全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(6): 1013−1020 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30871559和 30600396)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 林忠旭, E-mail: linzhongxu@mail.hzau.edu.cn; Tel: 027-87283955; Fax: 027-87280016 ** 共同第一作者
Received(收稿日期): 2008-09-16; Accepted(接受日期): 2009-02-15.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.01013
首批海岛棉基因组来源的微卫星标记的分离、评价和定位
张培培 王夏青** 余 杨 余 渝 林忠旭* 张献龙
华中农业大学植物科学技术学院 / 作物遗传改良国家重点实验室与国家植物基因研究中心(武汉), 湖北武汉 430070
摘 要: 海岛棉(Gossypium barbadense)是世界上最重要的栽培棉种之一。海岛棉纤维品质优良, 是优质棉的重要产
源。为了研究海岛棉的遗传多样性, 为海岛棉育种提供参考依据, 从海岛棉遗传标准系中分离基因组来源的微卫星标
记用于海岛棉遗传评价。采用两种方法分离微卫星标记 , 一是用 ISSR (inter simple sequence repeat) 引物扩增
Pima3-79, 克隆测序后从中开发微卫星标记; 二是利用简并引物扩增 Pima3-79, 克隆测序后从中开发微卫星标记。共
挑选 1 447个克隆, 筛选出 239个独立克隆。测序后得到 214个单一序列, 其中包含微卫星并可用于引物设计的序列
70个, 获得 86对引物。86对引物用于扩增 56个海岛棉材料和 4个陆地棉材料, 16对引物没有扩增, 43对引物在所
有材料中没有多态性; 27对引物在海岛棉和陆地棉之间有多态性, 19对引物在海岛棉中表现多态性。利用 Jaccard相
似系数和 UPGMA方法进行聚类分析可以明显区分陆地棉和海岛棉, 并且将海岛棉分为 4类。14对引物在 BC1群体
中表现多态性, 产生 14个位点。9个位点整合到 BC1连锁图的 7个染色体上, 4个位于 A亚基因组, 5个位于 D亚基
因组。海岛棉微卫星标记扩展了棉花微卫星标记, 有助于海岛棉遗传多样性的研究, 有利于棉花遗传图谱的进一步丰
富。
关键词: 海岛棉; 微卫星标记; 遗传变异; 遗传定位
Isolation, Characterization, and Mapping of Genomic Microsatellite Markers
for the First Time in Sea-Island Cotton (Gossypium barbadense)
ZHANG Pei-Pei, WANG Xia-Qing**, YU Yang, YU Yu, LIN Zhong-Xu*, and ZHANG Xian-Long
Department of Plant Science & Technology / National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement and National Centre of Plant Gene Research
(Wuhan), Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
Abstract: Sea-island cotton (G. barbadense) is one of the most important cultivated cotton species in the world. In order to ex-
plore the genetic diversity of this species, microsatellite loci were identified from G. barbadense cv. Pima3-79 (the genetic stan-
dard line). Microsatellite markers were developed using two different approaches: (i) cloning of ISSR amplified fragments and (ii)
amplification using degenerate primers. Two hundred and thirty-nine unique clones were generated from 1447 recombinants, and
214 unique sequences were obtained. Eighty-six primer pairs were developed from 70 sequences that had flanking regions suffi-
cient for primer design. The 86 SSR primer pairs were used to analyze 56 sea-island cotton accessions and 4 upland cotton culti-
vars, 16 primers had no amplification and 43 primers did not detect polymorphism between all the cultivars. Nineteen primers
showed polymorphism between the sea-island cotton accessions. On the basis of Jaccard’s genetic similarity coefficient, these
primers could distinctly distinguish sea-island cotton and upland cotton, and sea-island cotton accessions were separated into four
groups. Nine interspecific polymorphic markers were mapped on the cotton genetic map with four mapped at A sub-genome and
five at D sub-genome. These microsatellite markers will be useful for assessing the genetic diversity patterns within sea-island
cotton as well as aiding in construction of genetic linkage maps.
Keywords: Sea-island cotton; Microsatellites; Genetic variation; Genetic mapping
棉花是最重要的纤维作物之一。目前栽培最广 泛的是陆地棉和海岛棉。陆地棉和海岛棉在产量、
1014 作 物 学 报 第 35卷

