全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2008, 34(11): 1921−1928 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

基金项目: 国家自然科学基金项目(30170600)；湖北省自然科学基金项目(2001ABD113)
作者简介: 丁勇(1979–), 男, 安徽霍邱人, 硕士, 西南林学院工作, 主要从事植物生物技术方面的教学和科研工作。E-mail: dingding7788@126.com
*
通讯作者(Corresponding author): 甘莉(1953–), 女, 湖北武汉人, 教授, 主要从事生物化学课程的教学和作物品质生物化学和分子
生物学的科研工作。Tel: 027-87287376; Fax: 027-87287376; E-mail: ganli@mail.hzau.edu.cn
Received(收稿日期): 2008-03-09; Accepted(接受日期): 2008-06-09.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2008.01921
油菜油体钙蛋白基因 BnClo1的克隆和表达
丁 勇 1,2 陈庆波 1 徐春雷 1 常 玮 3 甘 莉 1,*
(1华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 湖北武汉 430070; 2西南林学院资源学院, 云南昆明 650224; 3中国科学院昆明植物研
究所, 云南昆明 650204)
摘 要: 应用同源序列克隆法设计同源简并引物, 结合 RT-PCR 和 RACE-PCR 技术, 从甘蓝型油菜中分离克隆了编
码 28.1 kD油体钙蛋白(caleosin)的基因 BnClo1。其全长 1 058 bp的 BnClo1 mRNA (GenBank中序列号为 AY966447)
包含完整的开放阅读框和 3′末端 Poly( A)尾巴结构, 染色体 DNA结构上含 6个外显子和 5个内含子。Northern杂交
结果表明, 油菜中 BnClo1 在种子形成中期开始丰富表达, 在种子形成后期, 即种子开始脱水成熟时期, 高量稳定地
表达。半定量 PCR结果显示, BnClo1在油菜种子吸水膨胀后前 2 d的茎中明显表达。证明在油菜种子发育期间, BnClo1
对 mRNA 的转录表达是由胚胎发育来调控的 , 具有显著的时空特性 , 并与油体的形成和积累密切有关。推测的
caleosin蛋白为 245个氨基酸残基(GenBank中序列号为 AAY40837)组成的两性蛋白质, 主要含 3个结构域即由 N末
端 1∼16位氨基酸残基组成的 α-螺旋和 17∼61位氨基酸残基组成的强亲水性的随机卷曲构成的 N-末端亲水性结构域;
由 80∼120 位氨基酸残基组成的中间疏水性结构域和 C-末端亲水性结构域。N-末端亲水性结构域包含一个潜在的结
合 Ca2+的 EF-手结构。中间疏水性结构域包含一个潜在的脯氨酸-结 (proline-knot)模体, 在 92∼114 位氨基酸残基组
成的 α-螺旋跨膜区域, 推测在 caleosin 蛋白与单层磷脂层和油体锚定结合上及增加种子油体的稳定性上起着重要的
作用。
关键词: 油体钙蛋白; RACE; 基因克隆; 同源简并引物; 序列分析; Northern杂交
Cloning and Expression of BnClo1 Gene from Brassica napus
DING Yong 1,2, CHEN Qing-Bo 1, XU Chun-Lei 1, CHANG Wei 3, and GAN Li 1,*
(1 National Key Laboratory of Crop Genetic Improement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei; 2 School of Natural Resources,
Southwest Forestry College, Kunming 650224, Yunnan; 3 Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204, Yunnan,
China)
Abstract: Triacylglycerols (TAGs) is stored in seeds as a nutrient for germination and postgerminative growth of seedlings.
TAGs storage is confined to discrete spherical organelles called oil bodies. Plant seed oil bodies comprise a matrix of TAGs sur-
rounded by a monolayer of phospholipids embedded with abundant oleosins and some minor proteins. Three minor proteins,
temporarily termed caleosin (Sop1), steroleosin (Sop2) and Sop3, have been identified in oil bodies of diverse species. With the
rapid development of molecular biology, the more wide application of rape seed oil bodies on genetic engineering, the more
attention to Sops 1–3. To reveal the biological function and provide scientific basis of application on plant genetic engineering for
rape caleosin proteins, a gene BnClo1 encoding caleosin protein was isolated by homology-based candidate gene method com-
bined with RT-PCR and RACE-PCR from B. nupus. The full-length cDNA clone (accession No. AY966447 in GenBank) com-
prised 1058 nucleotides consisting of a 36-nucleotide 5′-untranslated region, an open reading frame of 738 nucleotides, and a
284-nucleotide 3′-untranslated region. The open reading frame encoded a putative caleosin protein. The corresponding genomic
sequence (1 676 nucleotides) of BnClo1 was also obtained by PCR cloning (accession No. DQ140380 in GenBank). Rapeseed
genomic sequence of BnClo1 comprised six exons with five introns conservatively inserted in their coding regions. The splicing
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model of introns accords with the GT/AG rule in eukaryotes. In B. napus, BnClo1 was expressed in a spatially co-cordinated and
