全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(4): 588−596 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA00105)和国家棉花产业创新体系项目资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 张献龙, E-mail: xlzhang@mail.hzau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: xuelin@webmail.hzau.edu.cn
Received(收稿日期): 2008-10-12; Accepted(接受日期): 2009-01-10.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.00588
盐胁迫下棉花基因组 DNA表观遗传变化的MSAP分析
李雪林1,2 林忠旭1 聂以春1 郭小平1 张献龙1,*
1 华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 湖北武汉 430070; 2 河南科技大学农学院, 河南洛阳 471003
摘 要: 盐胁迫是非生物逆境中对作物危害比较严重的自然灾害之一, 严重影响和制约作物的产量和种植面积。本
研究以陆地棉品系YZ1 为材料, 调查不同NaCl浓度下棉花幼苗生长及根基因组DNA的甲基化水平和变化模式。结果
表明, 对棉花幼苗的株高和根长生长 100 mmol L−1 NaCl有促进作用, 200 mmol L−1 NaCl有显著抑制作用; 100~200
mmol L−1 NaCl胁迫严重抑制棉花幼苗的侧根数量。甲基化敏感扩增多态性 (methylation-sensitive amplification
polymorphism, MSAP)分析表明, 经 100、150和 200 mmol L−1 NaCl处理后根基因组DNA甲基化比率分别为 38.1%、
35.2%和 34.5%, 均低于对照(41.2%), 同时棉花幼苗根DNA的甲基化水平与NaCl处理浓度呈显著负相关(r = −0.986)。
与对照相比, 100、150和 200 mmol L−1 NaCl胁迫下棉花幼苗根基因组DNA的甲基化和去甲基化分别为 6.4%、7.6%、
11.3%和 12.7%、11.1%、8.2%。此外, 序列和RT-PCR分析表明, 与MSAP差异片段高度同源的基因的表达在处理与
对照间差异显著。
关键词: 棉花; 盐胁迫; DNA甲基化; 甲基化敏感扩增多态性; RT-PCR
MSAP Analysis of Epigenetic Changes in Cotton (Gossypium hirsutum L.)
under Salt Stress
LI Xue-Lin1,2, LIN Zhong-Xu1, NIE Yi-Chun1, GUO Xiao-Ping1, and ZHANG Xian-Long1,*
1 National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2 College of Agronomy, Henan
University of Science and Technology, Luoyang 471003, China
Abstract: Salinity is one of the important limiting factors in plant production worldwide. The objectives of the study were to
assess the effect of salt stress on the plant growth and to determine if DNA can be methylated in cotton plants (Gossypium
hirsutum) by methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP) technique. The results showed that 100 mmol L−1 NaCl
obviously promoted plant height and root length of cotton seedlings, but 200 mmol L−1 NaCl significantly inhibited plant growth;
100–200 mmol L−1 NaCl inhibited the number of lateral root considerably. The analysis of MSAP showed that the level of global
DNA methylation decreased from 41.2% to 34.5% as the salt concentrations increased; there was a significantly negative
correlation (r = –0.986) between NaCl concentrations and the level of DNA methylation in cotton roots. Under stresses of 100,
150 and 200 mmol L−1 NaCl, methylation and demethylation of DNA were 6.4%, 7.6%, 11.3% and 12.7%, 11.1%, 8.2%,
respectively. In addition, the analyses of sequences and RT-PCR showed that expressions of genes homologous to MSAP
fragments in roots were different between control and treated plants under salt stress, suggesting that these genes would play an
important role in the cotton adaptation of salt stress.
Keywords: Cotton; Salt stress; DNA methylation; MSAP; RT-PCR
DNA甲基化(DNA methylation)是一种主要的表
观遗传修饰形式, 是调节基因功能的重要手段, 在
高等植物中普遍存在。DNA甲基化主要发生在
5′-CpG-3′二核苷酸序列(偶尔为 5′-CpNpG-3′)上, 产
生 5-甲基脱氧胞嘧啶核苷酸(m5C)[1]。植物DNA甲基
化是一种普遍现象, 但DNA甲基化水平因植物种类
而异, 大约 30%~50%的基因组DNA胞嘧啶处于甲基
化状态[2]。DNA甲基化在真核生物基因表达、细胞分
化及系统发育中起着重要的调控作用, 它与基因的转
录失活(尤其转基因的沉默)、转座子的转移失活、基
第 4期 李雪林等: 盐胁迫下棉花基因组 DNA表观遗传变化的 MSAP分析 589

