全 文 ：简 报 第 4 5卷 第 3期 2。。。 年 2 月 科 考 五 叙
B io P hy s R e s C o m m
,
1 9 9 0
,
16 8 : 1 19 4 一 1 2 00
6 A r a k i S
,
I s h id a 工 aY m a m o t o T, e t a l In d u e t io n o f a Po P t o s i s b y h e m o rhr a g i e s n a k e v e n o m i n v a s e u l a r e n d o ht e 1i al e e l l s
.
B i o e h e m B i o P h y s R e s C o m m
,
19 9 3
,
19 0 : 14 8 一 15 3
7 J a f 亡 E A , N a c h m a n R L , B e e k e r C G , e t a l . C u l t u r e o f h u m a n e n d o t h e l ia l e e l l s d e r i v e d fr o m u n 1 b il ie a l v e i n s . J C l i n In v e s t ,
19 7 3
,
5 2 : 2 7 4 5 一 2 7 5 6
8 M i a o J Y, A r a k i S
,
H a y a s h i H
.
R e 1a t i o n sh i P s b e r w e e n Ph o s Ph a t i dy l e h o l i n e
一
sP e e i if e Ph o s Ph o l iP a s e C a n d in t e g r i n s i n
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一
s u b s t r a t u m a d h e s i o n a n d a P o Pt o s i S i n v a s e u la r e n d o th e l i a l e e l l s
.
E n d o t h e l i u m
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1 9 9 7
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5 : 2 9 7 一 3 0 5
( 1 99 9
一
0 6
一
10 收稿 , 19 9 9 一 10 一 2 0 收修改稿 )
异源细胞质小麦 一中间堰麦草易位系的培育
与荧光原位杂交鉴定
牟金叶① 李集临② 王献平① 景建康①
(①中国科学院遗传研究所 , 北京 10 01 01 ; ②哈尔滨师范大学生物系 ,
*联系人 , E m a i l : x q z h an g@ i g tP · ac . e n )
张相岐①*
哈尔滨 x 5 0 0 8 0
摘要 利用提莫菲维 .(T it m op he ve i) 细胞质雄性不 育的小麦一中间堰麦草部分双二倍体为母本与普
通小麦杂交后再与父本普通小麦连续回交和 自交 , 在后代 中选出两个稳定的小麦类型 H% 26 9一 2
和 H 9 6 2 78 , 染色体数 目均为 2n = 42 . 经接种鉴定 , 两个稳定类型均对条锈病有较好的抗性 。 以中
间堰麦草基因组 D N A 为探针的荧光原位杂交结果表明 , 两个类型都是小麦一中间堰麦草的小片段
易位系 , 易位的中间堰麦草染色体片段位于 一对小麦染色体的短臂端部 . 遗传分析表明 , 抗条锈
基因可能位于中间堰麦草染色体的易位片段上 .
关键词 小麦一中间僵麦草易位系 胞质杂种 基因组荧光原位杂交 条锈病
中间堰麦草 ( A g or p y or n int o mr ed iu m ) 是小麦的野生近缘种 , 具有抗锈病 、 黄矮病等多种
病害 , 高蛋白以及耐早 、 耐寒 、 耐贫瘩等优异性状 , 而且易于与小麦杂交 , 是改 良小麦不可
多得的优 良基因资源 , 已被广泛应用于小麦育种和遗传学研究 . 30 年代以来 , 先后培育出小
麦 一中间堰麦草部分双二倍体 「’ ,2] 、 异附加系 3[] 、 代换系 4[] 和易位系 5[] 等中间材料及小麦品种 2[] .
基因组原位杂交 ( G IS H ) 是在染色体上直接检测 目标 D N A 的存在与分布的一种较理想
的技术 . 19 8 5年 , R a yb ur n 等人 l6[ 首次将非放射性标记技术应用于植物染色体的原位杂交 , 在
小黑麦中检测到了黑麦的 D N A 重复序列 . 1 98 9 年 , L e 等人 7[] 用生物素标记的黑麦基因组 D N A
作探针 , 鉴定了小黑麦杂种及其易位系中的黑麦染色体 . 近年来 , 已有一些利用基因组荧光原
位杂交技术分析小麦 一中间堰麦草杂种遗传组成的报道 8[ 一 ` 21 , 但迄今尚未见到用基因组原位杂
交技术分析胞质杂种小堰麦易位系的报道 . 本文报道了两个提莫菲维 (tT im op h e vi )细胞质的
小麦一中间堰麦草小片段易位系的创制和基因组荧光原位杂交的分析结果 .