temporally regulated manner. BnClo1 expression appeared to be highly regulated through embryogenesis. Northern blot demon-
strated that BnClo1 mRNA was not detected in the earliest embryos, i.e. 20 DAF (day after flower) and presented in maturing
rapeseeds at approximately 25 DAF. BnClo1 expression increased dramatically in the latter stages of embryogenesis, and this
mRNA maintained a substantial level thereafter until the rapeseeds started to desiccate in a mode similar to oleosin mRNA. There
was a single size class of BnClo1 transcript whose expression was regulated through embryogenesis. Semi-quantitative PCR
showed that caleosin mRNA was only detected in the stem at two days after germination of rapeseeds. It is presumably revealed
that BnClo1 is transcribed along with oleosin and steroleosin genes during seed maturation when oil bodies are actively assembled
in diverse species. The deduced polypeptide of the rapeseed clone comprises 245 amino acid residues with molecular weight of
28.1 kD. Caleosin protein documented GenBank with accession No. AAY40837 might be an amphipathic protein associated with
rapeseed oil bodies. Hydropathy plot and secondary structure analysis suggested that caleosin is comprised of three distinct struc-
tural domains: an N-terminal hydrophilic domain with a single Ca2+-binding EF-hand motif, a central hydrophobic anchoring do-
main of some 40 residues, and a C-terminal hydrophilic domain with conserved protein kinase phosphorylation sites. In addition,
the central hydrophobic domain of caleosin also contained a proline-rich region with the potential to form a proline knot motif of
the type that appears to be important in the lipid-body targeting. A potential amphipathic alpha helix, e.g. residues 92–114 of
caleosin might play a role in their binding both of single layer membrane and lipid bodies. Caleosin protein closely integrating
with lipid bodies through embryogenesis plays an important role in the biogenesis process of oil bodies. With calcium-binding, the
physiological function of caleosin protein may be responsible for decomposition of oil bodies and mobilization of triglycerides
during seed germination.
Keywords: Caleosin; RACE; Gene cloning; Homology-degenerate primer; Sequence analysis; Northern blotting
植物种子中贮存的营养物质主要包括蛋白质、
脂肪和碳水化合物。其中脂类是植物种子贮藏能量
最 有 效 的 形 式 , 在 油 料 种 子 中 , 三 酰 甘 油
(triacylglycerols, TAG)作为最初的能量储备支持种
子萌发和幼苗的前期生长。生物体常将脂类贮存于
某种亚细胞器颗粒中, 为随后的生命活动及活跃的
代谢过程提供能量。植物种子的这种贮脂颗粒被称
为油体(oil bodies)或脂肪体(lipid bodies)[1-2]。油体内
部主要为三酰甘油酯的液态基质, 外部则为磷脂单
分子层(phospholipids, PL)及嵌入其内的油体结合蛋
白(proteins associated with oil bodies)组成的半单位
膜[3]。油体结合蛋白包括一种称为油质蛋白(oleosin)
的结构蛋白质和 3个分子量较高的微量蛋白质, 这 3
个微量蛋白质依其特征分别被命名为油体钙蛋白
(caleosin, Sop1)、油体固醇蛋白(steroleosin, Sop2)与
另一个尚未鉴定完成的蛋白质( Sop3)[4-6]。
随着分子生物学与基因工程的快速发展, 油菜
种子油体在生物技术上的应用越来越广泛, 如利用
油菜种子油体表现高附加值的蛋白质[7]、携带疏水
性药物 [8], 利用油菜油体表达体系生产鲑鱼降钙
素[9]等。由于种子油体在基因工程上的应用是通过
油体结合蛋白来实现的, 所以对植物油体结合蛋白
的研究日益受到人们的重视。油体结合蛋白在芝麻
[10-11]、油菜[12-13]、水稻[14]和拟南芥[15]等物种中都得
到了一定的研究 , 并且拟南芥和芝麻中 oleosin、
caleosin和 steroleosin蛋白所对应的基因均已被克隆
并测序。油菜 oleosin基因已从甘蓝型油菜中得到克
隆[13], 但油菜油体钙蛋白基因及其 cDNA 的克隆尚
未有报道, 油体钙蛋白基因序列及编码的蛋白质序
列还是未知的, 在已有研究中[16-17]只是应用来自其
他物种的抗体或探针检测到油菜 caleosin 蛋白及相
关基因的存在。
本实验通过对油体钙蛋白基因的克隆与表达分
析, 旨在揭示油菜 caleosin蛋白的生物学功能, 为油
菜 caleosin 蛋白在植物基因工程、生物技术及生物
化学上的应用提供科学的依据。
1 材料与方法
1.1 供试材料
甘蓝型油菜英国矮 , 取苗期叶片用于提取总
DNA, 取花后 4、6和 8 d (day after flower, DAF)的角
果连同种子(种子与角果皮不易分离), 花后 10、15、
20、25、30、35和 40 d 的角果, 去除角果皮, 及种子
萌发后生长 2、4、6和 8 d (day after germination, DAG)
的根和茎用于提取各部分总 RNA。
1.2 核酸提取与检测
按照丁勇等方法 [18] 提取角果和种子的总
RNA。采用 Trizol 法提取根和茎的总 RNA。采用
CTAB法提取叶片总 DNA。1.2%琼脂糖凝胶上电泳
检测。
第 11期 丁 勇等: 油菜油体钙蛋白基因 BnClo1的克隆和表达 1923


