全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(6): 9981004 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)重点项目(2006AA10A104)和国家重大科技专项-转基因生物新品种培育项目(2008ZX08002-001)
资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张增艳, E-mail: zhangzy@mail.caas.net.cn, Tel: 010-82108781
Received(收稿日期): 2010-10-25; Accepted(接受日期): 2011-03-28.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00998
小麦抗病基因类似序列 BRG1的分离与功能分析
李 宁 1 黄 茜 1,2 刘 燕 1 赵 丹 1,2 刘 艳 3 黄占景 2 张增艳 1,*
1中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程 / 农业部作物遗传育种重点开放实验室, 北京
100081; 2河北师范大学生命科学院, 河北石家庄 050016; 3中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100193
摘 要: 利用 cDNA-AFLP 技术筛选到 1 个在抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系 YW642 中特异表达的小麦抗病基
因类似序列(BYDV resistance-related gene1, BRG1)的基因片段。利用 cDNA末端快速扩增技术(RACE)和 RT-PCR技
术, 从 YW642中分离出 BRG1基因全长 cDNA序列, 获得了一个通读的抗病同源基因 cDNA序列, 编码由 645个氨
基酸组成的蛋白质, 包含 1个NB-ARC保守结构域和 3个 LRR结构域, 该蛋白属于 nucleotide-site binding, leucine-rich
repeats (NBS-LRR)家族。荧光定量或半定量 RT-PCR表达分析表明, BRG1在抗病小麦易位系 YW642叶片中优势表
达, 受 BYDV的诱导, BYDV接种后 48 h表达量最高, BRG1在感病小麦亲本中 8601中表达量始终较低, 随 BYDV
接种时间延长呈轻微的下调趋势; 而且外源激素水杨酸(SA)与茉莉酸(JA)处理可上调该基因在 YW642中的表达。利
用病毒介导的基因沉默技术分析了 BRG1 基因的功能, 结果表明该基因沉默的抗病小麦易位系 YW642 中 BYDV 相
对含量增加, 但未造成抗病性表型显著改变, 说明该基因参与抗黄矮病反应, 但不是小麦抗黄矮病重要基因。
关键词: 小麦-中间偃麦草易位系; 小麦黄矮病抗性; cDNA-AFLP; 抗病基因类似序列; 病毒介导的基因沉默
Identification and Functional Analysis of a Wheat Resistance Analogous Gene
BRG1
LI Ning1, HUANG Xi1,2, LIU Yan1, ZHAO Dan1,2, LIU Yan3, HUANG Zhan-Jing2, and ZHANG Zeng-Yan1,*
1 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Institute of Crop Sciences / Key Laboratory of Crop Genetic and Breed-
ing, Ministry of Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2 College of Life Science, Hebei Normal University,
Shijiazhuang 050016, China; 3 Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
Abstract: Barley yellow dwarf virus (BYDV) can cause wheat yellow dwarf. In this study, we isolated a fragment of a wheat
resistance analogous gene, tentatively named BYDV response gene 1 (BRG1), which was expressed in the BYDV resistant
wheat-Thinopyrum intermedium translocation line YW642 but was not expressed in the BYDV susceptible wheat Zhong 8601
using cDNA-AFLP technique. The full-length cDNA sequence of the gene BRG1 was obtained by rapid amplification of cDNA
ends (RACE) and RT-PCR methods. The gene BRG1 encodes a NBS-LRR protein consisting of 645 amino acid residues, which
possesses one typical NB-ARC domain and three leucine-rich domains. The result of expression analysis by Q-RT-PCR method
indicated that the expression of BRG1 gene was predominant in the BYDV resistant translocation line YW642 and induced by
BYDV infection, reached the peak at 48 h post inoculation with BYDV. However the express level of the gene in the susceptible
wheat parent Zhong 8601 was lower than that in the resistant wheat YW642, and showed a decline tendency with BYDV infection
time. The mRNA expression of BRG1 gene in YW642 was up-regulated by salicylic acid (SA) and jasmonate (JA). Virus induced
gene silencing technique was used to conduct functional analysis of the gene BRG1. The results showed that after BYDV infection,
BYDV relative content in BRG1 knocked-down YW642 was higher than that in YW642 expressing BRG1 gene, whereas the si-
lenced BRG1 gene did not obviously alter the plant phenotype to BYDV infection. This result suggested that the gene BRG1 may
be involved in the host response to BYDV infection but not be an important gene.
