全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(5): 914−920 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(31101195, 30971837, 30860150), 国家科技支撑计划项目(2007BAD30B00), 国家现代农业产业技术
体系建设专项(CARS-20-3), 广西自然科学基金项目(0991009Z, 2010GXNSFB013027, 2011GXNSFF018002)和广西农科院基金项目
(200906Z, 200923, G2010005, G2009008, G2009010, 桂农科 2011YT01, 桂农科 2012YZ10)资助。
* 通讯作者(Corresponding authors): 张革民, E-mail: zhanggm68@gxaas.net; 李杨瑞, E-mail: liyr@gxaas.net
第一作者联系方式: E-mail: liuxihui@gxaas.net
Received(收稿日期): 2011-07-25; Accepted(接受日期): 2012-01-19; Published online(网络出版日期): 2012-03-05.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120305.1038.009.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00914
斑茅割手密杂种后代真实性鉴定及遗传分析
刘昔辉 方锋学 高轶静 张荣华 宋焕忠 杨荣仲 方位宽
段维兴 罗 霆 张革民∗ 李杨瑞∗
广西农业科学院甘蔗研究所 / 广西甘蔗遗传改良重点实验室 / 中国农业科学院甘蔗研究中心 / 国家糖料改良中心广西甘蔗品种改
良分中心 / 甘蔗育种与栽培国家地方联合工程研究中心, 广西南宁 530007
摘 要: 以斑茅 GXA87-36(♀)与割手密 GXS79-9(♂)杂交获得的经形态鉴别为真杂种的后代材料 GXAS07-6-1 (斑茅
割手密杂合体)及其双亲为材料, 利用体细胞染色体计数以及 SSR、SRAP 分子标记对杂种进行真实性鉴定, 并利用
SRAP 分子标记对斑茅 GXA87-36、割手密 GXS79-9 及其杂种后代遗传位点的传递进行分析。结果表明, GXA87-36
体细胞染色体数为 2n=60, GXS79-9体细胞染色体数为 2n=64, 其杂种 GXAS07-6-1染色体 2n=62, 其杂交的染色体遗
传方式为 n+n; 筛选出 3对 SSR引物和 5对 SRAP引物可分辨后代的真伪; 利用 71对 SRAP引物扩增后代和双亲, 检
测到 1 095个遗传位点, 多态性位点数为 800; 母本有 279个位点, 其中有 79%传递给其后代; 父本有 439个位点, 其
中有 73%传递给后代; 用 NTSYS-pc2.10e软件计算 Jaccard遗传相似系数, 双亲间为 0.474, 后代与母本、父本间分别
为 0.696、0.752, 表明后代 GXAS07-6-1偏向父本遗传。
关键词: 斑茅; 割手密; 杂种鉴定; SSR; SRAP
Identification and Genetic Analysis of Hybrid from Cross between Erianthus
arundinacius (Retz.) Jesws. and Saccharum spontaneum L.
LIU Xi-Hui, FANG Feng-Xue, GAO Yi-Jing, ZHANG Rong-Hua, SONG Huan-Zhong, YANG Rong-Zhong,
FANG Wei-Kuan, DUAN Wei-Xing, LUO Ting, ZHANG Ge-Min∗, and LI Yang-Rui∗
Sugarcane Research Institute, Guangxi Academy of Agricultural Sciences / Guangxi Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement / Sugarcane
Research Center, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Guangxi Sugarcane Variety Branch, National Sugar Crops Improvement Center / State
and Province Joint Research Center for Sugarcane Breeding and Cultivation Technologies, Nanning 530007, China
Abstract: Hybridization between different populations is the most common means to enrich genetic variation. Studies on genetic
differentiation and characterizations of hybrid are crucial to protect and evaluate genetic resources. In this paper, the hybrid from
Erianthus arundinacius (Retz.) Jesws. × Saccharum spontaneum L. were analyzed using SSR and SRAP markers. The results
showed that the hybrid GXAS07-6-1 was the true hybrid identified by using three pairs of SSR primers and five pairs of SRAP
primers. A total of 1 095 DNA bands were amplified by 71 pairs of selective SRAP primers. Among 1 095 genetic loci, 800 were
polymorphic. Therefore, the average polymorphic ratio was 73.0% and each pair of SRAP primers yielded 11 polymorphic loci on
average. The genetic relationship between the hybrid and its parents analyzed with software NTSYS-pc2.10e showed that the
genetic similarity coefficient was 0.474 between the parents, while 0.696 between the hybrid and the female parent and 0.752
between the hybrid and the male parent, suggesting that the hybrid GXAS07-6-1 was more inherited from male parent.