5 6
,
春 .
材料与方法
( i )材料 . 提莫菲维细胞质的雄性不育小麦 一中间堰麦草部分双二倍体 G 中 3 ( 2n = 8x =
由日本的常胁恒一郎教授惠赠 ) ,普通小麦品种恢 75 以及中间惬麦草和普通小麦品种中国
科 考 孟 叙 第 4 5 卷 第 3 期 2 0 0。 年 2 月 简 手及
( 1 ) 易位系的培育 . 用 G 中 3 与普通小麦品种恢 75 杂交 , 杂种 F : 与小麦亲本连续回交
和 自交 , 选出稳定的小麦类型用于抗病鉴定和染色体组成分析 .
( in ) 抗条锈病鉴定 . 对两个稳定的小麦类型 H 9 6 2 69 一 2 和 H 9 6 2 7 8分别进行了苗期和成株
期抗条锈病鉴定 . 苗期鉴定在温室中进行 , 于幼苗 2 叶期用按株涂抹方法接种 . 成株鉴定在田
间进行 , 在拔节前用喷雾法接种诱发行 . 诱发品种为高感品种铭贤 169 . 于发病盛期记载反应
型 . 反应型采用 6 级分类法 , O 级为免疫 , ;0 级为近免疫 , 1 级为高抗 , 2 级为中抗 , 3 级为
中感 , 4 级为高感 ` 抗病鉴定在 中国农业科学院植物保护研究所由吴立人研究员协助完成 .
( iv ) 染色体组成的原位杂交分析 . ( l) 染色体制片 . 小麦类型的种子在 25 ℃下萌发 , 待
根长至 1 一 2 c m 时取下根尖在冰水中预处理 24 h , 卡诺固定液 (酒精 : 醋酸 = 3 : l) 固定 1 -
Z d
, 用无离子水冲洗 , 45 % 醋酸下压片 , 液氮冷冻揭片 , 气干 , 一 20 ℃保存备用 . (2) 基因组 D N A
提取和标记 . 取中间堰麦草和普通小麦中国春的新鲜幼嫩叶片 , 用 C TA B 方法分别提取基因
组 D N A [ ’ 3 ] . 中间堰麦草 D N A 用 B i o 一 1 6一 d u T P 通过缺刻平移法 (N i e k 一 t r a n s l a ti o n )进行标记 , 标
记的探针用 1 x T E 缓冲液稀释成 20 n g · 林L 一 ’ , 一20 ℃冰箱中储存备用 . ( 3) 原位杂交 . 参考文
献 [14 〕的方法进行 , 略有改动 . 原位杂交前 , 染色体制片在 60 ℃下烘干 2 一 3 ;h 每张制片加 20
林L 杂交液 , 内含探针 D N A 20 ng , 封阻 D N A 3一4 林;g 在 8 ℃下共变性 10 m in ; 37 ℃杂交过夜
后的制片依次用 2 x S S C 一 3 0% 甲酞胺 一 2 x S S C 一 2 x S S C 一 1 x P B S 在 3 7 ℃下分别洗脱 5 m i n . (4 ) 信
号放大 .洗脱后 的制片上加 5 0 件L a n t i一 b i o t i n ( 20 林g · m L 一 ’ ) , 加盖玻片 , 3 7 ℃下保温 6 0 m i n .