Keywords: Wheat-Thinopyrum intermedium translocation line; Resistance to barley yellow dwarf virus (BYDV); cDNA-AFLP;
Resistance gene analog; Virus-induced gene silencing
第 6期 李 宁等: 小麦抗病基因类似序列 BRG1的分离与功能分析 999


小麦黄矮病由蚜虫介导的大麦黄矮病毒(Barley
yellow dwarf virus, BYDV)引起, 是小麦主要病毒病
之一。该病的流行难以预测, 发病后难以治愈, 被称
为“小麦癌症”, 一般年份减产 5%~10%, 流行年份
减产可达 30%[1]。选育抗黄矮病小麦新品种, 是防治
该病害的最经济有效的途径。迄今, 小麦种属中尚
未发现真正有效的抗性基因[2]。小麦近缘植物——中
间偃麦草高抗或免疫 BYDV 的多个株系, 至少含有
3个抗黄矮病基因 Bdv2、Bdv3和 Bdv4[3-5]。以小麦-
中间偃麦草附加系 L1[6]为抗源, 通过远缘杂交、中
国春 ph 突变体诱导部分同源染色体配对和组织培
养等途径, 将携带抗黄矮病基因 Bdv2的中间偃麦草
染色体 7Ai#1 长臂片段引渗到小麦中, 育成一批抗
黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系, 包括 YW642、
YW443、YW243[7-9]以及 TC5-TC10、TC14 等[10]。
并证明 YW642 中抗黄矮病基因 Bdv2 通过抑制
BYDV 的复制与运动产生黄矮病抗性[11]。然而, 中
间偃麦草染色体 7Ai#1L片段, 除携带抗黄矮病基因
Bdv2 外, 还存在不利的连锁累赘[12], 影响了这些易
位系在育种上的广泛利用。因此, 迫切需要分离克
隆出 Bdv2及其抗黄矮病相关的重要基因, 研究其作
用的分子机制, 并应用于基因工程育种, 以高效地
培育抗黄矮病、高产、优质的小麦新品种。
对模式植物抗病反应机制的研究表明, 抗病反
应是一个精细的、复杂的防御级联反应, 植物免疫
受体、抗病基因编码产物能够直接、间接地识别病
原的效应因子 , 从而激发一系列防御基因的表达 ,
最终产生对病原的抗性[13]。由此可知, 抗病基因是
抗病反应信号传导链的起始部分。因此, 克隆抗病基
因对培育抗病作物品种和研究病原物与寄主作用机
制具有重要的意义。目前, 已从烟草、马铃薯、番
茄、拟南芥、大豆、扁豆等植物中克隆出 10个显性
的植物抗病毒基因 [14], 其编码蛋白均为 NBS-LRR
蛋白, 即它们具有类似的保守结构域, 一个中心的
核苷酸结合位点(nucleotide binding site, NBS)和 C-
端的富含亮氨酸重复(leucine-rich repeats, LRR)区。
cDNA-AFLP (cDNA-amplified fragment length
polymorphism)技术是近年发展起来的将 RT-PCR 和
AFLP技术结合的新技术, 具有多态性丰富、稳定性
高、效率高等特点, 已成功用于基因差异表达谱研
究 [15]和基因分离 [16]。病毒介导的基因沉默 (virus-
induced gene silencing, VIGS)是指携带目标基因片
段的重组病毒侵染植物后, 可诱导植物内同源基因
沉默、引起表型变化, 进而根据表型变异研究目标
基因功能的技术[17]。VIGS能够使目标基因沉默、进
行功能缺失性的互补实验、完成目标基因功能的快
速分析 , 已作为研究植物基因功能的强有力工具 ,
用于烟草、番茄、大麦、小麦等植物的抗病反应、
生长发育以及代谢调控等过程中功能基因研究[17]。
因此, 将 cDNA-AFLP和 VIGS技术相结合, 可以快
速分离出重要的植物-病原互作基因。Gabriëls 等[18]
利用 cDNA-AFLP 分析了具 Cf4 抗病基因的番茄响
应叶霉病菌 Avr-4的表达谱, 获得番茄应答 Avr-4的
基因表达片段 400 余个, 用 VIGS 技术对其中 15 个
基因表达片段进行功能分析, 结果发现 1个NBS-LRR
蛋白(NRC1)是 Cf抗病蛋白功能和 INF1介导超敏反
应(HR)所必需的, 进一步证明 NB-LRR 蛋白在植物
抗病信号级联反应中起着重要作用[18]。
