全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(2): 337−340 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 中国农业科学院杰出人才科研启动经费项目
作者简介: 高原(1978–), 男, 山东临沂人, 硕士研究生, 研究方向植物分子生物学。E-mail: plateau2008@126.com
* 通讯作者(Corresponding author): 陈信波(1962–), 湖南长沙人, 教授, 博士生导师。E-mail: chenxinbo@hotmail.com
Received(收稿日期): 2007-04-10; Accepted(接受日期): 2007-08-25.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.00337
亚麻木质素合成途径中关键酶基因片段的克隆与序列分析
高 原 1,2 陈信波 1,2,* 龙松华 1 邓 欣 1 邹 杰 2 刘爱玲 3
(1中国农业科学院麻类研究所农业部麻类遗传改良与工程微生物重点实验室, 湖南长沙 410205; 2湖南农业大学作物基因工程重点
实验室, 湖南长沙 410128; 3湖南农业大学生物科学技术学院, 湖南长沙 410128)
摘 要: 亚麻是一种重要的韧皮纤维作物, 木质素对亚麻纤维的性能和品质具有较大影响。以亚麻(Linum usitatis-
simum L.)茎秆表皮细胞的 mRNA为模板, 利用木质素合成途径中关键酶基因的同源基因保守序列设计简并引物, 通
过 RT-PCR 扩增, 电泳获得 13 个特异带。分别将这些 DNA 片段连接到 T 载体后转化大肠杆菌, 从重组质粒转化菌
分别挑取 5~8个单菌落测定插入片段序列, 得到关键酶基因新的片段序列 8个。生物信息学分析结果表明, 这些新片
段分别属于 3个基因家族。其中, 2个 CCoAOMT基因片段(GenBank登录号为 EF214740, EF214741), 3个 4CL基因片
段(GenBank登录号为 EF214737, EF214738, EF214739), 3个 F5H基因片段(GenBank登录号为 EF214745, EF214746,
EF214747), 推测亚麻中这几个木质素代谢关键调控酶基因存在多基因家族。新获得的基因片段序列为进一步克隆全
序列和了解调控亚麻木质素的生物合成奠定了基础。
关键词: 亚麻(Linum usitatissimum L.); CCoAOMT基因; 4CL基因; F5H基因; 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of Partial Fragments of Critical Genes
Involved in Flax Lignin Synthesis
GAO Yuan1,2, CHEN Xin-Bo1,2,*, LONG Song-Hua1, DENG Xin1, ZOU Jie2, and LIU Ai-Ling3
(1 Ministry of Agriculture Key Laboratory of Genetic Improvement & Engineering Microbiology for Bast Fiber Crops, Institute of Bast Fiber
Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha 410205, Hunan; 2 Crop Gene Engineering Key Laboratory, Hunan Agricultural Uni-
versity, Changsha 410128, Hunan; 3 College of Bio-science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan, China)
Abstract: Flax is an important bast fiber crop. High content of lignin in the fiber greatly reduces fiber quality after degumming.
The cDNA fragments of the critical genes involved in flax lignin biosynthesis were amplified from the flax bark mRNA by
RT-PCR using the degenerate primers designed from conservative regions of existing homologous gene sequences. Thirteen dis-
tinct bands were obtained from agarose gel electrophoresis. The fragments from these bands were ligated to T-vector. The recom-
binant plasmids were transformed into E. coli. Five to eight separate clones transformed from each band were chosen to be se-
quenced. Sequence analysis and GenBank BLAST revealed eight new sequences, including two CCoAOMT (EF214740,
EF214741) genes, three 4CL (EF214737, EF214738, EF214739) genes, and three F5H (EF214745, EF214746, EF214747) genes.
This implies that these are multi-gene families for the genes encoding the three key enzymes in flax lignin biosynthesis. These
partial cDNA sequence data are useful for cloning full length cDNA and characterizing the functions and regulations of the critical
genes involved in flax lignin biosynthesis.
Keywords: Flax (Linum usitatissimum L.); CCoAOMT; 4CL; F5H; Sequence analysis
亚麻(Linum usitatissimum L.)是一种重要的纤维作物,
亚麻纤维具有拉力强、柔软、细度好等特点, 为优良的纺
织原料。亚麻纤维中木质素含量为 2.5%~5.0%, 高木质素
影响亚麻纤维的性能和品质。利用转基因技术培育高纤
维、低木质素的亚麻新品种在纺织工业中具有重要的意
义。木质素代谢途径中关键酶基因的功能与调控研究对于
获得低木质素的亚麻新品种将是至关重要的。目前, 国内
外已对拟南芥[1-3]、烟草[4]、杨树[5-7]、苜蓿[8]、玉米[9]、桉
338 作 物 学 报 第 34卷