1 x P B s ( 3 7℃ ) 漂洗 3 x 5 m i n , 沥干 . 每张制片加 5 0 林L a n t i一m o u s e 一 F I T e ( 一。 林g · m L 一 ’ ) , 加
盖玻片 , 3 7 ℃保温 6 0 m i n . 1 又 P B s 3 7 ℃洗 3 x 5 m i n , 沥干 . 用 3 林g · m L 一 `的 P l (p r o d i u m i o d i d e )
在室温下避光复染 5 m in , 蒸馏水快速冲洗后用抗褪色剂 v E c AT s H IE L D H 一 10 0 封片 . (5 ) 观
察与照相 杂交信号的观察在荧光显微镜下进行 . 选取信号清晰 、 染色体分散较好的细胞用
C on fo
c al 激光共聚焦显微镜扫描并照相 .
2 结果
( 1 ) 易位系的选育 . 在提莫菲维细胞质的雄性不育八倍体小堰麦 G 中 3与普通小麦品种
恢 75 杂种的连续回交再 自交的后代中选择到两个形态性状稳定 、 可育的小麦类型 H 9 6 2 6 9 一2
和 H 9 6 2 7 8 . 这两个株系均带有一些 中间堰麦草的性状 , 如穗节较长 , 颖壳较硬 , 生育期较长
等 .
( il ) 抗条锈病鉴定结果 . 苗期鉴定接种优势小种条中 29 , 31 和从 31 号分离的毒性更强
的 H y 一 3 等 3 个小种 . 鉴定结果 (表 1) 显示 , H 9 6 2 6 9一 2 和 H 9 6 2 7 8 对这 3 个小种抗性极高 , 均
达到免疫或近免疫水平 . 同时亲本小麦品种恢 75 对 3 个小种均表现高感 . 成株期接种条中 29
和 31 两个小种 , 结果除 H 2 69 一 2 对 29 号小种中感外 , 其他均表现高抗到免疫 . 并且 , 各个菌种
对这两个材料的感染严重度都比较低 ( 5% 一 40 % ) , 同时亲本小麦品种恢 75 对 29 和 31 号小
种均表现中度感染 . 为确定抗性来源 , 对这两个材料的 F : 分离群体进行了单株鉴定 , 结果两
个群体的抗性均呈单基因 M en de l 式分离 , 由此推测 , 抗性性状可能来 自于中间堰麦草的核染
色体 .
简 手及 第 4 5卷 第 3期 2 0 0。 年 2月 科 考 近 叙
表 1 小堰麦易位系苗期抗条锈病鉴定结果 ( 19 98 年 )
条锈小种
材料 苗期 成株期
H9 6 2 69
一
2
H9 6 2 7 8
恢 7 5
Hy
一
3
0
O一 0 ;
4
;0
0 ; ~ l
( in ) 原位杂交结果 . 在相差显微镜下观察 , H 9 6 2 69 一 2 和 H 9 6 2 7 8 的体细胞染色体数均为
2n
=
42
, 未见明显的形态变异 . 用生物素标记的中间堰麦草基因组 D N A 作探针进行的分子原
位杂交结果显示 : H 9 6 2 69 一 2 的每个间期细胞核 中 ( 图版 I一 1) 有两个点状黄绿色杂交信号 , 表
明其含有一对来自中间堰麦草的染色质片段 . 在有丝分裂中期细胞核中 ( 图版 I 一2 ) 可以清晰
地看到一对小麦 一中间堰麦草易位染色体 , 中间堰麦草染色体易位片段位于小麦染色体短臂的
端部 . 经显微测量 , 易位片段的长度约为短臂长的 1 l/ 0 . H 9 6 2 7 8 的间期细胞中同样可 以看到类
似图版 I一 1 的一对点状杂交信号 ( 图版 I 一 3 ) , 中期染色体的原位杂交图象也清楚地看到有一
对小麦一中间僵麦草的小片段端部易位染色体 ( 图版 I 一 4 ) . 易位片段的相对长度约为染色体短
臂的 1 /30 . 在细胞分散较好的区域 , 间期核的检测率几乎为 10 % , 中期染色体在不 同制片中
的检测率在 7 0% 一 9 0 %之间 , 平均为 76 . 4% . 易位涉及的小麦和中间堰麦草染色体的同源群归
属尚不清楚 , 需用其他技术进一步识别 .