本研究利用 cDNA-AFLP 技术鉴定出 1 个在抗
黄矮病小麦中表达的 NBS-LRR 基因片段(BRG1),
通过 RACE 技术获得该基因的全长 cDNA 序列, 对
其结构、表达情况进行分析, 并用 VIGS技术初步分
析了该基因的功能, 以期为小麦抗黄矮病机制的深
入研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料及其处理
抗黄矮病的中间偃麦草 Z1146 由中国农业科学
院作物科学研究所小麦资源组李立会、李秀全提供,
抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系 YW642 (4*中
8601/4/中 7902/3/ L1/2*CSph/2/CSN5BT5D)、感黄矮
病的小麦亲本中 8601, 由中国农业科学院作物科学研
究所小麦分子育种组选育、保存。当上述材料长至
二叶一心时取叶片, 然后每株小麦接种 10 头携带
BYDV的毒蚜(BYDV-毒蚜)和 10头无BYDV的蚜虫,
接种 0、12、24、48和 72 h后取小麦叶片, 液氮速
冻, 用于提取 RNA。
按照 Zhang 等[19]方法, 用防卫相关的激素：水
杨酸(SA) 1 mmol L1、茉莉酸(JA) 0.2 mmol L1, 处
理抗黄矮病的小麦-中间偃麦草易位系 YW642 的叶
片, 于处理后 0、1.5、3、6、12和 24 h取小麦叶片,
液氮速冻, 用于提取 RNA。
1.2 RNA提取和双链 cDNA的合成
利用 Trizol 试剂盒(Invitrogen)提取总 RNA, 按
照 cDNA Synthesis kit (TaKaRa)的操作说明进行合
成双链 cDNA。
1000 作 物 学 报 第 37卷

1.3 cDNA-AFLP 差异显示、差异片段的回收与
扩增
AFLP 的步骤参照 Vos 等[20]报道 cDNA-AFLP
体系及程序。Pst I、Mse I双酶切 200 ng双链 cDNA,
与相应的接头连接, 将含有 Pst I、Mse I的预扩引物
扩增, 产物稀释 20倍作为模板, 再用含有 Pst I、Mse
I 的选扩引物进行选择扩增, 6%PAGE电泳分析, 分
析差异表达片段。
参照赵继荣等[21]报道的方法, 回收只在抗黄矮
病小麦中间偃麦草易位系 YW642 中特异表达、而
感病小麦中不表达的基因片段。参照赵继荣等[21]报
道的方法, 利用该选扩引物对再次扩增目的差异条
带, 将此扩增产物与原选扩产物在 6% PAGE 分析,
若与原选扩特异带一致且无杂带的, 可将此扩增的差
异条带用 1%的琼脂糖分离、回收、克隆、测序分析。
1.4 RGC1B全长 cDNA序列的获得与分析
从 cDNA-AFLP选扩引物对 P38/M16 (表 1)对抗
黄矮病小麦中间偃麦草易位系 YW642、感黄矮病
小麦亲本中 8601的扩增产物中, 分离到 1个抗黄矮
病小麦中优势表达的 NBS-LRR 同源基因片段
(BRG1)(图 1), 以该特异表达片段为靶序列设计嵌套
式引物(表 1), 参照 Invitrogen 公司的 RACE 试剂盒
操作说明, 采用巢式 PCR 扩增策略以 YW642 的
cDNA 为模板进行 3′RACE 和 5′RACE, 扩增产物
经克隆, 测序, 通过 1 次 3′RACE 和 3 次 5′RACE
获得 3′端和 5′端序列, 利用 NCBI-BLAST-Align 2
sequences using blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/
blast.cgi)进行拼接, 获得 BRG1基因的全长 cDNA序
列(3 218 bp), 然后再设计 1对引物(BR1-OU/BR1-OL)
从 YW642的 cDNA中 PCR扩增出包含完整 ORF的
BRG1基因全长 cDNA序列, 克隆、测序。
用 DNAMAN 和 DNAStar 软件分析测序结果,
将核苷酸序列和推测的氨基酸序列在 NCBI 网站
(http://blast.ncbi.nih.gov/)进行 BLAST 分析。利用
SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析推
导蛋白结构域, 用 MEGA 4软件进行系统发育分析,
比较小麦 BRG1 蛋白与小麦其他抗病蛋白 Lr21、