因组印记等多种表观遗传存在密切的关系[1,3-7]。根据
不同来源的DNA甲基化程度和甲基化位点的差别可
对外来基因进行识别, 因而DNA甲基化还与生物防
御有关[8]。
甲基化敏感扩增多态性(MSAP)是改良的AFLP
技术 [9], 采用对基因组甲基化敏感性不同的两种限
制性内切酶Hpa ΙΙ和Msp Ι对5′-CCGG位点甲基化进
行特异性切割。Hpa ΙΙ和Msp Ι都能识别并切割CCGG
序列, 但对该位点胞嘧啶甲基化的敏感性不同, 可
产生不同的DNA切割片段来揭示甲基化位点。因此,
能够很好地反映基因组DNA 5′-CCGG位点胞嘧啶的
甲基化状态和程度等[10]。现在, MSAP技术被广泛应
用于水稻、拟南芥、柑橘等基因组的胞嘧啶甲基化
评定[11-13], 已成为检测基因组甲基化水平和模式的
重要方法之一[14]。
盐胁迫对于农业生产是一种严重的制约因素 ,
所以植物耐盐适应性问题一直是世界各国的重要研
究热点[15]。研究表明, 植物在发育的不同时期, 通过
遗传及环境变化调控内源基因的表达来进行不同的
发育反应, 植物DNA甲基化水平的变化在这种调节
中起着重要的作用[16-17], 如春化作用促进开花可能
就是由于对诱导开花非常重要的基因或基因启动子
的去甲基化引起的[18]。此外, 大量研究显示, 转基因
沉默现象与转入基因的编码区和启动子区的甲基化
有关, 这种甲基化严重影响了被转入基因的正常表
达 [19]。近年来 , 以拟南芥为模式植物 , DREB2A、
DREB2B、bZIP、MYC/MYB、SOS等盐应答相关基因
及其作用方式陆续被发现, 盐胁迫下钙信号通路和
基因调控模式的研究也开始进行[15,20-22]。然而在重
要的纤维作物如棉花中, 人们对于盐胁迫下棉花基
因组DNA甲基化水平与基因表达调控的关系研究较
少。为了解DNA甲基化在棉花盐诱导下基因表达调
控中的作用及其方式, 我们使用基于AFLP的甲基化
敏感扩增多态性的方法分析了盐胁迫后棉花CCGG
位点胞嘧啶甲基化水平和模式的变化, 并分离了盐
诱导的甲基化差异片段, 为从DNA水平上揭示高盐
胁迫与植物对高盐胁迫的反应机制提供一定的理论
依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
陆地棉品系(YZ1), 由本实验室保存。在华中农
业大学的试验地种植, 经自交保纯后收获种子用作
试验材料。
1.2 植物培养与高盐胁迫处理
YZ1 种子经 0.1% HgCl2消毒后, 用无菌水冲洗
干净 , 于无菌苗培养基(1/2大量元素+1.5%葡萄糖
+0.6%琼脂粉)中萌发。2 d后挑选发芽一致的种子转
移到无菌苗培养基中进行不同浓度的盐胁迫处理 ,
NaCl (分析纯, 上海国药集团)浓度为 100、150和 200
mmol L−1, 对照为无NaCl的无菌苗培养基。培养 3周,
每个处理 30 株棉花苗。培养物在 28 ±2 , ℃ ℃ 光照强
度(冷光源) 135 µmol m−2 s−1, 每天光照 14 h的条件下
进行培养。
1.3 棉花幼苗的生长测定
处理培养 3 周后分别测定每个处理的棉花幼苗
株高(cm)、每株主根长(cm)和侧根数。根长和侧根数
测定采用直接法, 把待测根系放置在有浅水层的玻
璃盘中, 用蒸馏水湿润, 然后将玻璃盘放在带有毫
米刻度的方格坐标纸上, 用镊子把根拉直并用一块
玻璃板压着使其不移动, 根据坐标刻度计算根系长
度(精确到 0.1 cm)并统计侧根数。
1.4 基因组 DNA及 RNA提取纯化
对照和处理的棉花幼苗培养 3 周后用于提取
DNA和RNA。以改良CTAB法提取DNA[23], DNA溶
于TE缓冲液后加入RNA酶(10 mg mL−1)去除RNA, 纯
化后的DNA质量和浓度采用 0.8%琼脂糖凝胶电泳
和核酸测定仪(Backman DU800)进行检测, 于 4℃或
−20℃冰箱中保存备用。同时, 参考朱龙付等[24]方法
分别取其叶片和根(对照和 200 mmol L−1 NaCl的处
理)提取总RNA并合成cDNA第一链 , 合成的cDNA
稀释到 200 µL后 −20℃冰箱中保存用作 RT-
PCR(reverse transcription PCR)分析。
RT-PCR 以 1.5 µL cDNA 为模板, 退火温度为
60℃, 扩增反应 26循环, Gbpolyubiquitin-1基因用作
参照。扩增引物为 M2, 5′-GACATCTTGGTCTATTC
AGGAG-3′, 5′-GAACTCACACTTACTGAACTTAGC-
3′; M3, 5′-CTATTCAGGAGATGAGACCG-3, 5′-CA
TGACCCAAGAAGCTAACC-3′。
1.5 MSAP分析及聚丙烯酰胺凝胶电泳
MSAP分析采用Zhao等[25]方法, 采用的接头、预
扩增引物及选择性扩增引物见表 1。MSAP扩增产物
经 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 硝酸银染色后
进行H (EcoR Ι/Hpa ΙΙ) 和M (EcoR Ι/Msp Ι)泳道条带
数及带型统计分析。每一条带代表一个酶切识别位
点, 清晰可见的条带有无分别记为 1和 0。