树[10]等植物中影响木质素含量的关键酶基因进行了深入研
究, 并取得一定的成果。Zhong 等[4-5]在反义 CCoAOMT 表
达的转基因烟草和杨树中发现木质素含量明显下降, S/G
比值增加, 结构疏松利于脱去木质素; Hu等[6]用反义 RNA
技术抑制杨树 4CL 基因表达, 木质素含量下降, 伴随纤维
素含量增加 15%。此外, 赵艳玲等[7]从刺槐(Robinia preu-
doacacia)中克隆得到的定位于形成层表达的 GRPl.8 启动
子, 分别与 GUS 报告基因及从毛白杨(Populus tomentosa)
中克隆的 4CL1 基因连接构建成 GRP1.8-GUS 和
GRPl.8-anti-4CLl 融合基因, 转基因于烟草中, 木质素含量
下降 13.7%, 纤维素含量上升 15.6%。Franke等[1]和 Sibout
等[2]对 F5H基因表达的研究发现转基因植株的 S-木质素含
量均增加, 并推断 F5H的催化作用是 S-木质素合成中的必
须环节。以上结果表明 CCoAOMT、4CL、F5H等基因在木
质素合成中发挥着重要的调控作用。
本研究分离和克隆了亚麻木质素合成途径中关键酶
基因 CCoAOMT、4CL、F5H 的多个片段, 为进一步克隆
这些基因全序列及其在亚麻木质素的生物合成中的功能
与表达调控奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
亚麻品种“白花”由中国农科院亚麻遗传育种项目组
提供。取田间生长旺盛并处于花期的“白花”茎秆, 小心剥
下韧皮及表皮立即在液氮中速冻, 再放−80℃保存。
1.2 方法
1.2.1 亚麻总 RNA 的分离 冻存韧皮及表皮组织用
TRIzol 试 剂 盒 (Invitrongen) 提 取 并 经 RNesay Plant
minikit(Qiagen)过柱纯化, 获得高质量的总 RNA。
1.2.2 引物设计与合成 在 GenBank 数据库中进行检
索, 根据已经报道的其他植物的 CCoAOMT、4CL、F5H
基因的保守序列, 并利用 ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/
clustalw/index.html)在线分析, 建立系统树, 结合植物分
类学, 选择与亚麻亲缘关系较近的植物作为设计简并引
物的参照, 以降低简并性, 提高扩增片段的准确性。在实
验过程中 , 根据保守区的蛋白及核酸序列 , 利用
Primer3(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3
www.cgi)设计多对引物 , 然后对每个基因的上下游引物
分别进行筛选, 以形成不同的组合。
1.2.3 RT-PCR 反应体系及扩增条件 采用 ReverTra
Ace-α-第一链 cDNA 合成试剂盒(TOYOBO)合成 cDNA,
PCR反应体系总体积为 25 μL, 含无菌去离子水(16.7 μL),
10×PCR buffer (2.5 mmol L−1 Mg2+, 2.5 μL), 10 mmol L−1
dNTP mix (0.5 μL), 10 μmol L−1 Forward Primer (2 μL),
10 μmol L−1 Reverse Primer (2 μL), 2.5 U μL−1 Taq DNA聚
合酶 (0.3 μL), RT mixture (1 μL)。
PCR扩增程序为 94℃预变性 5 min, 94℃变性 30 s,
50℃退火 30 s, 72℃延伸 2 min, 共 35个循环, 最后 72℃
补平 10 min。
1.2.4 PCR 产物的克隆筛选 采用 Quick Gel Extrac-
tion Kit(TIANGEN)将 PCR 产物切胶回收纯化, 连接到
pGEM-T Easy Vector(Promaga), 热激转化到大肠杆菌
Top10 感受态细胞中, 并进行 Amp 抗性和 X-gal/IPTG 蓝
白斑筛选。每个扩增条带的转化菌分别挑取 5~8个阳性单
菌落进行 LB液体培养, 强碱法提取质粒[11]。质粒经 PCR
检测、EcoRⅠ酶切检测确定插入片段后进行测序分析。
1.2.5 序列分析 利用 ClustalW 和 NCBI 数据库对克
隆片段进行生物信息学分析。
2 结果与分析
2.1 扩增结果
先后合成 24条引物, 形成 40种组合, 共获得有意义
的 RT-PCR扩增条带 13个, 其中 CCoAOMT 6个, 4CL 5
个, F5H 2个。经多次重复测序选取核酸序列较长的片段
在 GenBank上注册(见表 1)。
2.2 生物信息学分析
经过 BLAST 序列比对 (表 2, 表 3), 发现基因
CCoAOMT1和基因CCoAOMT2与已报道的亚麻CCoAOMT
基因(登录号为 DQ090002)的核酸序列相似性分别为 86%
和 87%, 蛋白质序列相似性都为 95%, 而 CCoAOMT1 与
CCoAOMT2的核酸及蛋白质序列相似性分别为 95%和 99%,
第 12位氨基酸有 I和 V的差别, 在 387个碱基序列中有 14
个不连续位点存在碱基差异。因此, 推测这 2 个片段属于
亚麻 CCoAOMT基因家族中的 2个不同成员基因。4CL作
为对植物木质素合成有重要作用的基因, 目前已在拟南芥
中发现 14 个同源基因, 它们分别位于 1、3、4、5 号染色
体上, 其中 At4CL1(NM_104046)与茎的木质素合成有关。
Hamberger 等 [12]研究发现 At4CL1 基因的编码序列与
At4CL2 最为相近, 其同源性也仅为 74%; 而 At4CL1 与
At4CL3的同源性则更低, 仅为 52%。这种序列差异反映了
各家族成员所编码的同功酶在结构和功能上的不同。在对
亚麻茎韧皮部木质素基因的克隆中获得了 4CL基因的 3个
片段, 4CL2和 4CL3分别与 4CL1进行比对, 核酸相似性为
88%和 94%, 而预测蛋白质序列相似性为 95%和 100%,
4CL1与 4CL3片段的氨基酸序列完全相同。在 336个碱基
序列中, 4CL2 与 4CL1 有 31 个不连续位点存在碱基差异,
4CL3 与 4CL1 有 13 个不连续位点存在差别, 而 4CL2 与
4CL3有 35个不连续位点碱基不同。研究亚麻中 4CL基因
的序列差异, 仅仅依靠部分序列的比对显然是不够的, 有
待于做进一步的工作。然而, F5H基因的 3个片段之间却存
在较大差异。F5H1、F5H3与构树(Broussonetia papyrifera)
核酸相似性为 89%和 92%, F5H2 与杨树(Populus tricho-
carpa)核酸相似性为 82%, 在蛋白质序列的比对中发现 3个
片段 F5H1、F5H2、F5H3与杨树的相似性分别为 72%、65%
和 72%, F5H1与 F5H3核酸序列相似性为 81%。
第 2期 高 原等: 亚麻木质素合成途径中关键酶基因片段的克隆与序列分析 339