Lr1、Lr10、Lr19、Pm3a与 Lr34的关系。
1.5 BRG1表达特性的分析
用小麦 Actin [NCBI accession number: BE398871
(引物 WACT-F/ACT-R)]作为内标基因调整试材
cDNA 模板使起始浓度一致(即均一化), 然后利用
BRG1特异性引物、Quantative RT-PCR (Q-RT-PCR)、
RT-PCR技术分析该基因表达特性。
1.6 VIGS法分析基因的功能
参照刘晓东等[22]方法, 利用 BRG1 基因特异引
物: BR1-VI1F: 5′-GCTTAATTAAGACCAAGCTAGC
GCATCATC-3′, 该基因引物对应 BRG1 基因特异的
3′端、cDNA序列第 1 659~1 678核苷酸, 带下画线
的序列为 PacI 酶切位点 ; BR1-VI1R:5′-AAGCG
GCCGCATGACAGCGGGAATCAGT-3′该基因引物
对应 BRG1基因特异的 3′端、cDNA序列第 2 125至
2 142 位核苷酸, 带下画线的序列为 Not I酶切位点;
PCR扩增 BRG1 基因 3′端第 1 659到 2 142位核苷酸
的一段序列。该序列与小麦 NBS-LRR 假定蛋白(登
录号为 ABA54554.2)基因的同源性 64%, 与小麦其
他抗病基因如 Lr10、Pm3a、Lr19的同源性低于 50%。
亚克隆反向插入到 BSMV的 γ载体的多克隆位点形
成重组载体。参照刘晓东等[22]方法, 用转录的重组
BSMV 病毒(BSMV-BRG1)RNA 侵染二叶期的抗黄
矮病小麦易位系 YW642的第 2片和第 1片叶片, 以
使 YW642中 BRG1基因表达沉默, 在 BSMV-BRG1
侵染 7 d后接种 10头 BYDV-毒蚜, 4 d后杀死毒蚜,
于 BYDV-毒蚜接种 15 d, 以 18SrRNA作为内标基因
来调整试材 cDNA使浓度一致, 用 BYDV- RdRp (登
录号为 AY220739)引物(RdRp-F: 5′-TGACCGAGG
CTTGGAACGAC-3′, RdRp-R: 5′-CGATGGTGGCG
AGAGACAGT-3′)进行 RT-PCR 以分析 BYDV 的相
对浓度, 观察抗性表型的变化。
2 结果与分析
2.1 BRG1全长 cDNA序列的获得
通过 cDNA-AFLP 筛选, 获得一个在抗黄矮病
的小麦-中间偃麦草易位系 YW642 中表达的基因片
段, 在感黄矮病小麦亲本中 8601中不表达(图 1), 而
且该基因表达片段在携带 BYDV 的毒蚜侵染 0、48
和 72 h的 YW642中表达, 在不携带 BYDV的蚜虫
接种 48 h和 72 h的抗病 YW642中不表达(图 1), 说
明该基因表达与蚜虫刺吸无关 , 只与 YW642 对
BYDV 防御反应有关, 暂命名为 BRG1 (BYDV re-
sponse gene 1)。图 1中, 在抗病的 YW642中 BRG1
本底表达量似乎高于 BYDV 诱导后表达量, 可能与
cDNA-AFLP 选择扩增的起始浓度或该基因参与上
游反应有关, 具体原因有待通过 Q-RT-PCR 分析该
基因表达来解析。
对该特异性表达的 BRG1 片段进行分离、测序
分析, 发现该基因片段长为 146 bp, 第 43~144位核
甘酸编码氨基酸序列与小麦 NBS-LRR 假定蛋白
第 6期 李 宁等: 小麦抗病基因类似序列 BRG1的分离与功能分析 1001


表 1 BRG1基因克隆与分析所用引物
Table 1 Sequences of primers in isolation and analyses in this study
引物
Primer
序列
Sequence (5′→3′)
用途
Application
P38 GACTGCGTACATGCAGACC cDNA-AFLP选扩引物 Selective primer of cDNA-AFLP
M16 GATGAGTCCTGAGTAACGC cDNA-AFLP选扩引物 Selective primer of cDNA-AFLP
AP GGCCACGCGTCGACTAGTACT17 3′RACE第 1轮扩增通用引物 The first primer for 3′RACE
AUAP GGCCACGCGTCGACTAGTAC 3′、5′RACE第 2轮扩增通用引物 The second primer for 3′ and 5′RACE