590 作 物 学 报 第 35卷

表 1 MSAP分析所用的接头和引物序列
Table 1 Sequences of adaptors and primers for MSAP analysis
序列 Sequence 接头与引物
Adaptor and primer EcoR I (E) Hpa II/Msp I (HM)
接头
Adaptor
5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′
3′-CATCTGACGCATGGTTAA-5′
5′-GACGATGAGTCTAGAA-3′
3′-CTACTCAGATCTTGC-5′
预扩增引物
Pre-amplification primer
5′-GTAGACTGCGTACCAATTCA-3′
(E+A)
5′-GATGAGTCTAGAACGGT-3′
(HM+T)
选择性扩增引物
Selective-amplification primer
5′-GTAGACTGCGTACCAATTCAAC-3′
E+AAC (E4)
5′-GATGAGTCTAGAACGGTCA-3′
HM+TCA (HM25)
5′-GTAGACTGCGTACCAATTCATA-3′ E+ATA (E5)
5′-GATGAGTCTAGAACGGTCG-3′
HM+TCG (HM27)
5′-GTAGACTGCGTACCAATTCAGG-3′ E+ACG (E15)
5′-GATGAGTCTAGAACGGTCC-3′
HM+TCC (HM28)
5′-GTAGACTGCGTACCAATTCAGC-3′ E+AGC (E16)
5′-GATGAGTCTAGAACGGTGA-3′
HM+TGA (HM29)
5′-GATGAGTCTAGAACGGTGT-3′ HM+TGT (HM30)
E: EcoR I接头; HM: Hpa II-Msp I接头。E: EcoR I adaptor; HM: Hpa II-Msp I adaptor.

1.6 MSAP差异片段的回收与克隆
用干净手术刀切下差异显示带, 放入离心管中,
加双蒸水洗涤, 然后 1×PCR 缓冲液洗涤, 100 µL
1×PCR缓冲液 94℃保温 0.5 h, −20℃保存留作 PCR
重扩增。纯化后的重扩增产物连接入 T-Vector
(Promega, USA)后转化入 E. coli DH5α。经蓝白斑筛
选, 挑取阳性克隆测序(北京奥科生物技术有限责任
公司), 并在GenBank中进行了Blast序列分析(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/)。
1.7 数据分析
采用 Excel分析数据。
2 结果与分析
2.1 盐胁迫对棉花的生长影响
从图 1可以看出, 100 mmol L−1 NaCl对株高和
根长有明显的促进作用, 当NaCl浓度达 200 mmol
L−1时会显著抑制株高和根长。因为Na+是细胞活性
的必需元素, 但过量的Na+会影响细胞的渗透势, 同
时细胞内累积大量的Na+还会造成毒害。另外 , 在
100、150和 200 mmol L−1 NaCl处理下棉花幼苗侧根
的数量被显著地抑制。这可能与棉花吸收的Na+主要
存储在根系而造成离子毒害有关[26]。
2.2 NaCl胁迫引起的甲基化水平的变化
样品 DNA经 Hpa ΙΙ/EcoR Ι (H)和 Msp Ι/EcoR Ι
(M)酶切后的产物通常有 4 种甲基化类型(图 2-A), 但
在聚丙烯酰胺凝胶电泳分析胶上只能检测出 3 种甲
基化类型(如图 2-B)。其中, 类型 I (type I)表明CCGG
位点未发生甲基化, 类型 II (type II)表明CCGG位点