1.3 油菜 BnClo1基因全长 cDNA克隆
依据表 1 中已知油体钙蛋白及其基因信息设计
同源简并引物(上游引物 UC2：5′-CAGCAGCATGTC
GCTTTCTT-3′, 下游引物 LC2：5′-ATACTCGAACA
AGCTCCCATC-3′), 根据分离的油菜 BnClo1 基因
cDNA 部分序列设计 RACE 引物。3′-RACE 引物包
括反转录引物 Adaptor-Oligo(dT)17：5′-CTGATCTAG
AGGTACCGGATCC(T17)3′, 接头引物 AP：5′-CTGAT
CTAGAGGTACCGGATCC-3′, 特异性引物 3-′GS P：
5′-AACATTGCCAGACAAGTTGAGT-3′; 5′-RACE引
物包括反转录特异性引物 5′-RT-GSP：5′-ACCCTTC
TTCATCCCTCGCT-3′, 特异性引物 5′-GSP-1: 5′-CC
ACTCTATTTTGCTTGCGAAC-3′, 5′-GSP-1 内侧的
半巢式引物 5′-GSP-2：5′-AAACCAAGCATTCGCA
GTCCAG-3′, Adaptor-Oligo(dT)17和AP引物同 3′-RA
CE。第一链 cDNA 的合成按 RNA 反转录第一链合
成试剂盒描述操作, RNA为 40 DAF种子的总 RNA。
1.4 油菜 BnClo1基因染色体 DNA克隆
根据克隆的基因全长 cDNA, 在 15∼36 位核苷
酸设计上游引物 UC5：5′-CTAGAGCAAAAAAGA
GCGAGAG-3′, 1 016∼1 038位核苷酸设计下游引物
LC5：5′-CAAGAAATGATTCTCAATACCAA-3′, 以
叶片总 DNA为模板, 进行 PCR扩增。
1.5 PCR产物检测、回收、T/A克隆与测序
在 1.2 %(W/V)的琼脂糖凝胶上电泳检测 PCR产
物, 回收目的片段并连接到 pMD18-T 载体上, 转化
大肠杆菌 DH5α 感受态细胞 , 随机筛选白色菌落 ,
对阳性克隆测序。

表 1 拟南芥等 4个物种中分离的油体钙蛋白基因信息
Table 1 Caleosin genes isolated from Arabidopsis thaliana and other three species
物种
Species
油体钙蛋白基因名称
Name of caleosin gene
油体钙蛋白基因序列号
Accession No. of caleosin gene
油体钙蛋白序列号
Accession No. of caleosin
拟南芥 Arabidopsis thaliana AT1G23240 NM_102173 NP_173738
拟南芥 Arabidopsis thaliana AT5G55240 NM_124906 NP_200335
拟南芥 Arabidopsis thaliana AT1G70670 NM_105735 NP_564995
拟南芥 Arabidopsis thaliana AT1G70680 NM_105736 NP_564996
大麦 Hordeum vulgare HvClo1 AY370889 AAQ74237
大麦 Hordeum vulgare HvClo2 AY370891 AAQ74239
芝麻 Sesanum indicum Caleosin AF109921 AAF13743
水稻 Oryza sativa Os02g0734600 AP005319 BAD16161