3P1 TAGCACGCAGTTACAAAG 3′RACE第 1轮扩增的基因引物 The first round primer of gene for 3′RACE
3P2 ATGACTGGTGCATGGAAGA 3′RACE第 2轮扩增的基因引物 The second round primer of gene for 3′RACE
5P1-1 TGATTCATCTGGCACAA 第 1次 5′RACE第 1轮扩增引物 The first gene-specific primer for the first 5′RACE
5P1-2 AAGAAGGGAGCGTCATAC 第 1次 5′RACE第 2轮扩增引物 The second gene-specific primer for the first 5′RACE
5P1-3 GCCAAGCAGACTTCGGACA 第 1次 5′RACE第 3轮扩增引物 The third gene-specific primer for the first 5′RACE
5P2-1 AAGCAGACTTCGGACA 第 2次 5′RACE第 1轮扩增引物 The first gene-specific primer for the second 5′RACE
5P2-2 TCCGTGCTGTTTCTTCTA 第 2次 5′RACE第 2轮扩增引物 The second gene-specific primer for the second 5′RACE
5P2-3 AGGAAAAGCAGCAAAATA 第 2次 5′RACE第 3轮扩增引物 The third gene-specific primer for the second 5′RACE
5P3-1 ATCAATACCCTGGAA 第 3次 5′RACE第 1轮扩增引物 The first gene-specific primer for the third 5′RACE
5P3-2 TTTCTGGCAAGTGTTGTTTT 第 3次 5′RACE第 2轮扩增引物 The second gene-specific primer for the third 5′RACE
5P3-3 CGGTACATAAGGCCGTAATC 第 3次 5′RACE第 3轮扩增引物 The third gene-specific primer for the third 5′RACE
BR1-OU TGCCGAACCTGATAAAGCATC 扩增 BGR1全长 cDNA序列 Forward primer for the full-length cDNA sequence of BGR1
BR1-OL ACACTCCTTGCAGGTGGTGGT 扩增 BGR1全长序列 Reward primer for the full-length cDNA sequence of BGR1
2819U GTCGCCGCCTCCTCGTCCT RT-PCR分析 BGR1表达 Forward primer for RT-PCR analysis of BGR1
3000L CTCG CTGCCGCCACCCTC RT-PCR分析 BGR1表达 Reward primer for RT-PCR analysis of BGR1
WACT-F CACTGGAATGGTCAAGGCTG 小麦 actin 基因的 RT-PCR分析 Forward primer for RT-PCR analysis of actin
WACT-R CTCCATGTCATCCCAGTTG 小麦 actin 基因的 RT-PCR分析 Reward primer for RT-PCR analysis of actin
18S rRNA-F GTGACGGGTGACGGAGAATT 小麦 18SrRNA基因的 RT-PCR分析 Forward primer for RT-PCR analysis of 18SrRNA
18S rRNA-R GACACTAATGCGCCCGGTAT 小麦 18SrRNA基因的 RT-PCR分析 Reward primer for RT-PCR analysis of 18SrRNA



图 1 接种 BYDV-毒蚜 0~72 h后引物 P38M16的 cDNA-AFLP
电泳图谱
Fig. 1 Electrophoretic analysis of cDNA-AFLP amplified with