Keywords: Erianthus arundinacius (Retz.) Jesws.; Saccharum spontaneum L.; Hybrid identification; SSR; SRAP
遗传基础狭窄是近年来甘蔗育种难获突破的主要因
素之一 , 通过远缘杂交导入野生种质血缘是拓宽甘蔗遗
传基础的重要途径。斑茅[Erianthus arundinacius (Retz.)
Jesws.]和割手密(Saccharum spontaneum L.)分别属于蔗茅
第 5期 刘昔辉等: 斑茅割手密杂种后代真实性鉴定及遗传分析 915
属和甘蔗属, 两者均具抗旱、耐瘠、宿根性强、分蘖性强、
粗生、适应性广等许多优良性状, 同时作为甘蔗种质资源
也各有其优点和缺点 , 如也是甘蔗抗病基因的主要来
源[1-3]。目前国内对斑茅和割手密的利用主要基于“单元”
杂交的策略 , 即单纯地利用斑茅或割手密与甘蔗杂交再
进一步回交[4-5]。对甘蔗杂交后代真实性的鉴定, 有植物
学法[6]、同工酶法[6]、分子标记法[7-9]等, 其中分子标记最
为准确, 它可从DNA水平上获得最直接的证据。SSR标记
和SRAP标记都是基于PCR的分子标记, 具有简便、快速
的特点 , 近年来在遗传多样性分析 [10-11]、遗传图谱构建
[12-13]、种质鉴定[7-9]等研究领域得到广泛应用。本文拟通
过斑茅(母本)与割手密(父本)之间远缘杂交, 结合SSR和
SRAP两种分子标记对杂交后代进行真实性鉴定, 同时利
用SRAP标记对后代及双亲间进行遗传多样性分析, 以期
为进一步研究利用甘蔗近缘属植物种质创新提供可资借
鉴的依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以斑茅 GXA87-36 (简称 87-36)为母本、割手密
GXS79-9 (简称 79-9)为父本自然授粉。在杂交温室内杂交
完成后严格套袋隔离, 至成熟后收获花穗。经形态鉴别获
得斑割杂合体 07-6-1。
1.2 染色体观察与计数
将带节茎段(斑茅用蔗兜)在 30℃条件下培养长根 ,
取幼嫩、健壮的根尖 0.5 cm, 置 0.002 mol L–1 8-羟基喹啉
溶液中预处理 1.5~2.0 h (室温), 后转入固定剂(甲醇∶冰
乙酸=3∶1)于 4℃冰箱固定 12 h以上; 低渗 30~60 min; 用
终浓度为 500 U的纤维素酶和 250 U果胶酶混合液 37℃酶
解 24~30 h (不同品种, 以及同一品种根尖大小不同酶解
时间有所差异); 再低渗 30~60 min (室温); 取 1~2个根尖
于一载玻片上, 用镊子将根尖捣碎并涂抹开, 夹去大块残
渣, 空气干燥; 用改良卡宝品红溶液染色 15~20 min, 空
气干燥, 将染色体标本载片存放于 4℃冰箱。在尼康荧光
相差显微镜 80i下观察制片, 用CCD尼康DS-5M拍摄并连
输电脑, NIS-Elements F 3.0软件收集图片。取每样品 15
个完整细胞在 1 000倍显微镜下计数染色体, 选择分散良
好的细胞拍照。
1.3 基因组 DNA的提取
取植物苗期生长良好的幼嫩叶片, 采用SDS方法[14-15]
提取基因组DNA。并用 1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯
度。
1.4 SSR-PCR扩增
SSR引物按文献[16], 筛选出 3 对引物对斑割杂合体
进行真实性鉴定(表 1)。参考刘昔辉等[17]的PCR方法并稍
有改动, 反应总体积为 25 µL, 每管含 10×PCR buffer 2.5
µL、30 ng µL–1模板DNA 1 µL、0.24 µmol L–1 dNTPs、0.6
µmol L–1引物、2.5 mmol L–1 Mg2+、Taq DNA聚合酶 1.5 U。
反应在Biometra PCR扩增仪(Tgradient 96 型, 德国)上进
行, 程序为 95℃预变性 1 min; 94℃变性 30 s, 54℃退火 1