图 1 NaCl对棉花苗生长的影响
Fig. 1 Effect of NaCl on the growth of cotton seedlings
每个处理 30株, 不同处理之间的差异显著性水平用不同的字母表
示(P<0.05)。
Data are means±SD (n=30). Significant differences between
treatments are shown at P <0.05 with different letters.

发生半甲基化, 类型 III (type III)表明 CCGG位点发
生全甲基化。
为了检测棉花在响应盐胁迫过程中的DNA
甲基化模式 , 利用不同的引物组合(表 1)对来自
对照和盐处理的棉花根基因组DNA进行MSAP分
析。表 2 表明 , 3 种不同浓度的NaCl胁迫能导致棉
花幼苗根中全基因组DNA胞嘧啶甲基化水平的
降低 , 而且全甲基化率高于半甲基化率。由此推
测 , 在盐胁迫下棉花根基因组CCGG位点发生甲
基化的方式主要是以双链全甲基化 (CmCGG)为
主。另外 , 随着NaCl处理浓度的升高 , 棉花根基
因组DNA甲基化水平呈下降的趋势 , 甲基化水平
的增加与处理浓度之间存在显著的剂量效应关系
(r = –0.986)。
第 4期 李雪林等: 盐胁迫下棉花基因组 DNA表观遗传变化的 MSAP分析 591


图 2 Msp I和 Hpa II对 5′-CCGG甲基化状态的敏感性(A, 来自 REBASE)及 PAGE胶带型(B)
Fig. 2 Msp I and Hpa II sensitivities to 5′-CCGG methylation status (A, from REBASE) and types of bands from PAGE(B)
方块: 双链的 Hpa II-Msp I识别位点 CCGG; 黑色方块: 甲基化的胞嘧啶; +: 有酶切; –: 无酶切。类型 I: 无甲基化; 类型 II: 半甲基化(即
一条链甲基化); 类型 III: 全甲基化(即双链甲基化)。
White boxes: the double-stranded, four-base Hpa II-Msp I recognition site (CCGG); black boxes: methylated cytosine; +: digestion; –:
undigestion; type Ι: MSAP band of unmethylated site; type ΙΙ: MSAP band of hemimethylated site (5′-CCGG-3′ in single strand); type ΙΙΙ: MSAP
band of fully-methylated site (5′-CCGG-3′ in double strands).

表 2 不同浓度 NaCl处理对棉花幼苗根基因组 DNA甲基化水平的影响
Table 2 Effects of different NaCl concentrations on the levels of genomic DNA methylation in cotton seedling roots
甲基化扩增类型 Types of amplified bands
NaCl浓度
NaCl concentration 类型 I
Type I
类型 II
Type II
类型 III
Type III
总扩增带数a
Total amplified
bandsa
全甲基化比率
Fully methylated loci
ratio (%)
总甲基化带数b
Total methylated
bandsb
MSAP
(%)
0 mmol L−1 163 27 87 277 31.4 114 41.2
100 mmol L−1 172 18 88 278 31.7 106 38.1
150 mmol L−1 169 13 79 261 30.3 92 35.2
200 mmol L−1 169 13 76 258 29.5 89 34.5
a: 总扩增带数=I+II+III; b: 总甲基化带数=II+III; 全甲基化比率=类型III/总扩增带数; MSAP=总甲基化带数/总扩增带数。
a: total amplified bands=I+II+III, b: total methylated bands=II+III. Fully methylated loci ratio=III/(I + II + III); MSAP=(II + III)/(I + II + III).