3 讨论
近年来 , G IS H 技术由于其不需要分离特异性探针 , 并具有快速 、 直观等优点而被广泛应
用于分子细胞遗传学研究 , 实验技术已基本成熟 . 但对于亲缘关系较近的小片段易位系鉴定
仍有一定难度 . 我们认为 , 良好的染色体制片和合适的封阻 D N A 浓度是杂交成功与否 的两个
关键问题 .
要得到质量较高的制片 , 根尖良好的生长状态 、 制片过程中仔细分离根尖分生组织 、 根尖
固定保存的时间不宜过长等都是很重要的 . 本实验采用固定根尖直接压片法制作染色体标本 ,
得到了较理想 的染色体制片和原位杂交结果 .
封阻 D N A 与探针含量 的比例是基因组原位杂交成功与否的另一个关键问题 . 一般来说 ,
杂种的两个亲本基因组间亲缘关系越近 , 所需封阻 D N A 的比例越高 , 但过高浓度的封阻 D N A
会影响信号的强度 , 在本实验中 , 经过比较筛选 , 确定封阻 D N A 与探针的比例在 1 50 一 20 :l
范围内比较合适 , 既得到了清晰的杂交信号 , 又没有非特异性杂交 (图版 I 一 1) .
小片段易位系是最有育种价值的变异类型 . 关于麦类易位系的产生途径 , 可分为 自发易
位和人工诱导两类 . 自发易位主要是利用各种类型的远缘杂种 (包括附加 系 、 代换系及双二倍
体 )在与小麦杂交和回交过程中产生易位 . 关于诱导易位 已建立了多种方法 , 主要有辐射 、 尸 h
基因 、 杀配子基因 、 组织或花药体外培养等 . 但频率都很低 ( 一般在 4% 以下 ) , 小片段易位
的频率更低 . 本实验利用提莫菲维细胞质的八倍体小堰麦与恢复系小麦恢 75 杂交 , 在后代中
的 6 个稳定类型中检出了两个小片段易位系 , 其频率是非常高的 . 可能提莫菲维细胞质对于诱
导异源染色体间的易位是有利的 . 但由于类型较少 , 难下结论 , 该问题值得进一步研究 . 另外 ,
原位杂交时 , 曾用正常的八倍体小堰麦 中 3为正对照 , 结果显示信号强度和检出率与被检材料
科 考 五 叙 第 4 5卷 第 3期 2 0 0。 年 2 月 简 乡及
相似 , 说明提莫菲维细胞质对原位杂交结果没有特殊影响 . 但异源细胞质中是否含有其他有
利基因尚需进一步研究 .
本文报道了两个提莫菲维细胞质的小麦 一中间堰麦草小片段易位系 . 由图版 I 一 2 和 I 一 4 可
见两者都是端部易位 . 马有志等人 l9] 和张增艳等人 [`2 ]也曾获得小麦 一中间堰麦草的端部易位系 .
为什么易位容易发生在染色体端部 目前尚不清楚 . 推测可能和端部易位只需要一次交换或两
次断裂和一次重融 , 而中间插人易位则需要 2 次交换或 4 次断裂和 2 次重融有关 . 深人研究这
一现象对于探讨染色体结构及小麦染色体与异源染色体之间的易位机制可能会有所帮助 .
将小麦野生近缘种的优良基因导入小麦 , 培育出附加系 、 代换系或易位系是利用野生资
源改良小麦的重要步骤 , 而易位系在育种实践中最有应用价值 , 也是进行基因的分子标记和
分离 的好材料 . 本文研究的两个胞质杂种小片段易位系对小麦条锈病有 良好的抗性 , 作者已
用 R A P D 方法筛选到一个来 自中间堰麦草易位片段的分子标记 O PG O2s s0( 结果另文发表 ) . 一
方面证明了原位杂交结果的可靠性 , 同时也为克隆中间僵麦草的抗锈病基因奠定了基础 .
致谢 胡含研 究员审阅了本文 , 特致谢意 . 本工作为国家科技部 “ .九五 ” 攻关 (批准号 :% 一 01 4 一 01 一 06 一02 )
和中国科学院 “ 九五 ” 特别支持 (批准号 : K z 95 T 一0 2 一 0 2 一 0 9) 资助项 目 .
参 考 文 献
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10
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