纤维质量、抗病性、环境适应性等方面都有很大的
不同[1]。陆地棉育种主要集中在高产和广泛的适应
性上, 而海岛棉则主要侧重纤维品质和抗病性。陆
地棉和海岛棉杂交可育, 但后代常常会出现部分不
育、迟熟及杂交衰退现象[2]。尽管如此, 海岛棉优良
的纤维品质和高抗黄萎病的特性使之成为陆地棉性
状改良的理想供体。
尽管海岛棉有重要的农艺性状, 但海岛棉的研
究却远远落后于陆地棉, 目前的研究仅仅限于遗传
多样性的研究[3-4]。然而, 海岛棉在四倍体棉花种间
连锁图的构建以及 QTL作图中发挥着重要作用[5-11]。
但这些研究中所用的标记来自于除海岛棉以外的其
他棉种。因此, 有必要开发海岛棉自身的标记来进
行其基因组的研究。最近我们从海岛棉 Pima3-79的
cDNA文库中分离了第一批 EST-SSR标记[12]。本研
究中, 我们采用两种方法分离了第一批来自于海岛
棉的基因组微卫星标记并对其进行遗传评价。连锁
分析也将部分标记定位到了四倍体棉花的种间遗传
图谱上。
1 材料与方法
1.1 植物材料与 DNA抽提
本研究中共涉及到56个海岛棉品系 [4]和4个陆
地棉品种(鄂棉22、TM-1、冀棉5号和邯郸208)。每
份材料的基因组总DNA的提取参照Paterson等 [13]的
方法。用来定位新开发引物的群体为棉花种间BC1
作图群体[(鄂棉22 × Pima3-79) ×鄂棉22], 该群体包
含141单株[14]。
1.2 微卫星序列的分离
采用两种方法从海岛棉品种 Pima3-79(包含在
56 个海岛棉品系中)的基因组 DNA 中分离微卫星:
一是克隆 ISSR (inter simple sequence repeat)扩增产
物, 二是克隆简并引物的扩增产物。第一种方法中
使用了 15个 ISSR引物扩增基因组 DNA, 这些引物
是 UBC810-815、UBC818、UBC819-821、UBC868、
(AGA)6、(ACA)6、(AAG)6和(TCA)6。25 μL的 PCR
反应体系包括: 60 ng 基因组 DNA, 0.3 mmol L−1
dNTPs, 1.5 mmol L−1 MgCl2, 0.2 μmol L−1引物, 1×反
应缓冲液和 1.0 U Taq DNA聚合酶(MBI)。PCR程序
为: 94℃预变性 2 min; 94℃变性 1 min、58℃复性
1min、72℃延伸 1 min, 30个循环; 最后 72℃延伸 10
min。
第二种开发 SSR标记的方法是利用两个简并引
物进行 5′-锚定 PCR, 简并引物分别是 PCT4, 序列
为 KKVRVRV(CT)6, 其中 K = G/T、V = G/C/A和 R
= G/A[15]; VJ3(5′-NNNMMHYHYHGGTTGGTTGG
TT-3′), 其中 K = G/T、V = G/C/A和 R = G/A[16]。20
μL 的 PCR 反应体系包含: 60 ng 基因组 DNA, 1.5
mmol L−1 MgCl2, 1×反应缓冲液, 0.4 mmol L−1 dNTPs,
15 pmol简并引物及 1.5 U Taq DNA聚合酶(MBI)。
PCR程序为: 94℃预变性 2 min; 94℃变性 1 min、
58℃复性 1min、72℃延伸 1 min, 35个循环; 最后
72℃延伸 10 min从而在 3′末端产生多个 A以便其与
载体连接。
1.3 质粒分离、测序和引物设计
来自同一引物的扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶
检测是否扩增成功, 然后克隆到 pGEM-T Easy载体
中(Promega, USA)并转化 DH5α细胞。在含有 100 μg
μL−1 氨苄霉素的 LB 培养基上筛选重组克隆。用
M13F/R 引物扩增并用 1.5%的琼脂糖凝胶检测, 挑
取片段大小在 500~1 000 bp 的独立克隆 , 然后用
ABI PRISM 3730 自动测序仪测序。
用 CAP3[17] 进行序列分析, 然后用在线工具
SSR Primer (http://hornbill.cspp.latrobe.edu.au/cgibin-
pub/ssrprimer/indexssr.pl)识别长度大于 10 个碱基的
2~6 bp的重复模体并同时进行引物设计。SSR Primer
整合了 SSR 模体识别软件 SPUTNIK (http://espre-
ssosoftware.com/pages/sputnik.jsp)和 PCR 引物设计
的软件 Primer3[18], 因而可同时进行模体识别与引
物设计。引物设计的主要参数为: 引物长 18~24 bp,
最适为 20 bp; PCR产物大小为 100~300 bp; 最佳退
火温度为 57 ; GC℃ 含量为 35%~60%, 最适为 50%。
用于引物设计的序列同 CMD 网站 (http:/ /www.
cottonmarker.org)上的 SSR 克隆序列进行 Blastn 比
对, 比对标准为 E值>E−20。
1.4 SSRs特异扩增及电泳
SSR特异扩增的反应体系为: 30 ng基因组 DNA,
1×反应缓冲液 , 0.3 μmol L−1 引物 , 0.2 mmol L−1
dNTP 和 0.5 U的 Taq DNA聚合酶(MBI), 反应体系
为 20 μL。扩增反应在伯乐热循环仪上进行, 扩增程
序为 94 ℃ 预变性 3 min; 94℃变性 1 min, 退火 1
min (随引物不同而不同), 72℃延伸 1 min, 34个循环;
72℃延伸 7 min。PCR产物采用 6%的变性聚丙烯酰
胺凝胶分离(1×TBE), 电泳后银染。
1.5 SSRs的评价
用本研究中开发的 SSR引物扩增四倍体棉花来
第 6期 张培培等: 首批海岛棉基因组来源的微卫星标记的分离、评价和定位 1015