2.3 NaCl胁迫引起的甲基化状态变化
利用不同的引物组合在 3个NaCl处理和对照样
品 DNA的 Hpa ΙΙ/EcoR Ι(H)和Msp Ι/EcoR Ι (M)酶切
产物中进行选择性扩增, 共扩增出 286 条带。各引
物组合检测到条带数目为 25~50, 平均约 41 条。
NaCl 处理与对照的甲基化敏感性扩增共出现 12 种
带型(图 3和表 3)。甲基化带型主要有多态性和单态
性 2种。多态性即对照与处理在甲基化模式上不同,
表明 CCGG 位点甲基化状态在 NaCl 处理后发生改
变。该多态性又有 3种状态即甲基化(A型)、去甲基
化(B 型)和不定类型(C 型)。其中, A 型中的 A1 和
A2为重新甲基化(对照 H和 M泳道都有带, 而处理
仅 H或 M泳道有带), A3和 A4为超甲基化(对照仅
H 或 M 有一条带, 而处理 H 和 M 泳道都没带)。A
型表明盐胁迫诱导棉花根基因组 DNA 发生了甲基
化水平增加的变化; B型含 B1、B2、B3和 B4, 为去
甲基化类型 , 甲基化状态与 A型相反, 表明盐胁迫
后基因组 DNA发生了甲基化水平下降的变化; C型
为不定类型, 对照组与处理组中DNA甲基化程度的
差异无法确定。单态性即对照与处理之间有相同的
带型(D型), 表明 NaCl处理后在 CCGG位点的甲基
化状态没发生变化。其中, D1型为未甲基化, D2和
D3为半甲基化。处理与对照的甲基化模式带型 A、
B、C和 D及相应的位点数见表 3。
由表 3可以看出, 100、150和 200 mmol L−1 NaCl
处理的棉花幼苗根基因组DNA甲基化(A型)位点数分
别为 17、20 和 29, 占总甲基化多态性扩增位点数的
6.4%、7.6%和 11.3%; 去甲基化(B型)位点数分别为
34、29和 21, 占总甲基化多态性扩增位点数的 12.7%、
11.1%和 8.2%。其中, 与对照相比, 100、150 和 200
mmol L−1 NaCl处理后的总甲基化多态性分别为
19.5%、19.6%和 20.3%, 甲基化状态未发生变化(D型)
比率分别为 80.5%、80.4%和 79.7%。由此可以看出,
NaCl胁迫处理后, 棉花幼苗根基因组DNA的甲基化程

592 作 物 学 报 第 35卷

度增加; 在扩增的甲基化位点中, 低浓度NaCl胁迫会
诱导去甲基化的位点数高于发生甲基化的位点数, 但
随着NaCl浓度的增加发生甲基化的位点数高于去甲基
化的位点数(图 4), 同时基因组DNA甲基化多态性也
随之增加。表明棉花幼苗根基因组DNA的甲基化和去
甲基化之比会随着NaCl胁迫的增强而逐步提高。


图 3 NaCl处理与对照之间植株根基因组的甲基化敏感性扩增结果
Fig. 3 Profiles of MSAP between control and NaCl treatments
H’和 H为 Hpa II/EcoR I酶切, M’和M为Msp I/EcoR I酶切。H’和M’泳道为对照组的MSAP带型, 而 H和M泳道为处理组的MSAP带型。
A、B、C和 D所示带型见表 3。
H’ and H represent digestion with Hpa II/EcoR I, M’ and M represent digestion with Msp I/EcoR I. Lanes H’ and M’ are MSAP patterns of
control, while Lanes H and M are those of NaCl treatments. Band patterns of A, B, C, and D are referred to Table 3.

表 3 NaCl处理与对照的甲基化状态
Table 3 Patterns of DNA methylation in NaCl treatments and control
酶切a Digestion a 甲基化状态变化 Changes of methylation status 差异数量 Numbers of sites
H M H M 处理前
Before treatment
处理后
After treatment
CK-100 CK-150 CK-200
带型b
Band
pattern b
0 0 0 1 CCGG GGCC
CCGG
GGCC 7 5 4 B3
0 0 1 1 CCGG GGCC
CCGG
GGCC 4 3 2 B4
0 1 1 1 CCGG GGCC
CCGG
GGCC 11 8 6 B1
1 0 1 1 CCGG GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC 12 13 9 B2

1 1 1 0 CCGG GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC 3 4 6 A2
1 1 0 1 CCGG GGCC
CCGG
GGCC 6 5 9 A1
0 1 0 0 CCGG GGCC
CCGG
GGCC 5 7 9 A3
1 0 0 0 CCGG CCGG GGCC GGCC
CCGG
GGCC 3 4 5 A4