1.6 序列的生物信息学分析
应用 NCBI中 Blastx对 mRNA序列进行相似性
比对, ORF finder工具分析 mRNA序列的开放阅读
框, Align two sequences(bl2seq)工具比对分析染色体
DNA 与 mRNA 序列。应用 Softberry 中的 Gene
Finding 工具, 选择拟南芥作为参照对染色体 DNA
序列进行基因预测。通过 NCBI 网站对克隆序列的
最长阅读框蛋白进行 Blastp 相似性比对 , 应用
Vector NTI 8.0 软件对 mRNA 序列最长阅读框蛋白
质的性质进行分析 , 通过 EXPASY 网站和 Vector
NTI 8.0软件进行疏水性分析。在网站 http://npsa-pbil.
ibcp.fr/预测蛋白质二级结构 , 在 EXPASY 网站
ProScale 工具预测蛋白质序列的跨膜结构。基于折叠
辨识模拟的预测方法, 应用堪萨斯大学的 I-TASSER
运算服务器, 进行跨膜蛋白的三维结构预测。
1.7 Northern blot分析
不同发育时期的籽粒总 RNA (20 μg)在 1.2%
(W/V)的琼脂糖甲醛变性凝胶上电泳至 28S和18S
rRNA刚好分开, 转移到 Super Positive Charge尼龙
膜上。采用[α-32P] dCTP 制备探针, 模板 DNA 为
BnClo1基因全长 cDNA (366 ng)。已标记的探针与
尼龙膜上的总 RNA 在 64℃杂交 20 h。将洗好的尼
龙膜与 X光片夹于增感屏中, 于–70℃曝光 4 d。
1.8 半定量 PCR
参照 GenBank登录的看家基因－蛋白质延伸因
子 -1α 序列设计引物 (ef-f：5′-CATCCATCTTGTTA
CAGC-3′, ef-s： 5′-CAAGTATGCCTGGGTGCT-3′),
产物长度 250 bp。油菜 BnClo1为检测基因, 引物为
UC2/LC2, 产物长度 486 bp。对种子萌发后生长不同
天数的根和茎的总 RNA, 用 Oligo(dT)18逆转录合成
第一链 cDNA, 取逆转录产物 2 μL, 加入上下游引
物, Mg2+终浓度为 1 mmol L−1进行 PCR, 于 94℃预
变性 3 min; 94℃变性 30 s, 56℃退火 45 s, 72℃延伸 1
min, 共 30个循环; 72℃充分延伸 10 min 。采用上
1924 作 物 学 报 第 34卷

述 PCR体系和循环参数, 分别采用 25、28和 31个
循环, 确定指数扩增期。再采用 28 个循环, 扩增蛋
白质延伸因子-1α基因, 调整 cDNA加入量, 使扩增
出来的条带在琼脂糖凝胶亮度基本一致。在同样的
cDNA加入量和 28个循环条件下, 扩增油菜 BnClo1
目的基因。
2 结果与分析
2.1 甘蓝型油菜 BnClo1基因全长 cDNA分离
按 1.2方法提取总 RNA, 28S和 18S rRNA带型
完整且 28S rRNA的亮度约为 18S rRNA的两倍, 总
RNA 的 OD(A260/A280) 值均处于 1.8∼2.0 之间。40
DAF 种子的总 RNA, 按 1.3 节方法合成第一链
cDNA, 用同源简并引物进行 RT-PCR 扩增的片段
cDNA (图 1)经回收克隆测序长度为 486 bp。其中 445
bp为 BnClo1基因序列。3′RACE-PCR扩增的 3′末端
cDNA (图 2)经回收克隆测序长为 550 bp, 序列 3′端
存在系列的 Poly(T)结构, 3′最末端出现 17个核苷酸
A 组成的 Poly(A)结构。甘蓝型油菜 BnClo1 基因 3′
末端序列长 528 bp, 该序列的 1∼172 bp位核苷酸段
与同源序列克隆法分离的油菜 BnClo1 基因部分
cDNA序列的 274∼445 bp位核苷酸段完全相同。
应用 5′RACE 技术时, 在第一轮 PCR 特异性引
物内侧设计第二条特异性引物 , 进行半巢式 PCR
(semi-nested-PCR), 增加 RACE-PCR扩增的特异性。
结果为图 3 所示的特异性 cDNA 片段, 经回收克隆
测序长 362 bp。甘蓝型油菜 BnClo1基因 5′末端序列
长 323 bp, 该序列的 258∼323 bp位核苷酸段与同源
序列克隆法分离的油菜 BnClo1 基因部分 cDNA 序
列的 1∼66 bp位核苷酸段完全相同。
将以上克隆的 3段序列拼接获得油菜 BnClo1基
因含完全编码区、长度为 1 058 bp的 cDNA序列。
登录 GenBank的序列号为 AY966447。



图 1 同源简并引物从甘蓝型油菜中分离的油体钙蛋白
基因部分 cDNA
Fig. 1 Amplification of partial cDNA of BnClo1 gene with
homology-degenerate primers from B. napus
M：DL2000; A：油体钙蛋白基因 cDNA。
M: DL2000; A: cDNA of BnClo1 gene.