min, 72℃延伸 50 s, 共 35个循环; 72℃延伸 5 min, 4℃保
存。扩增产物经 6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 将扩增
产物与荧光染料混合点样, 电泳结束后直接在Pharmacia
Biotech多功能凝胶成像系统观察拍照。
1.5 SRAP-PCR扩增
选取 86对 SRAP引物组合进行筛选(表 2), 总体积为
表 1 SSR标记引物序列
Table 1 Sequences of primers for SSR marker analyses
编号
Code
正向和反向引物
Forward and reverse primers (5′–3′)
mSSCIR19 F: GGTTCCAAAATACACAAA; R: CAATCTTATCTACGCACTT
mSSCIR36 F: CAACAATAACTTAACTGGTA; R: CTGTCCTTTTTATTCTCTTT
mSSCIR67 F: GACTGAGTATTGGCTTGG; R: GCTTCTTCTTTGGTCGTT
表 2 SRAP标记引物序列
Table 2 Sequences of primers for SRAP marker analyses
编号
Code
正向引物
Forward primers (5′–3′)
编号
Code
反向引物
Reverse primers (5′–3′)
em1 GACTGCGTACGAATTCAA me1 TGAGTCCAAACCGGATA
em2 GACTGCGTACGAATTCTG me2 TGAGTCCAAACCGGAGC
em3 GACTGCGTACGAATTGAC me3 TGAGTCCAAACCGGACC
em4 GACTGCGTACGAATTTGA me4 TGAGTCCAAACCGGACA
em5 GACTGCGTACGAATTAAC me5 TGAGTCCAAACCGGTGC
em6 GACTGCGTACGAATTGCA me6 TGA GTC CAA ACC GGA AT
em7 GACTGCGTACGAATTGAG me7 TGA GTC CAA ACC GGA AG
em8 GACTGCGTACGAATTGCC me8 TGA GTC CAA ACC GGT AG
em9 GACTGCGTACGAATTTCA me9 TGA GTC CAA ACC GGT TG
em10 GACTGCGTACGAATTCAT me10 TGA GTC CAA ACC GGT GT
916 作 物 学 报 第 38卷
20 µL, 每管含 10×PCR buffer (含Ma2+) 2 µL、30 ng µL–1模板
DNA 1 µL、10 nmol L–1上下游引物各 1.0 µL、10 nmol L–1
dNTPs 0.4 µL、Taq DNA聚合酶 0.6 µL。反应在Biometra
PCR扩增仪(Tgradient 96型, 德国)上进行, 程序为 95℃预
变性 5 min; 94℃变性 1 min, 35℃退火 50 s, 72℃延伸 50 s,
5个循环; 94℃变性 30 s, 50℃退火 30 s, 72℃延伸 1 min, 35
个循环; 循环结束后 72℃延伸 5 min。电泳及照相方法同
1.4。
1.6 杂交后代真实性鉴定
筛选出父母本间具有特征性条带的引物(组合)对杂
交后代进行真实性鉴定。杂种扩增结果中具有双亲特征条
带的即为真杂种 , 只有母本特征条带而无父本特征带的
后代为假杂种或自交种。
1.7 数据分析
根据亲本与后代扩增的 SRAP图谱, 统计扩增的条带
数, 每一个条带看作一个遗传位点, 在相同迁移位置有带
记为 1, 无带记为 0, 建立 0/1矩阵。采用 NTSYS-pc2.10e
软件计算 Jaccard遗传相似系数。
2 结果与分析
2.1 斑茅割手密及后代斑割杂合体染色体数目
经显微镜观察和计数, 母本广西斑茅 87-36的体细胞