表 1 PCR扩增片段及其引物设计参考序列
Table 1 Amplified fragments and the referring genes for primer design
登录号/名称
Accession No./
genes name
扩增片段
Fragment size
(bp)
功能描述
Functional description
引物参考序列
Gene for primer
design
引物序列
Sequences of the primer pair
(5–3)
EF214740 咖啡酰 CoA O-甲基转移酶
CCoAOMT1
387
cafeoy1-CoA3-O-methy1transferase
DQ090002

F：GAAGGRCARTTCYTSAAYAT
R：CCRTTCCABAGRGTGTTGTC
EF214741 咖啡酰 CoA O-甲基转移酶
CCoAOMT2
450
cafeoy1-CoA3-O-methy1transferase
DQ090002

F：GAAGGRCARTTCYTSAAYAT
R：GAGCTCCTRMACRAARTCYC
EF214737 4-香豆酸 CoA连接酶
4CL1
336
4-coumarate CoA ligase
X13324

F：CWCCDTTRGGRAARGARCT
R：CCWATRTCDCCDGTRTGYAACCA
EF214738 4-香豆酸 CoA连接酶
4CL2
336
4-coumarate CoA ligase
X13324

F：CWCCDTTRGGRAARGARCT
R：CCWATRTCDCCDGTRTGYAACCA
EF214739 4-香豆酸 CoA连接酶
4CL3
336
4-coumarate CoA ligase
X13324