检测其在海岛棉和陆地棉种间及陆地棉种内的扩增
效果。有带记为 1, 无带记为 0。用 NTSYS-pc 2.10[19]
的 SIMQUAL程序计算 60个品系的遗传相似系数。
然后, 基于遗传相似系数矩阵依据 UPGMA 算法,
利用NTSYS-pc软件的 SHAN聚类程序生成聚类图。
利用种间 BC1作图群体[(鄂棉 22 × Pima3-79) ×
鄂棉 22]对这些 SSRs进行染色体定位。在群体中表
现多态性的标记首先进行卡方检测来确定其是否符
合孟德尔分离比例。然后 , 利用软件 MapMaker
3.0b[20]将其整合到 BC1遗传连锁图上[14]。计算中用
到 “Group” (LOD = 5, r = 0.4), “Three point”、
“Order”、“Try”、“Map” 和“Ripple”等命令 , 并用
Kosambi 作图函数 [21]将重组频率转换为图距
(cM)[21]。
2 结果与分析
2.1 海岛棉 SSR的开发和引物设计
随机挑取了 1 447 个重组子, 筛选后得到 239
个独立克隆。对于 ISSR 引物, 从(AAG)6 获得的独
立克隆数量最多, (AGA)6、UBC811和(ACA)6次之。
对于简并引物, PCT4和 VJ3分别产生了 32个和 10
个独立克隆。对 239个独立克隆进行测序 , 去除载
体序列后进行去重和拼接。共得到了 214 条独立序
列(GenBank 登录号为 EU532206~EU532419)并用于
SSR的搜索和引物设计(表1)。70条序列的边界序列
可以满足引物设计的要求, 从中共开发了 86对引物
(表 1)。与已公布的 SSR 克隆序列比对后发现 :
HAU136与 BNL2961相同; HAU139 和 HAU140与
NAU3631相同; HAU169与NAU2695相同; HAU181
与 Gh147相同。这些 SSR引物的重复模体类型、上游
和下游引物序列及 GenBank 登录号已经提交到 CMD
网站(http://www. cottonmarker.org/projects/hau)。
2.2 SSR标记的扩增效率
所有 86对 SSR引物都对 60个棉花品系进行扩
增来检测其扩增效率和多态性。在所有材料中, 16
对引物(18.60%)没有扩增, 43对引物(50%)没有检测
到多态性(表 2)。27对引物(31.40%)在种间检测到多
态性, 产生了 42个多态性位点; 19对引物在海岛棉
种内存在多态性, 检测到 25 个多态性位点; 6 对引
物在陆地棉种内检测到 6个多态性位点(表 2)。每对
引物产生的多态性位点为 1~4个, 平均 1.56个位点,
HAU190和 HAU197检测到的多态性位点数最多。