染色体数为 2n=60, 父本广西割手密 79-9 为 2n=64, 后代
斑割杂合体 07-6-1染色体数为 2n=62 (图 1), 斑茅与割手
密杂交的染色体传递为“n+n”方式。
2.2 引物筛选
筛选出 3 对 SSR 引物、5 对 SRAP 引物组合斑割杂
合体 07-6-1 进行真实性鉴定; 筛选出 71 对引物组合对斑
割杂合体及亲本间进行多态性分析(表 1、表 2和图 2)。
2.3 杂种真实性鉴定
2.3.1 SSR 标记鉴定 图 3 表明, 杂种 07-6-1 具有父
本、母本的特征带, 如引物 mSSCIR36, 07-6-1具有 150 bp
的母本特征带, 同时又具有 180 bp和 200 bp处的父本特
征带; 引物mSSCIR67, 07-6-1约在 80 bp和 250 bp处分别
具有母本、父本特征带; 引物 mSSCIR19, 07-6-1具有 200
bp处的父本特征带。SSR标记结果确认 07-6-1为真杂种。
2.3.2 SRAP 标记鉴定 筛选出的 5 对 SRAP 引物(表
3)能在后代杂合体中扩增出双亲特征条带(图 4), 如引物
组合 me6+em7、me6+em8、me6+em9、me6+em10、me8+em5,
07-6-1 分别在约 140~180、80、350、400 和 350 bp 处具
有父本特征带。SRAP标记结果可将 07-6-1鉴定为真杂种。
2.4 后代及亲本的遗传分析
2.4.1 多态性 SRAP引物筛选 从 86对 SRAP引物中
筛选出 71 对引物组合, 在双亲和后代中共扩增出 1 095
个遗传位点(部分结果图 5), 其中 800 个多态性位点, 多
态性检出率为 73.06%。平均每对引物扩出 15个位点, 其
图 1 母本、父本和后代的体细胞染色体数目
Fig. 1 Chromosome number in female parent, male parent and their hybrid
A: 广西斑茅 GXA87-36; B: 广西割手密 GXS79-9; C: 斑割杂合体 GXAS07-6-1。
A: female parent Erianthus arundinacius (Retz.) Jesws. GXA 87-36 (2n=60); B: male parent Saccharum spontaneum L. GXS79-9 (2n=64);
C: hybrid GXAS07-6-1 (2n=62).
图 2 SRAP引物筛选
Fig. 2 SRAP primer screening
1: 母本 GXA87-36; 2: 父本 GXS79-9; 3: 杂种 GXAS07-6-1; M为 DNA标准参照物。
1: female line GXA87-36; 2: male line GXS79-9; 3: hybrid GXAS07-6-1; M: marker.
第 5期 刘昔辉等: 斑茅割手密杂种后代真实性鉴定及遗传分析 917
图 3 对杂交后代斑割杂合体 07-6-1的 SSR检测
Fig. 3 SSR fingerprints amplified with some primers for the parents and hybrid GXAS07-6-1
1: 母本 GXA87-36; 2: 父本 GXS79-9; 3: 杂种 GXAS07-6-1; 箭头所指为双亲特征带。
1: female line GXA87-36; 2: male line GXS79-9; 3: hybrid GXAS07-6-1; The arrows indicate the polymorphic bands.
图 4 部分引物对杂交后代斑割杂合体 07-6-1 SRAP鉴定
Fig. 4 SRAP fingerprints amplified with some primers for the parents and hybrid GXAS07-6-1
图中的数字所代表的材料同图 3。Numbers in Fig. 4 are same as in Fig. 3.