0 1 1 0 CCGG GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC 1 2 2 C

1 1 1 1 CCGG GGCC
CCGG
GGCC 147 145 150 D1
1 0 1 0 CCGG CCGG GGCC GGCC
CCGG CCGG
GGCC GGCC 20 22 19 D2
0 1 0 1 CCGG GGCC
CCGG
GGCC 48 44 35 D3
a: H和M分别代表Hpa ΙΙ/EcoR Ι和Msp Ι/EcoR Ι酶切; b: 带型参考图 3; C和CC表示甲基化的胞嘧啶; 1: 有带, 0:无带。
a : H and M represent digestion with Hpa ΙΙ/EcoR Ι and Msp Ι/EcoR Ι respectively; b : band patterns are referred to Fig. 3; C and CC
represent methylated cytosine; 1: presence of band; 0: absence of band.
第 4期 李雪林等: 盐胁迫下棉花基因组 DNA表观遗传变化的 MSAP分析 593


图 4 NaCl胁迫引起的棉花幼苗根基因组 DNA甲基化和去甲基
化的变化趋势
Fig. 4 Trends of DNA methylation and demethylation changes in
cotton roots under NaCl stress

2.4 MSAP多态性片段的序列分析
通过MSAP分析, 处理(200 mmol L−1)和对照之
间 10条差异的片段被分离和测序。同源分析结果表
明, 有 5 条片段与已知具有功能特征的基因同源,
其中M2 和M3 片段分别与棉花基因组功能基因
GH_TMO Gossypium hirsutum cDNA (E-value of
3E−54) and Gossypium barbadense strain Giza 45
gypsy retrotransposon reverse transcriptase gene
(E-value of 5E−52) 高度同源(表 4)。M6片段与棉花
功能基因GR_Ea Gossypium raimondii cDNA clone
GR_Ea04F21 3, mRNA sequence (E-value of 5E−57)
高度同源。这些与棉花功能基因同源的MSAP差异片
段在对照与处理(200 mmol L−1 NaCl)之间存在甲基
化状态的变异, 表明其可能调控与盐胁迫响应的基
因表达有关, 或者直接表达而参与盐胁迫响应。
为了进一步确定盐胁迫下这些甲基化片段的甲基
化模式变化与其基因表达有关, 本实验利用与M2 和
M3 高度同源的陆地棉cDNA基因GH_TMO和海岛棉
gypsy反转座子反转录酶基因设计的两对引物, 对棉花
幼苗的根和叶进行了RT-PCR分析。利用合成的引物进
行RT-PCR分析结果表明(图 5), 与M2 和M3 同源的陆
地棉cDNA克隆GH_TMO和海岛棉gypsy反转座子反转
录酶基因仅在对照的叶片中有很低的表达, 而在NaCl
处理的叶片中没有表达; 与此相反, 这两个基因在对
照的根中没有表达, 而在NaCl处理的根中有很高的表
达。与对照相比, NaCl处理下(200 mmol L−1)这两个片
段都是发生胞嘧啶去甲基化的。由此可以看出, NaCl
胁迫诱导这两个甲基化相关的基因发生去甲基化而表
达以适应逆境胁迫。

表 4 MSAP片段的序列分析
Table 4 Sequence analysis of MSAP fragments
片段a
Fragmenta
长度b
Lengthb (bp)
引物组合c
Combinationc
E/HM
模式d
Patternd
GenBank
accession No.
同源序列
Homologous sequence
E值
E-value
M2 120 AGG/TCC ΙΙ→Ι ES806581 GH_TMO Gossypium hirsutum cDNA 3E−54
M3 138 AGG/TCC ΙΙ→Ι GBU75247 Gossypium barbadense strain Giza 45 gypsy retrotransposon reverse transcriptase gene 5E−52
M6 237 AAC/TGC ΙΙ→ — CO086416.1 GR_Ea Gossypium raimondii cDNA clone GR_Ea04F21 3′, mRNA sequence 3E−57
M1 156 AGG/TCC Ι→ΙΙ EU532253.1 Gossypium barbadense clone I6-1 ISSR marker genomic sequence 1E−20
M4 132 AGG/TGA —→ΙΙΙ CO071702 Gossypium raimondii cDNA clone GR_Ea30D16 3′, mRNA sequence 1E−18
M5 78 AGC/TGT Ι→ΙΙ EE611552
CHW(LMS) silverleaf sunflower Helianthus
argophyllus cDNA clone CHWL858, mRNA
sequence
3E−16
a: 对照和处理(200 mmol L−1)之间的MSAP多态性片段; b: MSAP多态性片段长度; c: MSAP片段扩增所用引物组合(E为EcoR I引物;
HM为Hpa II/Msp I引物); d: 对照与处理(200 mmol L−1)之间带型转变, 带型参考图 2-B。
a: MSAP fragment between control and the treatment (200 mmol L−1 NaCl); b: length of MSAP fragment; c: combination of primers used
in the amplification of the MSAP fragment (E: EcoR I primers; HM: Hpa II/Msp I primers); d: transition of band patterns between control and
treatment (200 mmol L−1 NaCl). —: absence; →: change to. Types of band are referred to Figure 2-B.