图 2 3′ RACE从甘蓝型油菜中分离的油体钙蛋白
基因 3′端 cDNA
Fig. 2 3′ RACE of BnClo1 gene from B. napus
M：DL2000; A：油体钙蛋白基因 3′端 cDNA。
M: DL2000; A: 3′ cDNA end of BnClo1 gene.



图 3 5′ RACE和半巢式 PCR从甘蓝型油菜中分离的油体钙蛋
白基因 5′端 cDNA
Fig. 3 5′ RACE of BnClo1 gene with semi-nested
PCR from B. napus
M：DL2000; A：油体钙蛋白基因 5′端 cDNA。
M: DL2000; A: 5′ cDNA end of BnClo1 gene.

2.2 油菜 BnClo1基因染色体 DNA序列的分离
按 1.4 节方法获得 BnClo1 基因染色体 DNA 序
列的电泳结果为图 4所示, 将目的 DNA回收并克隆
测序 , 结果得到油菜 BnClo1 基因在染色体上长
1 676 bp 的 DNA 序列, 登录 GenBank 的序列号为
DQ140380。



图 4 甘蓝型油菜油体钙蛋白基因在染色体上长
1 676 bp的 DNA片段
Fig. 4 Amplification of 1 676 bp DNA of BnClo1 gene from
M：DL2000; A：油体钙蛋白基因组 DNA。
M: DL2000; A: gDNA of BnClo1 gene.

2.3 序列分析
克隆的油菜 BnClo1基因mRNA序列长 1 058 bp,
37∼774 bp是完整的开放阅读框, 两端序列为末端非
第 11期 丁 勇等: 油菜油体钙蛋白基因 BnClo1的克隆和表达 1925


翻译区, 1 042∼1 058 bp之间 17个腺嘌呤是真核生物
mRNA一般都具有的 Poly(A)尾巴结构。在染色体水
平上, 油菜 BnClo1基因包含 6个外显子和 5个内含
子, 在长 1 676 bp 的染色体 DNA 序列中 1∼140、
441∼590、677∼762、851∼945、1 033∼1 158和 1 250∼
1 676 bp为 6个外显子序列, 5个间隔序列为内含子
序列。开放阅读框编码的油菜 caleosin 蛋白由 245
个氨基酸残基组成 , 在 GenBank 的登录号为
AAY40837。
油菜 BnClo1基因编码的 caleosin蛋白质分子量
28.1 kD, pI 5.81, 可知该蛋白质在生理条件下为一
个酸性蛋白质。在 pH 7.0的环境中带有 –4.62电荷,
摩尔消光系数为 53 580。该蛋白质包含了 20种常见
的氨基酸, 其氨基酸含量中半胱氨酸最低为 0.75%,
亮氨酸最高为 9.29%, 其他氨基酸的含量在
2.25%~8.36%之间 ; 酸性氨基酸和碱性氨基酸含量
较低, 且几乎一致, 分别为 12.89%和 12.45%; 带电
荷的氨基酸和疏水氨基酸的含量比较高, 且基本相同,
分别为 37.80%和 35.82%, 由此可以推测该蛋白质既
具有高亲水性又具有高疏水性, 为两性蛋白质。
疏水性一方面可以为二级结构预测结果提供参
考, 另一方面还可以为结构域以及功能域的划分提
供依据。通过疏水性分析油菜 caleosin 蛋白质中疏
水性最大值是 2.900, 最小值为−2.522 。蛋白质在中
间区域 80~120 位左右的氨基酸残基表现出较强的
疏水性, 在 N 端和 C 端氨基酸残基区域都表现出较
强的亲水性 , 这一点与蛋白质性质分析结果相同 ,
都说明了油菜油体钙蛋白是一种两性蛋白质, 即蛋
白的两末端区域为亲水性, 中间区域为疏水性。
根据蛋白质二级结构预测结果推测油菜
caleosin蛋白含有大量的 α-螺旋和随机卷曲结构。其
中 α-螺旋(Alpha helix)结构占蛋白质的 40.41%, 主
要位于 N末端、66~71、96~115、156~164、173~180、
186~201、215~221 和 226~236 位氨基酸区域; 随机
卷曲( Random coil)结构占蛋白质的 36.73%。此外,
油菜 caleosin蛋白还含有 10.61%的 β-转角(beta turn)
和 12.24%的延伸链(extended strand)结构。同时预测
油菜 caleosin 蛋白属于含一个跨膜螺旋的膜蛋白,
跨膜结构位于 92~114 位氨基酸区域(RMLGFNII
VSLIAAA VINLALSY)。与其他油体钙蛋白一样, 油
菜 caleosin蛋白也包含一个潜在的保守区域“Caleo-
sin domain”。序列比对结果显示, 油菜 caleosin蛋白
与拟南芥种子基因 1 (ATS1, 序列号 AT4G26740)表
达的具有钙结合能力的 EF-手结构的胚胎特异性蛋
白 1( ATS1)、芝麻的 caleosin和 caleosin B、大麦的
caleosin1 和 caleosin2 蛋白之间具有 60%~95%的序
列同源性, 推测实验分离的 BnClo1基因在油菜种子
胚胎中丰富表达 caleosin蛋白。
跨膜蛋白的三维结构预测是生物信息学研究热
点之一。由于油菜 caleosin蛋白在 Swiss-Model中没
有找到同源蛋白, 所以我们采用从头预测的方法进
行预测, 所用算法是基于折叠辨识模拟的预测方法,
运算服务器为堪萨斯大学的 I-TASSER。构建的油菜
caleosin 蛋白高级结构(图 5)由 3 个结构域构成, 中间
是由两个 α-螺旋构成的脯氨酸结, 将 caleosin 蛋白
定位在油体单层膜上。两边分别是 N-端和 C-端结构
域, N-端结构域含有 EF手模体, 可以结合Ca2+离子。
C-端结构域含有 7 个磷酸化位点, 包含 3 种磷酸化
类型(CK2、MYRISTYL和 TYR)。5个 CK2型磷酸
化位点位于第 3、166、172、195和 225位氨基酸残
基, 1个 MYRISTYL型磷酸化位点位于第 182位, 1
个 TYR型磷酸化位点位于第 137位。这些磷酸化位
点可能在油体成熟及动员过程中起信号传递作用。