表 1 用于 SSR标记开发的克隆
Table 1 Statistics of clones for SSR marker development
引物
Primer
克隆
Clone
独立克隆
Unique clones
独立序列
Unique sequences
GenBank ID 含 SSR的序列
Sequence with SSRs
UBC811 144 24 20 EU532206–EU532225 6
UBC810 96 12 12 EU532226–EU532237 5
UBC812 96 7 6 EU532238–EU532243 4
UBC814 24 5 4 EU532244–EU532247 3
UBC813 27 6 5 EU532248–EU532252 0
UBC815 19 4 4 EU532253–EU532256 1
UBC819 10 1 1 EU532257 1
UBC821 72 8 7 EU532258–EU532264 1
UBC820 144 13 12 EU532265–EU532276 3
(AGA)6 135 27 22 EU532277–EU532298 5
(ACA)6 134 24 22 EU532299–EU532320 11
UBC868 133 16 15 EU532321–EU532335 5
(AAG)6 131 30 27 EU532336–EU532362 5
(TCA)6 56 11 11 EU532363–EU532373 6
UBC818 60 9 9 EU532374–EU532382 5
PCT4 124 32 28 EU532383–EU532410 9
VJ3 42 10 9 EU532411–EU532419 0
Total 1447 239 214 EU532206–EU532419 70



1016 作 物 学 报 第 35卷

表 2 86对 SSR引物的扩增效率
Table 2 Amplification efficiency of 86 SSR markers
扩增效率
Amplification efficiency
SSR名称
SSR name
没有扩增
No amplification
HAU122, HAU138, HAU141, HAU143, HAU144, HAU145, HAU146, HAU155, HAU163,
HAU166, HAU177, HAU183, HAU186, HAU188, HAU191, HAU194
没有检测到多态性
No polymorphism
HAU123, HAU124, HAU127, HAU128, HAU129, HAU130, HAU131, HAU134, HAU135,
HAU136, HAU140, HAU142, HAU147, HAU148, HAU150, HAU151, HAU152, HAU156,
HAU157, HAU158, HAU159, HAU161, HAU162, HAU165, HAU168, HAU171, HAU172,
HAU173, HAU174, HAU176, HAU178, HAU179, HAU180, HAU181, HAU185, HAU187,
HAU193, HAU196, HAU198, HAU199, HAU202, HAU203, HAU205
在种间检测到多态性
Polymorphic marker
HAU120, HAU121a, HAU125 a, HAU126 a,b, HAU132 a,b, HAU133, HAU137, HAU139, HAU149 a,
HAU153 a, HAU154, HAU160 a, HAU164 a, HAU167 a, HAU169 a, HAU170 a, HAU175, HAU182
a,b, HAU184 a, HAU189 a, HAU190 a,b, HAU192 a, HAU195 a,b, HAU197 a,b, HAU200, HAU201,
HAU204 a
a: 在海岛棉品系内存在多态性; b: 在陆地棉品系内存在多态性。
a: Polymorphism between the sea-island cotton accessions; b: polymorphism between the upland cotton cultivars.

2.3 海岛棉品系的遗传多样性分析
根据 Jaccard遗传相似系数, 60个品系明显地被
划分为两组。第一组包括 4 个陆地棉品种, 第二组
的海岛棉品系被分为四个亚组(图 1)。陆地棉品种和
海岛棉品系之间的相似系数为 0.056~0.419; TM-1和
Xinhai7之间的相似系数最小, Handan208和 Xinhai3
之间的相似系数最大。56个海岛棉品系之间的相似
系数为 0.469~1.000, Hai7124和 Xinhai3之间的相似
系数最小。
2.4 种间多态性 SSR标记的遗传与染色体定位
在种间存在多态性的 27个 SSR标记中, 14个标
记在 BC1作图群体中表现多态性, 产生了 14个多态
性位点。4个位点表现为显性, 其余 10个为共显性;
HAU153 (χ2=6.09)和 HAU137 (χ2=13.21)表现偏分离
(表 3)。
9 个多态性位点定位整合到 BC1连锁图的 7 条
染色体上[14]。其中 4 个位点定位到 A 亚基因组的 2
条染色体上(Chr9和 Chr12), 5个位点定位到 D亚基
因组的 5 条染色体上(Chr14, Chr16, Chr18, Chr19,
Chr23)(表 3和图 2)。
3 讨论
简单重复序列(SSR)或微卫星作为遗传标记具
有数量大、多态性高、可重复性好、分布于整个基
因组以及共显性遗传的特点。这些特点使其成为理
想的遗传标记并广泛应用于遗传分析中。到目前为
止, 棉花中已经开发了 8 915对 SSR标记(http://www.
cottonmarker.org/Primer.shtml)并广泛应用于遗传作
图、QTL定位、基因组分析等研究中。然而, 这些
表 3 多态性位点的特征
Table 3 Characteristics of polymorphic loci
引物
Primer
遗传模式
Genetic model
χ2 染色体
Chromosome
HAU120 Dominant 0.73 18
HAU133 Codominant 0.36 14
HAU137 Dominant 13.21 16
HAU139 Codominant 1.82 19
HAU153 Dominant 6.09 12
HAU154 Dominant 1.21 12
HAU164 Codominant 1.21 Unlinked
HAU167 Codominant 0.01 23
HAU184 Codominant 2.33 Unlinked
HAU190 Codominant 0.35 Unlinked
HAU195 Codominant 0.03 9
HAU197 Codominant 0.03 9
HAU200 Codominant 0.00 Unlinked
HAU201 Codominant 1.41 Unlinked