3 讨论
植物在生长发育过程中, DNA甲基化水平的改
变在调控重要功能基因表达、基因组防御以及细胞
发育与分化等方面具有重要作用 [27-28]。一般认为 ,
植物基因中的启动子和编码区的过度甲基化能阻碍
转录因子复合体与DNA的结合抑制基因的表达, 引
起基因沉默; 而去甲基化则有利于基因表达。因此,
掌握基因组甲基化水平的变化有助于研究功能基因
的表达调控以及植物适应逆境胁迫的分子机理。
在本研究中, 100 mmol L−1 NaCl对棉花幼苗有促
进作用, 但 200 mmol L−1会严重抑制其生长。这与在
角果木(Ceriops tagal)和油菜(Brassica napus)中的报道
相似 [ 2 9 - 3 0 ]。低盐促进植物生长主要是因为Na +是

594 作 物 学 报 第 35卷


图 5 M2和 M3同源的基因在棉花幼苗根和叶中的表达分析(Gbpolyubiquitin-1基因作为参照)
Fig. 5 Expressions of genes homologous to M2 and M3 respectively in leaf and root of cotton treated and untreated with NaCl
(Gbpolyubiquitin-1 gene was amplified as a loading control)
CK1和Tr1分别为对照及 200 mmol L−1 NaCl处理的叶片; CK2和Tr2分别为对照及 200 mmol L−1 NaCl处理的根。
CK1 and Tr1 represent leaves of control and treatment with 200 mmol L−1 NaCl respectively; CK2 and Tr2 represent roots of control and
treatment with 200 mmol L−1 NaCl respectively.

细胞活性的必需元素, 特别是盐生植物[30]。然而, 过
量的盐会造成植物细胞早期水分亏缺, 降低了植物
的吸水能力而影响植物生长; 后期会对植物细胞造
成毒性作用影响细胞代谢而进一步抑制植物生长。
另外, 盐胁迫显著降低棉花幼苗的侧根数, 这与前
人的研究结果一致[32]。导致侧根数量降低的主要原因
是在水分胁迫下侧根的起始与延伸被抑制了[33-34]。
通常高等植物DNA被甲基化的碱基是胞嘧啶 ,
不同植物及不同组织DNA甲基化不完全一致[27]。从
本研究对正常生长的棉花幼苗根的MSAP分析来看,
其甲基化敏感扩增位点多态性(全甲基化和半甲基
化位点)占总扩增位点数的比例达到了 41%, 这一结
果高于Zhao等[25]人的结果, 这可能与其所用材料不
同有关。但本研究结果与拟南芥的甲基化水平
(35%~43%)相近[35]。另外, 在植物基因组中CAG、
CTG和CCG位点也经常发生甲基化 , 但MSAP方法
只能检测CG和部分CCG的甲基化情况且对于双链
内外胞嘧啶甲基化无法检测, 因此整个基因组中胞
嘧啶的实际甲基化率可能高于本实验的结果。
逆境胁迫能够提高DNA甲基化水平, 如重金属
(Cd、Pb)可以引起水稻、小麦、油菜等幼苗基因组
中的总甲基化水平升高[36-37]。但在本研究中, 不同
浓度NaCl胁迫处理下, 棉花幼苗根基因组中的总甲
基化水平逐渐下降, 且与NaCl浓度呈有负相关。这
与在重金属胁迫苜蓿的结果相一致[38]。盐胁迫下的
棉花幼苗根基因组DNA甲基化水平的降低, 推测是
由于胁迫引起低甲基化与基因表达有关。研究表明,
低甲基化被认为是一种简单且间接影响逆境胁迫的
方式或者是一种准确调控基因表达的防御机制, 因
此特异序列的甲基化变异经常与改变的基因表达有
关[39]。
通过对不同浓度NaCl胁迫下棉花幼苗根基因组
DNA甲基化模式的分析, 发现NaCl处理和对照之间
甲基化带型的变化主要有 4 种。随着NaCl浓度的增
加, 棉花幼苗根基因组DNA甲基化的比率持续上升,
而去甲基化比率却下降(图 5)。这与其他逆境胁迫下
的DNA甲基化模式变化趋势一致[39]。另外, NaCl胁
迫下棉花幼苗根基因组DNA的甲基化模式变化趋势
也与其生长趋势相似。NaCl浓度在 100 mmol L−1时
棉花幼苗根基因组DNA的去甲基化高于甲基化, 其
生长是受到促进的; 但是当NaCl浓度达到 200 mmol
L−1时棉花幼苗根基因组DNA的去甲基化急剧降低,
而甲基化显著升高, 生长也受到抑制。由此推测, 棉
花幼苗经NaCl胁迫处理后基因组DNA某些位点的
甲基化状态发生变化而使基因表达发生了改变, 产
生或启动对NaCl胁迫的能动应激机制, 将毒害降到
最小, 从而有利于植株的生长发育 [36]; 当胁迫持续
增强时利用甲基化关闭相关基因而终止其表达, 以
减少消耗来维持最低的生长发育。这与生长在高电
离辐射区的松树基因组DNA发生甲基化程度升高的
第 4期 李雪林等: 盐胁迫下棉花基因组 DNA表观遗传变化的 MSAP分析 595