图 5 对亲本斑茅、割手密和杂交后代的 SRAP分析
Fig. 5 SRAP fingerprints amplified with some primers for the parents and hybrid
图中的数字所代表的材料同图 3。Numbers in Fig. 5 are same as in Fig. 3.
中 11 个具有多态性, 引物 me10+em3 扩增出的多态性位
点数最多, 为21个; 引物的多态性百分比在50.00%~95.45%
之间(表 3)。
2.4.2 斑割杂合体及双亲的分子标记遗传分析 利用
SRAP 引物扩增出 1 095 个遗传位点, 其中父本特有位点
439个, 其中有 73 %传递给其后代; 母本特有位点 279个,
其中有 79%传递给后代; 后代特有位点 37 个, 占遗传位
点的 4.1%。利用 NTSYSpc 2.10e 软件分析得知, 母本与
父本间的遗传相似系数为 0.474; 后代与母本、父本的遗
传相似系数分别为 0.696和 0.752, 都有较高的相似性, 其
中又以后代与父本的遗传相似系数相对较高。
3 讨论
3.1 斑茅与割手密杂交的染色体行为分析
前人报道斑茅的染色体数有 2n=20、40、60 这 3 种
类型, 割手密有 2n=60、64、70、72、76、78、80、92、
96、104、108 共 11 种类型[18]。本研究的斑茅GXA87-36
的染色体数 2n=60, 割手密GXS79-9 为 2n=64, 结果与前
人研究一致 [18]。后代斑割杂合体GXAS07-6-1 染色体数
2n=62, 由此可以推断, “斑茅×割手密”的染色体传递方式
为“n+n”, 后代从亲本斑茅和割手密各遗传了一半的染色
体。印度Lalitha和Premachandran[22]报道, “割手密×斑茅”
后代出现“n+2n”、“2n+n”传递情况, 即子代染色体条数来
自于双亲的一半或全部。这两种杂交间不同的亲子染色体
传递方式表明, 斑茅、割手密属间杂交的正交和反交的亲
子染色体传递方式很可能截然不同, 导致这种差异的原
因值得进一步研究。
由于割手密染色体的多倍性, 具有不同染色体数目
的类型多 [18] , 减数分裂时会出现各种不规则的分裂, 因
此, 单纯从细胞学水平的计数不一定都能准确阐明斑茅、
918 作 物 学 报 第 38卷
表 3 71对 SRAP引物的多态性
Table 3 Genetic diversity of 71 pairs of SRAP primers
引物编号
Primer code
总条带
Total
No. of bands
多态性条带
No. of poly-
morphic bands
多态性比率
Percentage of
polymorphic
bands (%)
引物编号
Primer code
总条带
Total
No. of bands
多态性条带
No. of poly-
morphic
bands
多态性比率
Percentage of
polymorphic
bands (%)
me10+em1 16 13 81.25 me6+em2 22 19 86.36
me10+em2 18 11 61.11 me6+em5 13 10 76.92
me10+em3 22 21 95.45 me6+em6 9 7 77.78
me10+em4 17 13 76.47 me6+em7 20 15 75.00
me10+em5 13 12 92.31 me6+em8 24 14 58.33
me10+em7 10 5 50.00 me6+em9 15 11 73.33
me10+em9 18 13 72.22 me6+em10 16 15 93.75
me10+em10 23 18 78.26 me8+em5 17 15 88.24
me9+em10 16 13 81.25 me3+em1 10 6 60.00
me9+em9 7 5 71.43 me3-em4 12 8 66.67
me9+em7 10 6 60.00 me3+em5 11 8 72.73
me9+em5 13 11 84.62 me3+em6 17 11 64.71
me9+em4 14 10 71.43 me3+em7 13 11 84.62
me9+em3 15 11 73.33 me3-em9 14 9 64.29
me8+em2 18 16 88.89 me3+em10 11 10 90.91