图 5 油菜油体钙蛋白三维结构预测
Fig. 5 3D structure prediction of caleosin protein

2.4 Northern blot分析
总 RNA 完全从甲醛变性凝胶上转移到尼龙膜
上(图 6)的过程中没有出现 RNA 降解现象, 总 RNA
一直保持着完整状态。Northern杂交结果(图 7, A、
B、C为 3次重复实验结果)显示探针和油菜花后 4∼20
d种子的总 RNA没有杂交信号, 和油菜花后 25、30、
35 和 40 d 种子的总 RNA 有明显的杂交信号, 并且
花后 30 d 的信号达到最强。表明在甘蓝型油菜中,
1926 作 物 学 报 第 34卷

花后前 20 d左右的种子中 BnClo1基因 mRNA的表
达量在 Northern杂交检测不到的水平, 花后 25 d左
右的种子中 BnClo1基因开始丰富表达, 并且只有一
条 mRNA 表达带型, 花后 30 d 左右 BnClo1 基因
mRNA 的表达量急剧增加, 之后一直保持着很高的
表达水平。



图 6 甘蓝型油菜花后不同发育天数的种子总 RNA转膜效果
Fig. 6 Total RNA extracted from various stages of maturing
seed transferred to nylon membrane from agrose gel
DAF: days after flower.



图 7 [α-32P] dCTP标记的含有甘蓝型油菜 caleosin基因全长
cDNA片段的特异性探针对甘蓝型油菜花后不同发育天数的种
子总 RNA进行 Northern杂交结果
Fig. 7 Northern blot of total RNA extracted from various stages of
maturing seed. After blotting, the membrane was hybridized with a
32P-labeled probe containing the full-length cDNA sequence of
BnClo1 gene from B. napus
A、B、C为 3次重复。A, B, and C are the three replicates.

2.5 半定量 PCR分析
PCR 扩增油菜种子萌发后茎和根中蛋白质延伸
因子-1α基因 cDNA, 分别在 25、28和 31个循环下
扩增, 证明 28 循环处于指数增长初期(图 8)。在 28
个循环下扩增, 调整 cDNA 加入量, 使油菜种子萌
发后生长不同天数的茎和根中蛋白质延伸因子-1α
基因扩增产物条带亮度达到一致, 目的基因 BnClo1
的扩增结果表明, 在油菜种子萌发后生长 2 d 的茎
中有明显的表达, 在生长 4、6和 8 d的茎中没有明
显的表达, 而在生长 2、4、6和 8 d的根中也没有明
显的表达(图 9)。



图 8 在不同循环下扩增蛋白质延伸因子-1α基因产物
Fig. 8 PCR profile of PEF-1α under different cycles
M：DL2000; 1~2: 31个循环; 3~4: 28个循环; 5~6: 25个循环。
M: DL2000; 1–2: 31 cycles; 3–4: 28 cycles; 5–6: 25 cycles.


