于前 3 个
品种较少。伸长的子叶胚(图 1-J), 继续培养于铺滤纸
的 MSBF 培养基上有利于获得发达的根系(图 1-K),
从而省却生根的步骤。待再生植株长至 3~5片叶时,
根系发达者经炼苗后移栽于温室, 其余则以嫁接的
方法进行繁殖(图 1-L)。

表 5 MSBF培养基上进行脱水处理和透气处理对新陆中 20体细胞胚成熟的影响
Table 5 Effect of dehydration plus interval ventilization treatment on maturation of embryos of Xinluzhong 20 on MSBF medium
处理
Treatment
萌发胚数 a
Number of embryos germi-
nated into shoots a
不萌发胚数 b
Number of embryos
failed to germinate b
胚萌发率
Rate of embryo germination
(%)
脱水+透气 Dehydration plus ventilization 197 43 82.08
对照 CK 91 46 66.42
a 包括有根的再生苗和无根的再生苗; b 包括正常胚和所有的畸形胚如死胚、玻璃化胚、愈伤组织化胚、无根无芽的胚、有根无
芽的胚等。
a including shoots with or without roots; b including dead embryos, vitreous embryos, callus-like embryos, embryos without roots and
shoots, embryos with roots but without shoots etc.

3 讨论
棉花组织培养的基本培养基多采用 MS 培养基
或 MS 无机盐+B5 维生素组成的培养基, 附加不同
激素进行愈伤组织诱导, 并在后期采用 KNO3 用量
加倍的策略促进胚胎发生[5]。鉴于此, 本研究在诱导
愈伤组织阶段即在 CIM 培养基中采用两倍用量的
KNO3, 一则有可能促进形成层和皮层细胞形成胚
性愈伤组织, 二则使愈伤组织继代时所处的培养基
营养条件保持一致, 减少培养基中盐分变化对继代
愈伤组织的不利影响。此外, 以纵切的下胚轴为外
植体也可能促进胚胎发生, 因为纵切增加了形成层
和皮层细胞与 CIM 培养基的接触面, 而这些细胞均
是胚性愈伤组织的产生处[31]。品种 03298 在 MSBP
培养基继代 2 个月后即产生胚性愈伤组织很可能得
益于这些处理(图 1-B)。
2,4-D 是诱导棉花体细胞胚胎发生的重要激
素[1,4,9,32], 高浓度 KT与低浓度 IBA也有利于诱导胚
性愈伤组织[16]。本研究中, 愈伤组织在 MSBP 培养
基上增殖时发生褐化、死亡现象可能是体内激素缺
乏或激素不平衡所致, 也说明这 4 个品种的愈伤组织
在 MSBP 培养基上长期继代需要合适的体内激素水
第 8期 陈天子等: 新疆棉花 4个主栽品种的体细胞胚胎发生及植株再生 1379


平。而在 ECM培养基上, 愈伤组织无褐化、死亡现
象, 并能诱导胚胎发生。研究发现, 在 ECM 培养基
中, 0.01 mg L−1的 2,4-D和 0.05 mg L−1或 0.1 mg L−1
的 KT 组合最有利于诱导胚胎发生; KT 与 2,4-D 的
比例从 5~100 倍都能有效地诱导胚胎发生。但浓度
过高的 KT(如 0.2 mg L−1)和浓度过低(如 0.001 mg
L−1)或过高(如 0.03 mg L−1)的 2,4-D组合使用时, 都
不利于棉花体细胞胚胎发生。本研究中的 ECM8 和
ECM11即分别是这样的激素组合, 4个品种在这两种
培养基上均没有获得体细胞胚。
Wu 等[16]发现 KT 和 IBA 的激素组合对棉花愈
伤组织和胚性愈伤组织的诱导都很有效, 但胚性愈
伤组织同时培养于有激素和无激素的相同培养基时,
后者产生的球形胚数目显著高于前者。本研究发现,
“MSBP—ECM—MSBP”的培养过程是愈伤组织增
殖和胚性愈伤组织诱导的有效策略。ECM培养基适
于诱导胚性愈伤组织和胚状体的发生, 但却不适于
胚性愈伤组织的增殖和胚状体的成熟(图 1-E)。有趣
的是, 未经 ECM培养基诱导之前, 胚性愈伤组织在
MSBP培养基上发生褐化、死亡现象; 但经 ECM培
养基诱导产生体细胞胚胎后, 胚性愈伤组织能很好
地在 MSBP 培养基上增殖并分化出球形胚, 所产生
的球形胚也显著高于在 ECM 培养基上(表 4)。这与
Wu等[16]的结果一致。MSBP培养基在 ECM培养基
前、后两阶段截然不同的表现可能是胚性愈伤组织
内激素改变所致。在愈伤组织诱导阶段, 除了 CIM4
外, 其他 3种 CIM培养基中的KT浓度均低于 2,4-D,
使得愈伤组织内激素的积累处于低浓度 KT 与高浓
度 2,4-D 的状态, 这可能不利于愈伤组织在无激素
MSBP 培养基上生长和增殖, 最终在第 3、4 轮继代
时出现褐化、死亡现象。当培养于高浓度 KT 和低
浓度 2,4-D的 ECM培养基时, 胚性愈伤组织内的激
素重新调整平衡, 处于高细胞分裂素比低生长素的激
素状态, 从而有利于愈伤组织的增殖和分化, 即便在
无激素MSBP培养基上也生长良好。
棉花转基因生物技术育种的先决条件是具备不
同品种的组织培养和植株再生的高效体系。如何促
进体细胞胚胎成熟提高再生率一直是众多研究者所
要突破的难题[3,9,33-34]。Kumria 等[8]通过胁迫处理有
效地促进胚胎成熟并减少胚胎畸形率。他认为铺于
培养基上的滤纸有效地减少了培养基对体细胞胚的
营养供应和水分供应 , 产生营养胁迫和干燥胁迫 ,
同时滤纸还提高了培养基与外界环境气体交换。通
常, 伴随长培养时间和高湿度的培养微环境, 畸形
苗比例会增加。滤纸和棉塞在本研究中起到了营养
胁迫、增强透气提高气体交换和干燥胁迫的作用 ,
其结果不但缩短再生时间还降低再生苗畸形率。6
个月即获得品种 03298的再生植株, 而新陆早 24需
要 7个月, 新陆早 20和新陆早 33则为 8个月。
4 结论
建立了新疆陆地棉体细胞胚胎发生和植株再生
的高效体系, 在 6~8 个月可获得大量的再生植株,
拓宽了体细胞胚胎发生棉花再生基因型。4 个品种
中, 新陆早 33号在MSBF培养基上发育成熟的体细
胞胚相对较少, 可能附加激素更有利于其分化。

致谢: 感谢新疆康地农业科技有限公司提供试验种
子。
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