me8+em1 17 13 76.47 me8+em9 12 10 83.33
me7+em1 12 9 75.00 me5+em1 12 8 66.67
me7+em4 21 16 76.19 me5+em2 13 9 69.23
me7+em5 14 10 71.43 me5+em3 16 10 62.50
me7+em7 15 9 60.00 me5+em4 14 8 57.14
me7+em9 15 12 80.00 me5+em5 17 11 64.71
me7+em10 18 12 66.67 me5+em6 12 7 58.33
me8+em3 17 13 76.47 me5+em7 15 12 80.00
me6+em1 17 12 70.59 me5+em8 18 11 61.11
me5+em9 18 14 77.78 me1+em9 11 7 63.64
me5+em10 13 10 76.92 me1+em10 19 12 63.16
me8+em6 11 8 72.73 me2+em1 17 14 82.35
me8+em7 13 9 69.23 me2+em2 9 6 66.67
me1+em1 20 17 85.00 me2+em3 27 16 59.26
me1+em2 18 13 72.22 me2+em5 21 16 76.19
me1+em3 20 11 55.00 me2+em6 12 7 58.33
me1+em4 21 17 80.95 me2-em7 13 7 53.85
Me1+Em5 12 9 75.00 Me2+Em8 22 17 77.27
Me1+Em6 10 7 70.00 Me2+Em9 14 9 64.29
Me1+Em7 11 7 63.64 Me8+Em10 17 16 94.12
Me1+Em8 17 12 70.59 总和 Total 1095 800 73.06
平均Mean 15 11 73.33
割手密远缘杂交后代染色体的遗传行为 , 后续研究中借
助基因组原位杂交技术则能大大提高准确性。
3.2 斑茅割手密及后代遗传分析
本研究用 71 对SRAP引物对材料基因组DNA进行扩
增, 共得到 1 095个遗传位点, 其中多态性位点 800条, 多
态性位点百分比为 73.0%, 表现出了较高的多态性比率,
这与其他作物的研究结果基本一致[19-21]。同时, 大多引物
都能在后代中扩增出双亲的特征带如me5+em5、me5+
em4、me5+em7、me6+em9等, 可在分子水平上证明斑割
杂合体 07-6-1 具有斑茅与割手密的遗传物质。研究中发
第 5期 刘昔辉等: 斑茅割手密杂种后代真实性鉴定及遗传分析 919
abstract)
现 , 有些引物的扩增结果不能使后代谱带呈现双亲互补
带型, 同时杂交后代即使可以被确定为真杂种, 其扩增谱
带也不是双亲条带之和 , 而会出现谱带的消失或新谱带
的增加, 例如斑割杂合体 07-6-1产生了一定的特征带, 其
原因有待进一步研究。后代与母本、父本的遗传相似系数
分别为 0.696、0.752, 说明后代与双亲的遗传偏向父本, 这
可能与割手密GX79-9的染色体数比斑茅GXA87- 36多有关,
这与据其染色体计数结果推断的“斑茅×割手密”的染色体
传递方式为“n+n”基本相符。
3.3 SSR、SRAP标记对斑茅割手密杂交后代的鉴定
目前, 利用SSR标记在甘蔗的遗传图谱构建、品种鉴
定、分子辅助育种等领域的研究较多[10-14], 而SRAP标记
应用于甘蔗育种研究的报道很少, Alwala等[23]利用SRAP
标记对甘蔗Louisiana Striped与割手密“SES 147B”杂交后
代真实性鉴定; Andru等 [24]利用SRAP标记对甘蔗、割手
密、芒、蔗茅等 30 份种质进行亲缘关系评价分析。本研
究中, 2 种标记对甘蔗斑茅割手密后代的鉴定均适用, 相
对SSR而言, SRAP标记揭示的多态性较丰富, 通过对 86
对引物筛选, 得到 71 对引物具有多态性且大多具有双亲
特征带。本文研究结果表明SSR和SRAP标记是研究斑茅
割手密杂交后代真实性和分析后代与双亲间多态性行之
有效的方法, 尤其是目前在甘蔗育种上应用不多的SRAP
标记, 在本研究中表现出了较大的应用潜力。
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