P38M16 primers in wheat 0–72 h after inoculation with
BYDV-aphids
R: 未接种的小麦-中间偃麦草系 YW642; S: 未接种的小麦品种
“中 8601”; RW: 接种不携带 BYDV蚜虫的 YW642, RY: 接种携
带 BYDV蚜虫的 YW642。
R: wheat-Thinopyrum intermedium translocation line; S: common
wheat variety “Zhong 8601”; RW: YW642 inoculated with aphids
without BYDV; RY: YW642 inoculated with aphids with BYDV.

ABA54554.2 的第 530 至 563 位氨基酸序列有 67%
一致性。
采用 RACE 技术、巢式 PCR 策略, 以 YW642
cDNA为模板, 通过 1次 3′RACE和 3次 5′RACE反
应, 对 RACE 产物进行克隆、测序分析与序列的拼
接, 最终获得 BRG1基因的全长 cDNA序列, 长度为
3 218 bp, 包含一个长为 1 938 bp的完整开放阅读框
(ORF)。为验证该拼接序列的正确性, 又根据拼接的
全长序列设计 1对引物(BR1-OU/BR1-OL), 以YW642
的 cDNA为模板, 扩增、克隆包含完整 ORF的基因
cDNA序列, 测序分析的结果表明, 扩增的 cDNA序
列与拼接序列完全一致, 证明了该拼接序列的正确
性。BRG1基因的全长 cDNA序列已提交到 GenBank
数据库, 登录号为 HM036360。
2.2 BRG1基因编码蛋白的序列特点
BRG1 基因编码由 645 个氨基酸组成的蛋白
BRG1。经 BLASTp 和 DNAMAN 软件分析, BRG1
蛋白序列含有 NB-ARC保守结构域, 其全长序列与小
麦的一个NBS-LRR假定蛋白(登录号为ABA54554.2)、
拟南芥抗病蛋白 RPP13 (登录号为 AF209732)、RPP8
(登录号 AAL32593), Ler3 (登录号为 AAP80285.1)、
Ei2-2 (登录号为 AAP80278.1)、Sorb2 (登录号为 AAP
80289.1)、ATP binding蛋白(登录号为 NP_175742.1)、
1002 作 物 学 报 第 37卷

玉米 RXO1 (登录号为 AAX31149.1)、番茄 NRC1 (登
录号为 ABC26878.1)等具有不同程度的同源性(30%~
80%的同源性), 与上述抗病蛋白的 NB-ARC 保守结
构域同源性较高(大于 80%)。利用 SMART分析发现,
BRG1具有 NBS-LRR抗病蛋白的特征结构域(图 2),
其 N端第 168~457位氨基酸序列为 1个典型的 NB-
ARC结构域, 由 P-loop (核心氨基酸为 GGAGKTTL)、
激酶 2a (核心氨基酸为 KRYLVVLDDVW)、激酶 3a
(核心氨基酸为 GSRVLLTTR)和 HD 疏水结构域(核
心氨基酸为 GLPLAL)组成, BRG1蛋白的 C端含有 3
个 LRR (“LxxLxLxx”)保守结构域。
BRG1 首先与小麦抗病蛋白 Lr10 聚为一类, 说
明其与 Lr10 亲缘关系最近, 其次与 Pm3a、Lr19 亲
缘关系较近, 与已克隆的小麦抗病蛋白 Lr34亲缘关
系最远(图 3), 这可能与 Lr34为 STK-STAR蛋白, 其
他分离的小麦抗病基因编码 NBS类蛋白有关。



图 2 BGC1基因编码蛋白的氨基酸序列
Fig. 2 Deduced amino acid sequence of BGC1 gene from
YW642
黑体序列表示 NB-ARC区; 带下画线的斜体序列依次表示
P-Loop、Kinase-2、Kinase-3a和 HD区; 带下画线的正体序列表
示 LRR结构域。
NB-ABC domain is shown as bond letters; P-Loop, kinase-2,
kinase-3a and HD regions are orderly shown as underline italic
sequences; LRR regions are shown as underline sequences.