SSR标记大多数来源于陆地棉[22-27]、亚洲棉[28-29]和
雷蒙德式棉[30]。只有 119对 SSR标记是来自海岛棉
的, 这些标记是我们实验室从海岛棉 Pima3-79的发
育纤维 ESTs中开发的[12]。本研究中, 第一批来自于
海岛棉基因组的 SSR 标记被分离出来, 这将有益于
棉花数据库的完善和棉花的遗传研究。
棉花微卫星标记的开发目前主要采用两种策略:
一是从富含微卫星序列的文库或 BAC 末端序列中
分离; 另一种是从棉花的 EST序列中分离, 即 EST-
SSR(http://www.cottonmarker.org/projects)。对于第一
种方法 , 它比较繁琐且昂贵 , 但得到的 SSR 标
图1 基于Jaccard相似系数的4个陆地棉品种和56个海岛棉品系的UPGMA聚类图
Fig. 1 UPGMA dendrogram of 4 upland cotton cultivars and 56 sea-island cotton accessions based on the Jaccard’s similarity coefficient
1018 作 物 学 报 第 35卷


图 2 9个多态性位点在种间 BC1连锁图上的分布
Fig. 2 Distribution of nine polymorphic loci on the interspecific BC1 genetic linkage map
来自海岛棉的 HAU基因组 SSR用粗体和斜体表示。
The HAU genomic SSR markers from G. barbadense are in bold and italic.

第 6期 张培培等: 首批海岛棉基因组来源的微卫星标记的分离、评价和定位 1019


记在遗传定位中多态性高。第二种分离 SSR标记的
方法较为简单、高效, 而且成本低。目前一半以上
的棉花 SSRs 都是采用此方法分离出来 (HAU、
MGHES、MUSS/MUCS、NAU和 STV系列的 SSR,
http://www.cottonmarker.org/projects)。相对于基因组
SSRs, EST-SSRs的多态性低[31]。但其在相关物种的
可转移性高, 并且更容易与基因表达和基因功能关
联, 这些特点使得通过数据挖掘开发 SSR 标记的方
法成为很多作物的首选方法。然而, 迄今为止来自
海岛棉的 ESTs仅有 1 023条, 这就限制了海岛棉微
卫星标记的开发。
与基于文库的微卫星标记开发的方法相比, 从
ISSR 和简并引物的扩增片段中分离微卫星标记的
方法比较简便、快捷。利用基于文库的微卫星标记
的开发方法, Reddy等[22]从 526个单一序列中开发了
309对 SSR引物, 比例为 58.7%; Nguyen等[23]从 644
个单一序列中设计了 392 对 SSR 引物 , 比例为
60.9%; Hoffman等[27]从 3 629个序列中开发了 1 059
对引物, 比例为 29.2%。本研究中, 利用 ISSR 和简
并引物法我们从 214 个单序列中开发了 86 对引物,
比例为 40.2%。
本研究开发的基因组 SSR能明显地区分陆地棉
和海岛棉。此外, 这些标记也能区分一些海岛棉品
系, 说明这些基因组 SSR 能用于海岛棉遗传多样性
和群体结构研究。9 个多态性的 SSR 标记被定位到
种间 BC1连锁图上中。这些来自于海岛棉基因组的
SSR 丰富了棉花微卫星标记数据库和四倍体棉花的
遗传图谱, 也将有助于数量性状分析、比较基因组
学和棉花育种的研究。
4 结论
通过克隆 ISSR和简并引物的扩增产物, 从海岛
棉品种 Pima3-79中开发了 86个微卫星标记。27个
SSRs在海岛棉和陆地棉品系之间中表现多态性, 并
能明显地区分它们。19对引物在海岛棉品系中显示
出多态性。9 对种间多态性标记被定位到棉花遗传
图谱上, 其中 4对被定位到 A亚基因组上, 5对被定
位到 D亚基因组上。这些微卫星标记将有助于海岛
棉的遗传多样性研究和遗传连锁图的构建。
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