F：CWCCDTTRGGRAARGARCT
R：CCWATRTCDCCDGTRTGYAACCA
EF214745 阿魏酸-5-羟基化酶
F5H1
558
ferulate-5-hydroxylase
NM_119790

F：CACTAYGGHCCSTTYTGGMG
R：CRTCCATKATGATDGCYTTGAT
EF214746 阿魏酸-5-羟基化酶
F5H2
855
ferulate-5-hydroxylase
NM_119790

F：CACTAYGGHCCSTTYTGGMG
R：CTHCGWCCYGACCCRAAYGG
EF214747 阿魏酸-5-羟基化酶
F5H3
567
ferulate-5-hydroxylase
NM_119790

F：CACTAYGGHCCSTTYTGGMG
R：CRTCCATKATGATDGCYTTGAT
F表示上游引物, R表示下游引物。F and R stand for forward primer and reverse primer.

表 2 克隆片段的核酸序列比对
Table 2 Nucleotide BLAST analysis of the cloned gene fragments in NCBI
登录号
Accession No.
最高同源性物种
Highest similarity species
同源基因登录号
Highest similarity gene
accession No.
E值
E-value
最大相似性
Identity
(%)
EF214740 Linum usitatissimum DQ090002 7e-92 86
EF214741 Linum usitatissimum DQ090002 4e-112 87
EF214737 Juglans nigra AJ278455 2e-21 81
EF214738 Juglans nigra AJ278455 3e-41 85
EF214739 Juglans nigra AJ278455 6e-18 80
EF214745 Broussonetia papyrifera AY850934 3e-18 89
EF214746 Populus trichocarpa AJ010324 6e-14 82
EF214747 Broussonetia papyrifera AY850934 3e-21 92

表 3 克隆片段预测蛋白质序列的 NCBI数据库 BLAST分析
Table 3 BLAST analysis of the putative coding proteins of the cloned gene fragments in NCBI
登录号
Accession No.
预测蛋白大小
Putative protein
size
最高同源性物种
Highest similarity species
最高同源性蛋白登录号
Highest similarity protein
accession No.
E值
E-value
同源性
Identity
(%)
ABN09207 129 Linum usitatissimum AAY89237 5e-66 95
ABN09208 150 Linum usitatissimum AAY89237 5e-79 95
ABN09204 112 Nicotiana tabacum AAB18637 3e-56 87
ABN09205 112 Nicotiana tabacum AAB18637 4e-57 89
ABN09206 112 Nicotiana tabacum AAB18637 3e-56 87
ABN09212 186 Populus trichocarpa CAB65335 3e-75 72
ABN09213 285 Populus trichocarpa CAB65335 6e-109 65
ABN09214 189 Populus trichocarpa CAB65335 7e-76 72

340 作 物 学 报 第 34卷

3 讨论
木质素是由香豆醇(H 型)、松柏醇(G 型)和芥子醇(S
型)3 种醇单体合成的一种酚类聚合物, 对植物有机械支
持及抗病菌侵染作用。近年来, 在多种植物中已经发现木
质素合成代谢的相关酶存在多基因家族现象。Ye 等[13]发
现百日草的 CCoAOMT基因多达 5~10个, Martz F等证实
烟草[14]具 4个CCoAOMT的编码基因, 陈建荣等[15]从苎麻
中也克隆 1个 CCoAOMT基因。Lee D和 Douglas C J验
证烟草[16]中有 2个 4CL基因, 其同源性约为 80%; Hu等[17]
在颤杨中克隆了 2个结构、功能均不同的 4CL基因, 蛋白
同源性仅为 63%, 同时发现 Pt4CL1 参与木质素的合成,
Pt4CL2 与类黄酮物质的生物合成有关。F5H 是与细胞色
素 P450相连的单氧酶, 目前已在水稻中获得 2个 F5H基
因[18]。笔者通过 BLAST 检索仅找到一条亚麻基因序列,
即 CCoAOMT(GenBank 登录号为 DQ090002)。根据本研
究获得的基因片段 , 初步推测亚麻木质素代谢途径的主
要关键调控酶基因 CCoAOMT、4CL、F5H 存在多基因家
族。以该基因片段为基础, 获得基因的全长序列, 研究各
基因的时空表达和对逆境(病害、干旱)反应的差异及其与
木质素含量的相关性 , 确定木质素代谢重要时期韧皮部
特异或高表达的基因家族成员, 利用 RNAi转基因技术培
育高纤维低木质素的亚麻新品种具有一定的应用价值。
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