图 3 BRG1与小麦其他抗病编码蛋白序列系统发育树
Fig. 3 Phylogenetic tree of deduced amino acid sequences of
BRG1 and other resistance proteins in wheat

2.3 BRG1基因的表达特性分析
在 BYDV 接种 0~72 h 的抗黄矮病小麦易位系
YW642 中均观察到 BRG1 基因有表达, 表达水平呈
上调趋势, 接种 48 h 出现诱导表达高峰, 较接种前
提高约 2倍(图 4-A), 但 BRG1在感黄矮病的小麦中
8601 中表达水平始终较弱, 低于在 YW642 中的表
达水平, 而且 BRG1在感黄矮病的小麦中 8601中随
BYDV接种时间延长呈轻微的下调趋势(图 4-A), 说
明该基因可能参与抗黄矮病小麦易位系 YW642 对
BYDV的防御反应。RT-PCR分析结果表明, 外源 SA
和 JA 处理对 BRG1 基因转录表达起促进作用(图
4-B), SA处理 3 h对 BRG1诱导表达量最高, JA处理
12 h对 BRG1表达的诱导最显著。



图 4 Q-RT-PCR/RT-PCR分析 BRG1基因的表达特性
Fig. 4 Analysis of the expression of the gene BRG1 using
Q-RT-PCR and RT-PCR

2.4 BRG1基因的功能分析
采用 VIGS 技术 , 在抗黄矮病的小麦易位系
YW642上接种 BSMV-BRG1来实施 BRG1基因的沉
默, 然后接种 BYDV-毒蚜。结果接种 BSMV-BRG1
7 d后, YW642中 BRG1基因表达量明显下调, 说明
BRG1 基因发生了沉默, 沉默效率达 66.7%, 随着接
种时间的延长 BRG1 基因沉默继续发生。图 5-A 显
示了在 BSMV-BRG1 接种 22 d 的 YW642 中 BRG1
基因表达情况。接种 BYDV 15 d后(BSMV-BRG1接
种 22 d), 与正常的 YW642抗病对照相比, BRG1基
因沉默的 YW642 植株中 BYDV-RdRp 有少量表达
(图 5-B), 但未达到感病对照中 8601中 BYDV-RdRp
的表达水平(图 5-B)。接种 BYDV 35 d进一步观察发
现, 感病对照中 8601显示感病表型, 正常的 YW642
抗病对照显示抗病表型, BRG1 基因沉默的 YW642
第 6期 李 宁等: 小麦抗病基因类似序列 BRG1的分离与功能分析 1003


植株没有显示出典型的感病表型, 说明 BRG1 基因
虽然参与了抗病小麦系对 BYDV 防御反应, 但不是
抗黄矮病的重要基因。



图 5 实施 BSMV-BRG1 22 d后W642中 BRG1与 BYDV-RdRp
相对表达量的 RT-PCR分析
Fig. 5 RT-PCR analysis of expressions of BRG1 and BYDV-
RdRp in YW642 at 22 d after BSMV-BRG1as treatment
R: 正常的 YW642; S: 中 8601; R-BRG1: 实施 BSMV-BRG1as基
因沉默的 YW642。
R: resistant control YW642 expressing-BRG1; S: susceptible con-
trol Zhong 8601; R-BRG1: YYW642 with silenced BRG1 after
treated by BSMV-BRG1as.