变异, 构建基因组防御体系以维持基因组稳定的机
制相似[39]。
植物基因组DNA的甲基化是调节基因功能的重
要手段, 例如许多内源基因在经甲基化抑制剂 5-氮
胞苷(5-azacytidine)处理后被激活[17]。为了深入了解
功能基因的甲基化与响应NaCl胁迫是否有关, 我们
将对照与处理(200 mmol L−1)之间的多态性片段进
行了测序。利用Blast分析发现 5 条片段与具有功能
特征的基因同源 (表 4), 分别是陆地棉cDNA基因
GH_TMO、海岛棉gypsy反转座子反转录酶基因、雷
蒙德棉cDNA克隆GR_Ea04F21 的 3′端mRNA序列、
雷蒙德棉cDNA克隆GR_Ea30D16的 3′端mRNA序列
和向日葵cDNA克隆CHWL858 的mRNA序列。这些
基因在对照与处理之间存在不同的甲基化修饰(表
4), 显示其可能参与了盐胁迫响应。其中, 与M3 片
段同源的基因编码反转座子的反转录酶, 是转座子
转座所必需。反转座子是植物基因组中最丰富的移
动元件, 在环境胁迫诱导的基因组重组中起着重要
作用 [40-41]。在植物基因组中 , 反转座子中包含有
DNA甲基化的一些位点。这些序列通过被甲基化和
沉默来保护宿主基因组。Cheng等[42]研究反转座子
Tos17 的甲基化模式与转座行为的相互关系时, 发
现其转座活性与其DNA甲基化水平呈负相关。反转
座子除通过其本身的转座以使植物基因组适应逆境
胁迫外, 还具有改变其临近基因表达的潜力[42-43]。
在本研究中, RT-PCR分析结果表明在 200 mmol L−1
NaCl胁迫下反转座子反转录酶基因在棉花幼苗根中
表达升高, 而在对照中没有表达, 说明在盐胁迫下
棉花幼苗根中反转座子的转录活性得到增强。
总之, 通过 MSAP 检测到在不同的盐胁迫下棉
花幼苗根基因组中的胞嘧啶甲基化存在差异, 至少
有些差异的片段是与棉花幼苗的根响应盐胁迫有
关。然而, 还需要更多包含甲基化修饰的 5′-CCGG-
3′序列的分离和基因功能的研究才能更深入地理解
盐胁迫下基因组 DNA的甲基化及逆境适应的机制。
4 结论
棉花幼苗对不同浓度NaCl的胁迫反应不同。100
mmol L−1 NaCl对棉花幼苗的生长有促进作用 , 而
NaCl浓度超过 150 mmol L−1时会抑制其生长; 同时盐
胁迫还抑制棉花幼苗侧根的数量。棉花幼苗根基因组
DNA的甲基化水平随着NaCl盐胁迫浓度的升高而逐
渐降低, 以此启动基因的表达来响应盐胁迫。
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