图 9 28个循环下调平模板并从油菜种子萌发后生长不同天数
的茎和根中扩增油体钙蛋白基因
Fig. 9 Adjustment of template by PEF-1α and amplification of
BnClo1 under 28 cycles of PCR from stems and roots grown at
various days after germination of seed (B. napus)
DAG: days after germination.
3 讨论
Chen等[10]和 Naested等[15]分别从芝麻和拟南芥
中同时克隆得到 caleosin基因并将其编码的 Sop1蛋
白进行氨基酸序列测定, 发现它与 Frandsen 等[14]在
水稻中发现的一个钙结合蛋白同源, 具有结合单一
钙离子的 EF-手(EF-hand)保守域, 并类似 oleosin 蛋
白与油体相结合等特性, 因此将这类蛋白命名为油
体钙蛋白。本实验从甘蓝型油菜中成功分离克隆了
编码 28.1 kD caleosin蛋白的基因 BnClo1, 该基因在
染色体序列结构上含 6 个外显子和 5 个内含子。基
因组DNA复制后发生转录生成mRNA, 转录后内含
子mRNA进行自我剪接, 6个外显子连接起来形成修
饰后的成熟 mRNA。它的剪接方式符合真核生物内
含子剪接的 GT/AG 规则：即内含子的 5端总是 GT
和 3′端总是 AG。
甘蓝型油菜早期(花后前 20 d 左右)发育的种子
中 BnClo1基因 mRNA的表达量很低, Northern杂交
检测不到 mRNA 的信号。发育中期(花后发育 25 d
左右)的种子中 BnClo1基因 mRNA表达明显。发育
成熟(花后发育 30 d左右)种子中 BnClo1基因mRNA
的表达量急剧增加到最高值, 之后 BnClo1基因一直
保持着很高的 mRNA表达水平。这与 Naested等[15]
利用抗拟南芥AtCLO1同工型蛋白的抗体对 caleosin
蛋白在油菜胚胎中的积累进行检测的结果一致。可
推测油菜胚胎中 BnClo1 基因 mRNA 的转录表达是
由胚胎发育来调控的, 具有显著的时空特性, 并且
油菜 BnClo1基因的表达与油体的形成和积累有关。
在油菜种子发育期间, BnClo1基因 mRNA的转
录表达的时间模式类似于 oleosin基因。均在早期发
育的种子中检测不到转录 mRNA 的信号, 当种子达
到最大鲜重并开始脱水时基因转录的 mRNA的丰度
剧增 [13]。Murphy 等 [19]的研究结果也表明油菜中
oleosin基因是在花后 6~12周, 即种子脱水过程中高
第 11期 丁 勇等: 油菜油体钙蛋白基因 BnClo1的克隆和表达 1927