3 讨论
迄今, 已从玉米、拟南芥、番茄、水稻、小麦、
大麦等多种植物中成功分离克隆出 60 余个抗病
(resistance gene, R)基因。它们赋予不同寄主植物对
真菌、细菌、病毒等类型病原微生物的抗病性, 上
述基因大部分是通过图位克隆法分离出来的
NBS-LRR编码蛋白。但是, 图位法克隆基因的技术
要求高, 工作量大, 周期长。
随着更多植物抗病基因被克隆以及功能基因组
学的发展和基因功能分析新技术的完善, 人们试图
利用已克隆 R 基因保守结构和抗病基因 NBS-LRR
同源序列(RGA)共线性分离抗病基因[23-24]。某些情
况下, 这些 R 基因保守结构扩增产物有利于分离克
隆其他抗病基因, 如玉米抗锈基因 Rp1-D [25]。但是,
抗病基因 NBS-LRR 同源序列在植物基因组中大量
存在, 在禾谷类中迅速重组、重排和进化, 大麦、水
稻和小麦中同源的 NBS-LRR 基因常常缺失或者定
位到非同源染色体位置 [24], 另外与 R 基因相关的
RGA 只是其中的一部分, 新的抗病基因也许是新的
类型, 因此, 利用已克隆 R 基因保守结构分离禾谷
类其他抗病基因不一定可行。例如, 国外科学家曾
试图利用大麦与水稻的微共线性、以及水稻 R 基因
NBS-LRR 保守序列来克隆 Rpg1, 结果只获得 Rpg1
附近的分子标记 [23], 最终利用图位克隆法分离出
Rpg1 基因[26], 证明 Rpg1 编码 1 个蛋白激酶, 并在
Rpg1 位点附近鉴定出 4 个不同的 NBS-LRR 基因家
族。然而, 在水稻基因组中没有鉴定到大麦 Rpg1的
同源序列。在分离克隆小麦抗叶锈基因 Lr21、Lr10
和抗白粉病基因 Pm3b 期间, 发现小麦和水稻第一
群染色体的相应区域之间不存在基因共线性[24,27]。
这些研究结果进一步表明, 利用禾谷类基因组的共
线性分离抗病基因并非通用。
本课题组获得了 1个在抗黄矮病的小麦-中间偃
麦草易位系YW642中优势表达的 BRG1基因的全长
cDNA序列。cDNA-AFLP分析结果表明 BRG1基因
似乎只在抗黄矮病的小麦 -中间偃麦草易位系
YW642 中特异表达, 不受 BYDV 诱导; 然而 Q-RT-
PCR分析结果显示 BRG1基因在抗黄矮病的小麦-中
间偃麦草易位系YW642中优势表达, 受BYDV诱导
而上调表达, 这些差异可能与使用的引物对、所用
的分析技术有关。通过 VIGS 技术进行该基因功能
互补分析, 结果发现 BRG1 基因虽然可能参与抗病
小麦YW642对BYDV的防御反应, 但并不是抗黄矮
病的重要基因。本课题研究结果表明, 我们发现, 从
转录水平筛选到的差异表达基因未必是所要寻找的
目标基因, 因此, 及早应用 VIGS或其他技术对候选
基因进行功能快速分析非常必要。
4 结论
分离克隆出 1个在抗黄矮病的小麦-中间偃麦草
易位系 YW642 中优势表达的小麦抗病基因类似序
列 BRG1, 它编码由 645个氨基酸组成的NBS-LRR类
蛋白质, 并BRG1参与小麦抗黄矮病反应, 但不是抗
黄矮病重要基因。
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