水平表达。在芝麻种子发育期间, 油体结合蛋白基
因 caleosin、oleosin和 Sop2转录的 mRNA的富集时
间模式也是一致的, 3种基因转录的mRNA大约在开
花后第 2 周开始富集, 此后直到种子成熟的后期种
子中都一直维持着很高的 mRNA水平[11]。推测在油
菜及其他物种中油体结合蛋白基因 oleosin、caleosin
和 Sop2 转录的 mRNA 的富集时间模式可能都是一
致的。
油菜中 caleosin 蛋白可能是由多基因家族编码
的。当前研究证明芝麻中编码油体钙蛋白的基因有
2 个。在拟南芥中油体钙蛋白是由多基因家族编码
的, 至少包含了 5个基因成员, 其中 1个基因只在胚
胎和成熟种子中大量表达, 其他 4 个基因在各种组
织中都微量表达。Hernandez-Pinzon 等[17]的研究证
明油菜中存在 25 kD和 27 kD两种分子量的 caleosin
蛋白同工型。本实验克隆的油菜油体钙蛋白基因
BnClo1 类似于拟南芥, 油菜 caleosin 蛋白也是由多
基因家族编码的, 至少包含了 3 个基因成员, 分别
编码 25、27和 28.1 kD的 caleosin蛋白。
Hernandez-Pinzon 等应用免疫杂交技术研究还
表明编码油菜 25 kD和 27 kD的 caleosin蛋白同工
型的油体钙蛋白基因只在种子萌发后 2 d 的茎中表
达, 在根里没有表达。半定量 PCR 结果证明, 油菜
编码 28.1 kD的 caleosin同工型蛋白的 BnClo1基因
在油菜种子萌发后生长 2 d 的茎中有明显的表达,
在生长 4、6和 8 d的茎中没有明显的表达, 而在生
长 2、4、6 和 8 d 的根中都没有明显的表达。推测
油菜中至少存在 3 个油体钙蛋白基因, 在茎和根中
的表达模式是一致的, 并且油菜 caleosin 蛋白同工
型同油体结合在种子萌发过程中参与了油体的降解
及脂肪动员。但 Naested等[15]认为 caleosin蛋白不仅
在非常幼嫩的叶片中表达, 还在油菜根尖细胞中表
达, 在成熟叶片和衰老叶片中检测不到 caleosin 蛋
白。这可能有两个原因, 一是 Naested等在油菜根尖
中检测到的 caleosin蛋白与我们克隆的 BnClo1基因
编码的 caleosin 蛋白属于不同的同工型 ; 二是
Naested等利用抗拟南芥AtCLO1同工型蛋白的抗体对
油菜根尖组织进行免疫杂交, 检测到的信号可能是油
体钙蛋白类似蛋白, 并不是 caleosin蛋白同工型。
油菜 28.1 kD的 caleosin 蛋白在结构上与 Chen
等[10]在芝麻中发现的 caleosin 蛋白和 Naested 等[15]
发现并命名的 caleosin 蛋白相类似, 都符合 caleosin
蛋白的结构模型[20], 主要可以划分为 N-末端亲水性
结构域 , 中间疏水性结构域和 C-末端亲水性结构
域。N-末端亲水性结构域由 N 末端 1~16 位氨基酸
残基组成的具有弱疏水性的 α-螺旋(alpha helix)亚域
和第 17∼61 位氨基酸残基组成的具有强亲水性的随
机卷曲(random coil)亚域组成 , 包含一个潜在的能
结合一个 Ca2+的 EF-手结构域。Caleosin蛋白可与钙
离子结合, 目前推测其生理功能应当是与种子萌发
时负责信息转运来启动分解油体内中性脂肪产生能
量的机制。中间疏水性结构域主要由 80~120位氨基
酸残基组成, 在第 92位至 114位为由两个 α-螺旋构
成的跨膜区域, 构成一个脯氨酸-结(proline-knot)模
体。类似于拟南芥中 caleosin 同工型 AtCLO1 氨基
酸序列的 129~165位之间肽段, 甘蓝型油菜 caleosin
蛋白中间疏水锚定结构域中的脯氨酸-结模体及紧
接着的 N-末端 92~114 位肽段的两亲 α-螺旋域可能
在 caleosin 与油体及双层内质网膜(ER)的靶向过程
中起重要作用。α-螺旋域还能够增加 caleosin蛋白的
疏水性, 因而可能通过疏水作用增加种子油体的稳
定性[21]。C-端结构域含有很多磷酸化位点, 推测可
能在油体成熟及动员过程中起信号传递作用。
Caleosin 蛋白在发育的胚胎中是与脂肪体紧密
结合的, 参与种子中油体的生物发生过程。但是植
物机体是如何响应内外源信号进行 BnClo1 基因表
达调控, Caleosin蛋白又是如何参与油体的形成、成
熟、贮存及动员过程, 在贮油种子中, BnClo1基因表
达调控与含油量又存在着什么样的关系, 在非贮藏
组织中油体及 caleosin 蛋白又充当着什么样的角色
等问题还有待深入研究。
4 结论
从甘蓝型油菜中克隆了编码 28.1 kD 油体钙蛋
白(caleosin)的基因 BnClo1。全长 1 058 bp的 BnClo1
基因转录的 mRNA包含完整的开放阅读框和 3′末端
Poly( A)尾巴结构, 染色体 DNA 结构上包含 6 个外
显子和 5 个内含子。在油菜种子发育期间, BnClo1
基因对 mRNA 的转录表达是由胚胎发育来调控的,
具有显著的时空特性, 并与油体的形成和积累密切
有关。油菜中 caleosin蛋白是由多基因家族编码的。
推测 28.1 kD的 caleosin蛋白为 245个氨基酸残基组
成的两性蛋白质, 主要含 N 末端亲水性结构域, 中
间疏水性结构域和 C-末端亲水性结构域。N-末端亲
水性结构域包含一个潜在的结合 Ca2+的 EF-手结构。
中间疏水性结构域包含有一个潜在的脯氨酸 -结
1928 作 物 学 报 第 34卷

(proline-knot)模体, 在 92∼114 位氨基酸残基组成的
α-螺旋跨膜区域, 推测在 caleosin蛋白与单层磷脂层
和油体锚定结合上、及增加种子油体的稳定性上起
着重要的作用。
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